体内药物分析课件

1、第五章 体内药物分析第1页，共60页。生物样品特点1、被测定的药物和代谢物的浓度低；2、样品大多需要分离和净化；3、样品量少，连续测定时，很难再度获得完全相同的样品。4、工作量较大，5、要求很快地提供结果(毒物检测)第2页，共60页。样品制备：去除蛋白质、缀合物水解、化学衍生化、分离浓集（液液萃取、固相萃取等）；样品测定：光谱分析法、色谱分析法、免疫分析法、生物学方法方法验证：特异性、标准曲线和定量范围、定量下限、精密度与准确度、稳定性、提取回收率体内药物分析：第3页，共60页。第一节、常用体内样品的制备与贮藏一、体内样品的种类、采集与制备（一）血样：血浆、血清血浆：选用最多。因血浆中的药浓可

2、反映药物在体内的状况。而且血浆中药物浓度的数据报道较多，可供借鉴。血浆是全血在加肝素、枸橼酸、草酸盐等抗凝剂的全血经离心后分取，量约为全血的一半。第4页，共60页。血浆的制备：采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，混合后，以25003000r/min离心510min使与血球分离，所得淡黄色上清液即为血浆。 抗凝剂最常用的是肝素（heparin），肝素是体内正常成分，因此不会改变血样的化学组成或引起药物的变化，一般不会干扰药物的测定。通常1ml血液需用肝素0.10.2mg或20IU(1mg126IU)。可不必准确控制 其它抗凝剂EDTA、枸橼酸盐、草酸盐等，是与血液中的钙离子结合的试剂，它们可能引

3、起被测组分发生变化或干扰某些药物的测定，不常使用。第5页，共60页。血清的制备：采集的静脉血液置试管中，于37或室温放置30min1h。血液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上的血饼，再在25003000 r/min离心510min，上层淡黄色液体即为血清。 现文献所指血药浓度为血浆或血清中药物总浓度（游离的和血浆蛋白结合的总浓度）。第6页，共60页。血浆与血清的区别 血清比血浆只是少一种纤维蛋白原 一般血浆中药物浓度与血清中药物浓度相当血浆比血清的分离快，而且制取量约为全血的50%60%（血清为全血的50%左右），多数用血浆进行分析。若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血

4、清样品 。第7页，共60页。（二）尿样：尿样测定主要用于药物剂量回收研究、药物肾清除率和生物利用度等研究，以及测定代谢物类型等。体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物形式排出。尿样常需加入防腐剂。 第8页，共60页。 成人一日排尿量为15L。尿样包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。因尿液浓度变化较大，所以应测定一定时间内排入尿中的药物总量。一般采集时间尿（规定时间内采集尿液体积和排入尿中的药物总量）。 尿液中药物浓度的改变不能直接反映血药浓度，即与血药浓度相关性较差、尿液量较大不易保存等。第9页，共60页。（三）、唾液： 唾液中的药物浓度通常与血浆

5、浓度相关。样品易得，取样无损害，尤易为儿童接收。有些可从药物唾液浓度推定血浆中游离药物浓度。 唾液由腮腺、颌下腺和舌下腺三个主要的唾液腺分泌汇集而成前两者分泌量占总量90%。两者中浓度大致相当。 取样：在潄口后15min，安静状态下采集口腔内然流出的唾液；也可在刺激下快速采样(需注意干扰) 。如口嚼石腊片或将柠檬酸、维生素C等置于舌尖，弃去初始部分后采集。刺激后采集的为混合唾液。第10页，共60页。药物在脏器组织中的分布情况，常用胃、肝、肾、肺、心等。制备：测定之前一般需制成匀浆组织样品的处理：沉淀蛋白法、酸水解法、酶水解法 （蛋白水解酶） （四）组织：第11页，共60页。（五）头发：应用 体

6、内微量元素含量测定 用药史的估计 临床用药和药物非法滥用的区别 毒性药物检测第12页，共60页。头发样品的采集：采集枕部发样(带根部），微量元素在前额部位的头发中含量最低，枕部含量最高。头发样品的洗涤：除去外源性污染物，推荐使用丙酮-水-丙酮；丙酮浸泡搅拌10min，自来水漂洗3次，再用丙酮浸泡搅拌，自来水、蒸馏水各洗3次。头发样品的处理：直接甲醇提取、酸水解、碱水解、酶水解（葡萄糖醛酸酶） 第13页，共60页。三、体内样品的贮存与处理第14页，共60页。分析方法与样品处理步骤的选择第二节、体内样品的的前处理第15页，共60页。一、体内样品预处理的目的 1、使药物从缀合物及结合物中释放出来，以

