分离植物内生真菌操作流程

1、分离植物内生真菌操作流程材料准备：植物样本、剪刀、镊子、70%乙醇、3%次氯酸钠（本实验用4%84）、 酒精灯、计时器、平板、锥形瓶，无菌水，离心管（带盖，灭菌、打开无菌操作台灭菌30min。（1） 植物样本的采集：选取生长状态良好，不要有病斑或者枯枝烂叶，每种植 物采取三株标本，要带有叶子、叶柄和枝条及其他部位，将样本名字写在 小纸条上放在装标本的袋子里，采下来的标本与写有名字的纸条一同拍照， 样本上有脏东西时，请用纸轻轻擦掉，若不清楚植物名字，请将整棵植物 拍照留用于鉴定，并做好相关记录。（2）制作PDA固体培养基，在无菌操作台中倒平板，每瓶250ml的培养基大 概倒15个板，待其凝固后用

2、于接种。清洗：认真用清水将标本洗净，洗去标本表面的灰尘，去除枯叶，备用。取样：（1）在叶片的左上、右上、左下，右下和正中五个部位进行取样，剪取 5mm*5mm的叶片，如果是叶柄或枝干，则剪取510mm，若是比较 粗的枝干或圆圆的果实之类的，总之比较大的，则将它切开，再剪取 样本，样本不要剪的太大或太小。（2）每种植物的叶子，叶柄，枝干等其他部位，每种部位接种两块板，大 板每个要接种五个样本即左上、右上、左下，右下和正中，小板每个 接种四个样本即左上、右上、左下，右下，计算好所要剪的样本数， 尽量多剪几个，以免后面的表面灭菌中冲洗时被冲掉。（3）若植物标本有剩余，且是没有洗过的，重新装好，放到冰

3、箱里，备用， 洗过的扔掉。（4）每种植物标本所剪的样本放在一个50ml的离心管中，放在试管架上， 并且每个离心管上要标好所对应的植物标本。表面灭菌：在无菌操作台中进行（1）先向各离心管内倒入适量（1020ml）70%乙醇，拧紧盖子，用计时器 开始计时1min,每10秒钟晃动离心管几次，使其充分灭菌。（2）1min后，拧松盖子，将乙醇倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管 中样本倒出，倒出的样本不要再放入其中，也不要用手碰到样本，样 本不可以接触到除了离心管以外的东西。（3）然后，再向各离心管中加入40ml的3%次氯酸钠，拧紧盖子，用计时 器开始计时10min，每隔1min晃动几次离心管，时间到后

4、，拧松盖子， 将次氯酸钠倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管中样本倒出，倒 出的样本不要再放入其中，也不要用手碰到样本，样本不可以接触到 除了离心管以外的东西。（4）最后，用无菌水冲洗三遍，操作步骤同上面（3）。（5）冲洗完后，将样本放在盖子里，备用。（6）表面灭菌是整个实验中的关键步骤，务必认真进行表面灭菌，各项操 作严格进行。平板接种：（1）将已经凝固的平板标好相应的植物标本名字，时间和自己的名字，每 种标本的平板再用A、B、C、D等来区分，如桂花A，桂花B，桂花C， 桂花D等，桂花A和桂花B用来接种桂花的叶子，C和D用来接种叶 柄，以此类推。（2）在无菌操作台中，打开酒精灯，平板的盖子四

5、周在酒精灯处灭菌，将 镊子在火焰上灭菌后，夹取样本，在酒精灯附近打开平板的一边，放 入样本，大板每个要接种五个样本即左上、右上、左下，右下和正中， 小板每个接种四个样本即左上、右上、左下，右下，样本在平板上整 齐排列，尽量一次性放到位，不要在平板上到处移，掉在操作台上的 样本不可以再用，夹取每种植物标本前一定要在火焰上灭菌。（3）放入样本后，立刻合上平板，并且再在酒精灯处灭菌，此过程要注意 严格无菌操作。室温培养：接种好的平板放在室温下培养37天，每日观察。挑取菌种：待样本附近长出菌后，还可以分出不同菌种前，立即进行挑菌。（1）用记号笔在平板底部划出要挑的菌种，并且每块板上标好1,2,3等，标

6、完后，数好需要挑的真菌总数，取相应数量灭过菌的1.5ml小管，做 好相应的标记。（2）在无菌操作台中，挑取相应菌种放入1.5ml小管中，注意尽量挑取相 同颜色的菌块，这样挑菌种比较纯，此过程也要注意无菌操作。（3）记录好每块板上挑取的真菌数及种类，待其长满后，同样的则不需要再记录。纯化菌种：（1）数好需要纯化的菌种，倒好相应数量的平板，待其凝固后，在无菌操 作台中，将小管中的真菌块挑到平板正中央，此过程也要注意无菌操 作。（2）种好菌的平板放在室温下培养，每日观察，若染上细菌，则重新挑到 新板中再长，若分离出其他菌种，则拿新的板再分离。菌种保藏：（1）准备：已灭菌的液体石蜡和菌种保藏管，每种菌

7、放两个小管，其中一 个小管放1ml液体石蜡。（2）拍照：待内生真菌长满平板后，在无菌操作台里打开平板盖子，拍下 照片，并且也拍好与之相对应的菌种名称。（3）保藏：小管做好标记后放在无菌操作台里，打开酒精灯，取一个平板 和与之相对应的两个小管，打开小管盖子，盖子口朝上放在操作台上， 小管放在酒精灯附近，将平板在酒精灯火焰处灭菌，针在火焰上灭菌 后，打开平板盖子，在平板一边划一块培养基，分成若干小块，每个 小管放五小块。合上平板盖子，在火焰处灭下菌，针在挑下一个菌种 前务必灭菌。（4）保藏菌种的小管放到冰箱里。菌种发酵：（1）制作PDA液体培养基，与50ml锥形瓶，50ml量筒一起灭菌。（2）灭菌

8、后，在无菌操作台中将PDA液体培养基分装到50ml锥形瓶中， 各个瓶30ml，在瓶壁上写上相应的所需发酵的菌种。（3）从各个平板中取两小块带菌种的培养基放入瓶中，发酵20天。（4）注意无菌操作。过滤发酵液体：（1）准备：滤纸，漏斗，锥形瓶，针筒，细菌滤器（已灭菌的），50ml离 心管（已灭菌的），移液器，ph试纸，1.5ml小管（已灭菌的），96孔 板，蒸馏水。（2）过滤：将放好滤纸的漏斗先用少量蒸馏水润湿，然后倒掉锥形瓶里的 蒸馏水，将发酵瓶中的液体倒入漏斗，注意不要将菌块倒入，也不要 倒太满，待其漏下后再倒。（3）测ph：用移液器吸取一点的发酵液，滴在ph试纸上测，并做好记录。（4）待发酵液过滤完后，用洗干净的针筒吸取里面的液体，吸完后，在针 筒头上套上已灭菌的细菌滤器，缓缓打入相应50ml离心管中，并在 1.5ml相应小管中放入1ml发酵液，用移液器分别吸取200微升发酵液 放入编号为1#和2#的96孔板的相同位置，作好记录，并且记录50ml 离心管中最后所得发酵液的体积。（5）50ml离心管、1.5ml小管、96孔板分别装好放入冰箱保存，备用。（6）倒出发酵液的锥形瓶先放着，不洗掉，用过的细菌滤器扔掉里面的滤