真菌学实验报告

1、真菌学实验报告一.实验目的：1.1 了解真菌形态的基本特征。1.2掌握丝状真菌制片方法。1.3掌握内生真菌的分离方法1.4掌握真菌的鉴定方法。二前言：真菌广泛分布于地球表面，从高山、湖泊到田野、森林，从 海洋、高空到赤道、两极，到处都有真菌。真菌虽然不在空气中生长 繁殖，但它的孢子却成群的漂浮在天空，只要稍微注意你会发现人类 原来生活在真菌的汪洋大海中。当今世界，生物技术已迈入世界经济的支柱产业，真菌学 在生物技术的大潮中得到了长足的发展。真菌是原始的真核生物，具 有广泛的多样性，真菌生长我繁殖迅速，在很短的时间内就可以得到 比动物和植物多得多的后代，能够直接、快速地进行遗传性状分离的 分析。

2、因此，真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具， 真菌基因的多样性以及真菌分子生物学的发展，为生物技术产业提供 了一个广阔的天地。植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，植物物 种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富：抗病原性能越强 的植物，其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的 内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性 物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和 G+、G-细菌的抑制实验发现茎，根，花，种子或果实内生真菌的代谢 产物具有不同程度的抑菌能力，并且对G+、G-有普片遍的抑菌作用。 研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性

3、物质具有广泛的应用前景。材料与方法：3.1.1材料：在校园内采集银杏、喜树、桂花树样品包括叶、茎、 根、花、种子或果实。3.1.2.药品与试剂：葡萄糖、蛋白月东、KH2P043H2O、MgSO4 - 7H2O，马铃 薯、琼脂。孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏， 蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。消毒剂：75%的乙醇， 0.1%升汞（HgCl2），次氯酸钠溶液（含活性氯10%），30%双氧水。双 蒸水、琼脂糖，Tris饱和酚、巯基乙醇（8 - Mercaptoethanol）,石 英砂，Tris饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯 化钠，盐酸，氢氧化钠，EDTA

4、，CTAB。3.1.3.培养基：3.1.3.1马铃薯、葡萄糖琼脂培养基马铃薯汁1000ml，葡萄糖20g，琼脂20g（注：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮 沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡 萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，15磅灭菌30分钟3.1.3.2察氏琼脂培养基蔗糖 30g，NaNO 3g，MgSO .7H O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO .7H O342420.01g，K2HPO4 1g，琼脂 13g，蒸馏水 1000ml，自然 pH3.1.3.3沙氏培养基蛋白胨1g，葡萄糖或麦芽糖4 g，琼脂1.5克，水100 ml。制法：1将

5、上述物质称好，放入水中煮沸溶解（不必调PH 即有5左右）分中号试管（约4毫升）包扎，高压115C20分钟。趁 热斜好，凝固备用。3.1.3.4马丁氏培养基葡萄糖 10g，蛋白胨 5g, KH2PO4 1g, MgSO4 7H2O 0.5g, 1% 孟加拉红3.3mL，琼脂20g, 水1000mL, pH值自然。抗生素用法与用量：培养基灭菌之后分装前按链霉素 40U/mL，青霉素30U/mL用量加入，冷却到45C左右未凝固时加入抗 生素，混匀倒平板。方法：4.1.1采样方法：在校园内找到银杏、喜树、桂花树并用刀采集叶、茎、 根、皮、种子。4.1.2样品前处理：分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自

6、来水下洗净。老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于 酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1X1cm2大小置于PDA固体培养 基上。对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒：75%的酒精漂（浸）洗2-3min无菌水冲洗4-6次一0.1%升汞不同的 消毒时间（见表2-2,共设置7个梯度）一无菌水冲洗4-6次一用灭 菌滤纸吸干多余水分一无菌刀片将材料切成小块将根、茎的表皮、韧 皮部、木质部大致分开，并切成0.5X0.5cm2大小。将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶 液充分接触，