7、测定药物的总浓度。 2、介质复杂，干扰物多，待测物浓度低，须分离干扰物质、富集待测药毒物 3、为了适应和符合测定方法所要求的灵敏度 4、为了防止分析仪器的污染、劣化，提高检测准确度、精密度和选择性等。 第16页，共60页。二、常用体内样品预处理方法要考虑：药物的理化性质（极性、酸碱性、光谱特性、挥发性、稳定性），药物测定的目的，选用的生物体液和组织的类型，待测物的浓度范围，样品制备与分析技术的关系。第17页，共60页。（一）、去除蛋白质 是测定血浆、血清、全血及组织匀浆等样品中药物时的最先处理步骤。1、加入可与水混溶的有机溶剂（体积比、pH值） 破坏蛋白质分子内及分子间的氢键。常加入乙腈、甲醇

8、、乙醇等，能使与蛋白结合状态的药物释放，将混合物超速离心，取上清液作为样品。第18页，共60页。2、加入中性盐 使蛋白脱水而沉淀，硫酸铵最常用3、加入强酸 与蛋白形成沉淀，阴离子型沉淀剂。如三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸等，在酸性下分解的药物不宜用本法去蛋白。4、热凝固法 加热至90蛋白热变性后离心或过滤除去第19页，共60页。第20页，共60页。 （二）分离、纯化与浓集 当药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不够高时，生物样品需分离、纯化与浓集。第21页，共60页。1、液相萃取法溶剂选择合适的溶剂是成功的主要条件 了解药物与溶剂的化学结构及其性质 对药物未电离分子可溶，对电离形式分子不溶 沸点低

9、、易挥发，毒性小与水不相混溶 不影响紫外检测 具有较高的化学稳定性和惰性 不易乳化第22页，共60页。23化合物名称极性粘度沸点吸收波长Hexane(正己烷)0.060.3369210Cyclohexane(环己烷)0.1181210Toluene(甲苯)2.40.59111285Ethyl ether(乙醚)2.90.2335220Methylene chloride(二氯甲烷)3.40.4440245Ethyl acetate（乙酸乙酯）4.30 0.4577260Chloroform(氯仿) 4.40.5761245第23页，共60页。提取溶剂：极性相似相溶溶剂的用量：一般有机相与水相之

10、比为1：15：1溶液的pH调节：最佳pH选择主要与药物的pKa值有关。酸性药物pH应低于药物pKa值12个单位；碱性药物：pH应高于药物pKa值12个单位。提取：进行一次（至多二次）提取，浓集：常用吹氮气使溶剂挥散，或减压蒸发（注意暴沸）。 第24页，共60页。生物样品宜在碱性或近中性提取，生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易被萃取出来。空白血清在pH2、pH7和pH13三种缓冲液中用乙醚提取，提取液HPLC(220nm)测定，在pH13下提取液中杂质峰最少。第25页，共60页。液液萃取特点：优点：可将大部分内源性杂质去除；经济实用、可使样品富集、可一次进行多个样品萃取 缺点：乳化、污染

11、环境、 乳化的去除：加少量固体氯化钠到水相中可减轻乳化；轻微乳化离心；严重乳化低温冰箱快速冷冻破坏乳化层后融化离心。第26页，共60页。2、固相萃取法： 以固相分离方法进行样品预处理，从水相中分离出所需测定的组份，通常以柱分离方式进行操作，故有时这种方法又称为固相提取 活化上样淋洗洗脱 洗脱液浓集第27页，共60页。第28页，共60页。固相萃取的模式及原理反相固相萃取正相固相萃取离子交换固相萃取 阴离子交换 阳离子交换第29页，共60页。实验步骤 第一步：用甲醇润湿小柱，活化填料 第二步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱 除去大部分甲醇 第三步：加样，使样品经过小柱，弃去废液 第四步：用水或适当的缓

12、冲液冲洗小柱，去除内源性杂质 第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干溶剂，备用或直接进行在线分析 血浆样品可直接上柱，样品量0.12ml，流速12ml/min第30页，共60页。31本法特点：少溶剂、少污染、减少液液萃取的乳化。适合各种液体检材如血、尿、洗胃液、现场水、饮料等，对于肝、肾、胃以及其他固体检材，均需制成水液方可进行固相萃取。 第31页，共60页。 柱切换高效液相色谱技术是指由阀来改变流动相走向与流动相系统，从而使洗脱液在一特定时间内从预处理柱进入分析柱的技术。 用两个或两个以上柱子连接构成色谱网络系统，使不同柱子达到不同分离目标，柱子间用切换阀联结，这就是柱切换

13、技术。基本原理是首先在预柱上实现生物体液中干扰大分子与待测药物的分离，然后用柱切换将待测药物从预柱转移至分析柱上完成色谱分析。 自动化固相萃取-柱切换高效液相色谱法 第32页，共60页。第33页，共60页。3. 超滤法膜分离技术，可用于测定生物样品中游离药物浓度按照分子截留量的大小，可分离301000kD的可溶性生物大分子物质。可加压过滤或高速离心。第34页，共60页。（三）、辍合物的水解：酸水解法：强酸、加热酶解：常用葡萄糖醛酸酶，一般控制pH4.55.5 ，37孵育数小时。溶剂解：第35页，共60页。（四）、化学衍生化1、使药物变成能被分析的性质2、提高检测灵敏度3、增强药物稳定性4、提高

