组织培养的步骤

1、组织培养的步骤一、Ms培养基配制1.各种母液的配置（1）配制MS大量元素母液一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。分别称取NH4NO3 165gKH2PO4 17gKNO3 190gCaCl22H2O 44gMgSO47H2O 37g各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。（2） 配制MS微量元素母液一般将微量元素配制成100倍母液。依次称取KI 0.083gNa2MoO42H2O 0.025gH3BO3 0.62gCuSO45H2O 0.0025gMnSO4H2O 1.69g 或 MnSO44H2O 2.23gCoCl26H2O 0.0025gZnSO

2、47H2O 0.86g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。CuSO4.5H2O和CoCl26H2O由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先 配成调整液。分别称取CuSO45H2O 0.05gCoCl26H2O 0.05g各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。（3） 配制MS有机母液一般配制成100倍MS有机母液。依次称取肌醇10g盐酸硫胺素（VB1）0.01g烟酸0.05g甘氨酸0.2g盐酸毗哆醇（VB6）0.05g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。（4） 配制MS铁盐母液一般配制成100倍MS铁盐母液。依次称取EDTA 二钠 3.

3、73gFeSO47H2O 2.78g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液， 共8种母液。（5）激素母液的配制各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素 类一般要先用少量95%的酒精或0.1ml/L的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用0.1ml/L的 盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。2、配制培养基以配置1L MS培养基为例，按顺序进行如下操作：（1）先在烧杯中放入一些蒸馏水。（2）分别取上面八种母液10ml倒入。（3）一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。（4）加

4、蒸馏水用量筒定溶至1L。（5）按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至 关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差。（6）用精密试纸或酸度计调整PH至5.7-5.8。（有条件的话使用酸度计，比较精确）可配0.1ml/L的HCL和0.1ml/L的NaOH用来调溶液PH值。0.1ml/LHCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。 0.1ml/LNaOH配制：称取NaOH 4g配成100ml溶液。（7）称取610g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉），倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热 至沸腾，直到琼脂粉熔化。（8）稍微冷却后，分装入培养容器中。无

5、盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮 筋或绳子扎紧。（9）放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1-0.15MPa，20分钟。（10）灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。二、接种2.1成熟种子的表面消毒选取成熟饱满、颜色和大小相对一致的成熟小麦，用70%（v/v）酒精浸泡5 min，无菌 水冲洗23次，再经0.1%的升汞（HgCl2）浸泡20 min，无菌水冲洗68次后，置于无 菌保湿滤

6、纸上，33r黑暗条件下预培养2 h。2.2成熟胚愈伤组织的诱导和继代待种子露白，用解剖刀在胚上纵切一刀，横切两刀，腹沟向下接种在诱愈培养液浸润的 滤纸上，（261）C暗培养8 d。挑选胚性愈伤组织，每23周继代一次。2.3胚性愈伤组织的分化再生选取胚性愈伤组织转入分化培养基，（261）C暗培养10 d后，转入同温条件下光培养， 光照强度为40 gmol/（m2-s），光照时间16h/d。经过40 d的分化培养（每10天更换1次 新鲜培养基），形成绿芽原基和绿芽。待分化出的绿芽长至23cm时，切取绿芽转至生根培 养基，使之生根。2.4再生植株的春化及移栽具有正常根系的再生植株长至68 cm时，4

7、C冰箱春化68 w （16 h光周期，光照强 度为40 pmol/（m2s），然后敞开培养瓶瓶口，温室中炼苗1 w，移栽入温室花盆中（262）C， 16 h光周期，光照强度为80 gmol/（m2-s），生长至成熟。三无菌操作（1）在接种4小时前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外线灯进行杀菌；（2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；（3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；4）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面；5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端 处，对培养皿要过火烤干；（6）接种

8、时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大 强度灭菌一次。无菌接种步骤：（1）将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗， 最后沥去水分，取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。（2）材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切 成0.5cm平方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小 等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。（3）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程（以试 管为例）是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管口靠近酒精灯火焰，并将管口在 火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞， 再烧管口里面。然后