7、驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前1-2分钟，开 始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立 即倒入无菌水，轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无 菌水时为止。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液，切勿勉强 在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。4.1.3内生菌的分离方法：将上述组织块置于分离培养基上（每一平皿培养 5块组织块）于27C恒温培养，同时将上述消毒过程中最后一次冲洗 组织块后的无菌水滴在培养基上平行培养，用以检测消毒是否彻底。 观察菌丝生长情况及污染情况。4.1.4纯化方法：培养3-4天后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形 态不同的菌丝或菌落移种到新鲜P

8、DA培养基上。纯化3-4次以保证所 得菌落为纯培养。4.2形态鉴定方法：4.2.1培养方法：4.2.1.1培养基：查氏培养基、沙氏培养基和PDA培养基。4.2.1.2将4C保存菌种活化2次；4.2.1.3将活化菌种分别点种PDA、沙氏、察氏平板，每重复 4.2.1.425C恒温培养箱培养7天；4.2.1.5然后进行菌落特征描述，取一个平行进行制片（胶带 子粘片法），观察个体形态；4.2.1.6另两个平行继续培养至14天，取出;4.2.1.7重复步骤4,作为最终描述结果；4.2.1.8根据真菌分类鉴定手册和相关资料分析确该菌的归属。4.2.2制片方法:胶带粘贴法：选用在显微镜油镜下观察细致不粗糙

9、且粘性好的胶带。取一小段胶带从菌落表面的中心向边缘粘，75%乙醇固定，乳酸石炭酸棉蓝染色液染色，将粘有菌丝的一面向上，盖上盖玻片，于 显微镜下观察产孢结构等特征。4.2.3鉴定标准:观察的要点:4.2.4菌落宏观形态:大小：以菌落的直径（mm）表示。颜色：包括菌落表面和背面的颜色，及色素是否渗入培养基。菌落表面的纹饰：如皱纹、辐射沟纹、同心环、整个菌落致密或 疏松等。菌落的质地：毡状、毯状、绒毛状、棉絮状、粉粒状、革质状、 有无成束状或绳状的气生菌丝。菌落的高度：扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分状况等。菌落边缘：全缘、锯齿状、树枝状等。渗出物：菌落表面有无液滴及液滴的颜色等。4.2.5个体形态

10、：菌丝的特征：表面性状（粗糙或光滑），宽度等分生孢子梗：分支情况一简单或复杂，轮生或单生等；长短；基 部粗糙或光滑等。产孢结构的形态特征：形状，大小，着生状况（位置，单生、互 生或成轮生体）分生孢子的形态：形状，大小，表面状况，聚集方式（直链、斜 链或聚集成头）4.3分子生物学鉴定：4.3.1培养方法：培养基成分与不加琼脂的PDA固体培养基成分相同。将液体 培养基以100mL每瓶分装至250mL三角瓶中，用8层纱布封口。121C， 蒸汽灭菌20min。将菌丝致密的真菌接种到液体培养基中，于恒温振荡培养箱中27C、 120rpm培养5-7天。用两层灭菌纱布过滤菌丝球，用无菌蒸馏水冲洗菌丝球5 次

11、，避免培养基中的糖类和蛋白对DNA提取的影响。40C下烘干菌丝，但是不 要过于干燥，然后进行DNA的提取。4.3.2基因组DNA的提取DNA 提取采用 CTAB 法。CTAB （cetyltriethylammonium bromide，十六烷基三乙基漠化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜， 它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的，当降低溶液盐浓度 到一定程度时，从溶液中沉淀，通过离心可将CTAB与核酸的复合物 同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解 于高盐溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。CTAB法的 好处是能很好地去掉糖类杂质，提取前期可得到高含量的D

12、NA。4.3.2.1用CTAB法提取材料DNA的具体步骤如下：将CTAB buffer在65C水浴锅中预热，研钵用液氮预冷；4.3.2.2取0.1g左右菌丝体，在液氮中迅速研磨成粉末后，迅速加入5mL预热的提取液及10p Lp -巯基乙醇，混合均匀后把混合液转 入1.5mL离心管中700p L/管；4.3.2.3于65C水浴保温0.5-1h，时间不能超过1.5h。保温期间要 轻轻振摇几次；4.3.2.4冷却至室温后，加入等体积（700p L）的饱和酚：氯仿：异戊 醇（25： 24： 1），充分混匀后静置10min。4.3.2.5离心（12000rpm，10min，室温），去沉淀，将上清液转入干