14、对光学异构体分离的能力气相色谱衍生化液相色谱衍生化第36页，共60页。衍生化方法：柱前衍生， 柱后衍生气相色谱衍生化方法：硅烷化、酰化、烷基化、不对称衍生化液相色谱衍生化方法：紫外衍生化、荧光衍生化、电化学衍生化、手性衍生化 第37页，共60页。第三节、体内样品分析方法与方法验证一、分析方法的建立（一）、分析方法的选择1、色谱分析法2、免疫分析法3、生物学方法第38页，共60页。 常用分析方法的特点分析方法检测限度/10-8g/ml特异性/分离能力紫外分光光度法（UV）100荧光分光光度法（Fluor）0.1+原子吸收光度法（AA）0.1+ 气相色谱法（GC） 氢火焰离子化检测器（FID）11

15、0+ 氮磷检测器（N-PD）0.10.01+ 电子捕获检测器（ECD）0.01+ 质谱检测（MS）0.001+高效液相色谱法（HPLC） 紫外检测器（UV）10+ 荧光检测器（Fluor）0.1+ 电化学检测器（ECD）0.010.001+ 质谱检测+免疫法（RIA） 酶免疫法（EIA）0.001+ 0.001+放射免疫0.001第39页，共60页。（二）、分析方法建立的一般程序1、色谱条件的筛选：确定最佳分析检测条件；色谱柱(型号、牌号、填料性质、柱长度)；流动相组分及配比、流速、柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等；使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ)；良好的色谱参数(n、R、T)和

16、适当的保留时间(tR)。第40页，共60页。2、色谱条件的优化：在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下： 空白溶剂试验 溶剂(方法特异性) 空白生物基质试验 内源性物质干扰(方法特异性) 模拟生物样品试验 方法验证（效能指标） 3、实际生物样品测试第41页，共60页。二、分析方法的验证1特异性避免干扰2标准曲线与线性范围3定量限灵敏度4精密度与准确度结果可重现5样品稳定性 6提取回收率7分析过程的质量控制 准确度精密度专属性检测限定量限线性范围耐用性体外药物分析第42页，共60页。（一）、方法特异性(专属性或选择性)方法的特异性(specifi

17、city)又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力专属性表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的选择性系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区分(分离)的能力第43页，共60页。考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点：1. 内源性物质的干扰比较待测药物或其活性代谢产物检测信号；2. 代谢产物的干扰比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号；3. 伍用药物的干扰还要考虑患者可能同时服用药物(通常为数有限)的干扰。提供三张色谱图，空白生物样品图、空白加对照、实际生物样品图；4.与参比方法的相关性

18、第44页，共60页。（二）、标准曲线与线性范围标准曲线（standard curve）生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式，最小二乘法或加权最小二乘法回归。 线性范围：标准曲线的最高Cmax与最低浓度Cmax/20的区间模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度第45页，共60页。标准曲线要求标准曲线用模拟生物样品（与待测的含药生物样品相同的生物基质）建立线性范围(不包括零点)应能覆盖全部生物样品的药物浓度不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度 第46页，共60页。标准曲线的绘制第47页，共60页。（三）、定量下限第48页，

19、共60页。（四）、精密度与准确度方法准确度系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓度是未知的，所以通常使用模拟生物样品测定一般用相对回收率表示第49页，共60页。第50页，共60页。方法精密度(precision )系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度表示该分析方法的可重复性反映分析方法的可操作性，是方法验证的基本要点实际生物样品的量有限(如血浆，一般为0.52ml)使用模拟生物样品测定 第51页，共60页。测定法照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆)数份，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低 3个浓度的QC样品，

20、并分析测定批内RSD每一浓度5个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个浓度及RSD 批间RSD 每1分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测定1次；在不同天连续制备并测定3 个合格的分析批，至少45 个样品。第52页，共60页。限度要求在药代动力学和生物利用度研究中对g/ml级水平的RSD一般应10%ng/ml级水平的RSD一般应15%在LOQ 附近RSD应20%。 第53页，共60页。（五）、样品稳定性稳定性包括短期稳定性和长期稳定性 生物样品的存放条件和时间；冻-融循环(3次），每次冷冻时间应在24h以上；复溶溶剂中的稳定性第54页，共60页。（六）、萃取回收率 萃取回收率与相对回收率的意义不同 萃取回收率考察生物样品预处理过程造成的药物的损失程度第55页，共60页。取空白生物基质(如血浆)，照准确度项下方法，制备高、中、低3个浓度的QC