13、 净离心管中。4.3.2.6根据杂质的去除情况重复步骤4、5数次，直至无杂质；4.3.2.7加入等体积氯仿：异戊醇（24： 1）抽提一次以去除饱和酚，离心（12000rpm，10min，室温）；4.3.2.8将上清液逐滴加入两倍体积的-20C预冷无水乙醇，以沉淀 出DNA。室温放置10-20min，可以过夜；4.3.2.9挑取或离心去上清液（10000 rpm，5min）的方法取出DNA； 用75%乙醇洗涤两次； 37C保温箱中干燥后溶于适量的TE缓冲液中4C备用。4.4所用引物ITS5： GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGITS4： TCCTCCGCTTATTGATATGC4.4.

14、1PCR反应条件:4.4.1.1体系：PCR反应体系为50口 L体系，包括:10XPCR buffer：1/10MgCl2:1.5mM,dNTPs (dATP、dTTP、 dCTP、dGTP)：各 200口 M,Primer10.2口 M,Primer20.2|J M,Taq 酶：12.5U,DNA模板：约 100ng。4.4.2条件：扩增条件预变性95 C5min变性95 C1min复性51C1min3035个循环延伸72 C1min延伸补齐72 C10min4.4.3测序方法：送测序公司。4.4.4序例分析：结果及分析:结果：试验分离到两种真菌5.1八爪金盘分离到菌种查氏正反照5.1.1菌

15、落宏观形态:大小：菌落的直径3.2 (mm)。颜色：包括菌落表面棕黑色背面灰色，色素渗入培养基。菌落表面的纹饰：如皱纹、整个菌落致密。菌落的质地：毡状菌落的高度：凸起或隆起。菌落边缘：锯齿状。渗出物：菌落表面无液滴。5.1.2个体形态:菌丝的特征：表面粗糙。分生孢子梗：分支复杂，轮生。5.1.3分子生物学鉴定通过PCR扩增和序列分析，送公司检测得到的序列为：TGAAGTTAAAAAGCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACAAGTGACCCCGGTCTAACCACCGGGATGTTCATAACCCTTTGTTGTCCGACTCTGTTGCCTCCG

16、GGGCGACCCTGCCTTCGGGCGGGGGCTCCGGGTGGACACTTCAAACTCTTGCGTAACTTTGCAGTCTGAGTAAACTTAATTAATAAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCACTCAAGCCTCGCTTGGTATTGGGCATCGCGGTCCGCCGCGTGCCTCA

17、AATCGACCGGCTGGGTCTTCTGTCCCCTAAGCGTTGTGGAAACTATTCGCTAAAGGGTGTTCGGGAGGCTACGCCGTAAAACAACCCCATTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAATCGGAGGAA通过blast序列分析得到的结果为：Distribution of 100 Blast Hits on the Query SequenceColor key for alignment scoresSequences producing significant alignmentsDe

18、scriptionMax scoreTotalscoreQuery coverE valueMax identAccession厂 Uncultured funaus clone L046937-122-075-C01-unis 18S ribosomal RNA aene. partial seauence: internal transcribed spacer 1. 5.8S ribosomal RNAqi1035103598%0.099%JF289117.1厂 Uncultured funaus clone L042883-122-063-B08 internal transcribe

19、d spacer 1. partial sequence: 5.8S ribosomal RNA aene. comolete sequence: and in1035103598%0.099%GQ999474.1I- CladosDorium sd. SS-S12 18S ribosomal RNA aene. oartial seauence: internal transcribed spacer 1. 5.8S ribosomal RNA aene. and internal transcribe1035103598%0.099%GU797141.1I- CladosDorium te

20、nuissimum 18S rRNA aene (oartial). 5.8S rRNA aene. 28S rRNA aene (oartiall internal transcribed spacer 1CITS1) and internal transcr1035103598%0.099%2300331.1厂 Uncultured soil funaus clone BL82 18S ribosomal RNA aene. oartial seauence: internal transcribed spacer 1. 5.8S ribosomal RNA aene. and inter

21、nal tr；1033103398%0.099%JQ666401.1I Uncultured funaus clone f2Fc9418S ribosomal RNA aene. oartial seauence: internal transcribed scacer 1. 5.8S ribosomal RNA aene. and internal tram1033103398%0.099%GU721671.1I Uncultured funaus clone fTHOc54 18S ribosomal RNA aene. oartial seauence: internal transcr

22、ibed soacer 1. 5.8S ribosomal RNA aene. and internal tra1033103398%0.099%GU721636.1I Uncultured funaus clone fTHOc06 18S ribosomal RNA aene. oartial seauence: internal transcribed scacer 1. 5.8S ribosomal RNA aene. and internal tra1033103398%0.099%GU721633.1I Uncultured funaus clone fTH0c31 18S ribo

23、somal RNA aene. oartial seauence: internal transcribed scacer 1. 5.8S ribosomal RNA aene. and internal tra1033103398%0.099%GU721631.1I Uncultured funaus clone fTHITc341 18S ribosomal RNA aene. oartial seauence: internal transcribed soacer 1. 5.8S ribosomal RNA aene. and internal ti1033103398%0.099%G

24、U721540.1F Uncultured funaus clone fTHITc24118S ribosomal RNA aene. oartial seauence: internal transcribed soacer 1.5.8S ribosomal RNA aene. and internal ti1033103398%0.099%GU721527.1I- Uncultured funaus clone fTHITc4118S ribosomal RNA aene. oartial seauence: internal transcribed scacer 1.5.8S ribos

25、omal RNA aene. and internal trs1033103398%0.099%GU721513.1F Uncultured funaus clone f2FcO518S ribosomal RNA aene. oartial seauence: internal transcribed soacer 1. 5.8S ribosomal RNA aene. and internal tram1033103398%0.099%GU721340.1I- Uncultured funaus clone TSPF 46 18S ribosomal RNA aene. oartial s

26、eauence: internal transcribed soacer 1. 5.8S ribosomal RNA aene. and internal tr1033103398%0.099%FJ213542.1I- Uncultured funaus clone ITS-118 HR 18S ribosomal RNA aene. oartial seauence: internal transcribed soacer 1.5.8S ribosomal RNA aene. and internal1033103398%0.099%EU718665.1Uncultured soil fun

27、aus clone BL90 18S ribosomal RNA aene. oartial seauence: internal transcribed soacer 1. 5.8S ribosomal RNA aene. and internal tr：1031103198%0.099%JQ666409.1Uncultured fungus clone L046937-122-075-C01 -unis 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA ge

28、ne, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequenceGen Bank: JF289117.1FASTA Graphics PcmS itLOCUSJF289117DNAlinear ENV 02-NOV-2011DEFINITIONUncultured fungus clone genef partial sequence;genef andribosomal RNA602 bp L046937-122-075-C01-unis 18S rib

29、osomal RNA internal transcribed spacer 1, 5.8S internal transcribed spacer 2f complereACCESSIONsequence; and 28S ribosomal RNA gener partial sequence.JF289117VERSIONJF289117.1GI:354720374KEYWORDSSOURCEENV.unculturedORGANISMunculturedfwagusfungusREFERENCEAUTHORSTITLEJOURNALREFERENCEAUTHORSTITLEEukary

30、ota; Fungi; enviromuental samples.(bases 1 to 602Frohlich-Nowoiskyr J.f Burrowsr S.M.f Xief Z.f Englingr G.f Solomon P.A.f Fraser,M.P.f Mayo1-BracerorO.L.r Artaxo P.f Begerow D.f Conrad,R.f Andreae,M.O.f Despres,V.R. and PoschlU. Biogegraphy in the air: fungal diversity over land and oceans Biogeosci. Discuss. 8, 7071-7096 (2011(bases 1 to 602)Frohlich-Nowoisky,J.f Despres,V.R. and PoschlU. Direct SubmissionJOURNAL Siiibiiiiitted (01-FEB-2011) BiogeochencJ-stry, Max Planck Institute forClieiio.5t：ryf Joh. - jQac.hiini-Eec.her-Weg 27 f Mainz 55128 f Germaii