KRAS与免疫治疗的疗效关系

1、免疫治疗对抗KRAS突变的希望之光引言：KRAS属于Ras基因家族主要成员之一，KRAS基因突变占非小细胞肺癌(NSCLC)总数的20-30%，肺腺癌较高，肺鳞癌中不常见，位于EGFR信号通路的下游1。肺癌中的KRAS突变似乎与EGFR和ALK易位互不相容，众多研究显示，KRAS基因突变是影响TKI药物疗效的不利因素2。KRAS基因突变主要发生在外显子2、3、4上，其中KRAS基因外显子2、3变异对EGFRTKI类药物敏感性降低，即吉非替尼、厄洛替尼的效果受限3。此外KRAS基因被激活的方式是点突变，多发生在N端的第12、13和61、146密码子，其中以第12密码子突变最常见4。目前并没有治疗

2、KRAS基因突变的晚期非小细胞肺癌药物，各大公司的研究重点也都集中在KRAS的下游通路上，如MEK，CDK4/6以及免疫治疗5。KRAS的不可成药性和药物开发的探索：为什么RAS长期以来被认为不可成药？这要从其结构，工作原理和调控机制说起。RAS主要有三个亚型HRAS、KRAS和NRAS,其中KRAS通过RNA剪接又表达两个不同的蛋白KRAS4A和KRAS4B6。RAS蛋白是一种21kDa大小，位于细胞膜上的，拥有GTPase酶活性的鸟嘌吟核苷结合蛋白7。RAS是GDP/GTP循环控制的二进制分子开关：GDP结合时处于“关”的状态，而GTP结合则代表“开”的状态。没有刺激信号时，这种开关状态的

3、转换非常缓慢。接收到信号后，鸟苷酸交换因子GEFs被招募到细胞膜上与RAS结合并释放GDP7。由于细胞中GTP的浓度远高于GDP,RAS蛋白迅速结合GTP，招募其下游信号通路的效应蛋白进入开的状态。在GAPs(GTPaseactivatingprotein)的作用下，RAS的GTPase的活性被提高上千倍，其结合的GTP被水解成GDP，RAS重新进入GDP结合的“关”的状态，从而完成一个完整的循环7。RAS分子开关的结构基础也得到了很好地阐释。RAS蛋白1-166个氨基酸组成G-domain，这个结构域在各亚型中高度保守，余下的23-24个氨基酸组成高度可变区(HVR)。D-domain带有R

4、AS的核苷酸结合口袋,包括P-loop(残基10-17)，SwitchI(残基30-38)和SwitchII(残基60-67)等区域8。从其名字可以判断，SwitchI和II是RAS功能切换的关键。如图1所示，GTP结合活性状态时，GTP分子中Gamma磷酸分别与SwitchI的T35和SwitchII的G60形成氢键，像弹簧一样将它们拉在一起。一旦GTP被水解，Gamma位磷酸被水解掉，SwitchI和II被分开，回到GDP结合的非活性构象9-io。从上述描述可以看出GTP水解是淬灭RAS活性的关键步骤11。不难想象，如果基因突变抑制了GTP水解，RAS蛋白将被锁在激活状态。正因为如此，RA

5、S最常见的突变就发生在G12、G13和Q61三个位置。前面提到RAS高效水解GTP需要GAP蛋白参与，GAP与RAS结合后，将一个精氨酸(arginine)残基伸到催化位点，协助水解，这个残基被称作精氨酸手指(argininefinger)12。结构生物学研究表明，除了脯氨酸，G12或G13替换成任何氨基酸，立体位阻将阻碍精氨酸手指进入催化位点。Q61则是直接参与水解过程，协助定位一个水分子，稳定水解反应的过渡态。其它突变还有与GDP结合相关的氨基酸如A146比较有意思的是，虽然各个亚型的D-domain和功能高度类似，但肿瘤中发现的RAS突变主要集中在KRAS(85%)，NRAS(12%)次

6、之，HRAS(3%)最少13。最近的研究也许提供了部分解释，研究发现KRAS4B而不是其它亚型通过HVR区域与calmodulin结合，从而抑制非经典Wnt通路，有利于保持肿瘤细胞的干性状态14。简单来说为什么RAS难以成药，首先，RAS各个亚型的D-domain高度类似，直接靶向RAS很难达到高度选择性15；第二，小分子药物最常见的是抑制酶的活性，但RAS比较特殊，GTP水解酶与其功能反相关，需要开发酶的激活剂；第三，药物分子无法与底物竞争，因为RAS与GTP的亲和力常数达到皮摩尔(picomolar)级别，而细胞中GTP的浓度高达0.5mMi6；第四，除了不可逾越的核苷酸口袋，RAS蛋白其

7、它地方缺乏有利于小分子结合的口袋；第五，RAS的调控和功能执行都是通过蛋白-蛋白的相互作用实现的，很难通过小分子干预17。这些蛋白相互作用发生在细胞膜内，单抗等大分子难以触及。因为这些原因，制药界早期将注意力转移到RAS的高度可变区(HVR)18。HVR是RAS用来定位细胞膜的区域，末端包含CAAX系列19。RAS蛋白合成后，要进行一系列修饰才能进入细胞膜OCAAX系列的Cys被异戊烯化(prenylation)后,AAX被转化酶RCE1切除，最后Cys的羧基被甲基转移酶ICMT所甲基化20。细胞膜定位对于RAS的功能至关重要，其调节蛋白如GEFs、GAPs以及各种效应蛋白都依赖细胞膜移位(t

8、ranslocation)进行调控21。让人没想到的是，抑制RCE1和ICMT有时反而促进肿瘤的发生，原因还不太清楚。其实抑制RAS通路的某个环节造成反向激活(paradoxicalactivation)还比较常见，比如Raf和MEK抑制剂中都发现了类似的现象22，这也是RAS药物开发的难点。（图一KRAS信号通路与蛋白水解活性示意图）免疫治疗是否能为KRAS突变患者另辟蹊径呢？最近举行的ESMO免疫肿瘤学大会上报道了帕博利珠单抗的两个探索性分析，分析结果显示帕博利珠单抗单药或联合化疗一线（初始）治疗KRAS突变非鳞非小细胞肺癌疗效良好，客观缓解率40%以上。研究人员对KEYNOTE-O42研

9、究的数据进行探索性分析23。分析结果显示在有进行基因检测的301例患者中，69例（23%）为KRAS突变，包括了29例（10%）的KRASG12C突变。KRAS突变患者与非KRAS突变患者相比，PD-L1表达和TMB（肿瘤突变负荷）更高中位PDL1TPS中位TMEKRAS突变6侧191mui/exome非KRAS突变35嗾105mut/exomeKEYNOTE-042研究中KRAS突变与非KRAS突变PD-L1和TMB对比）PD-L1表达和TMB越高，通常免疫治疗效果越好，那帕博利珠单抗治疗KRAS突变患者实际疗效如何呢？详见下表：KRAS突变KRASG12C突变非KRAS突变帕博利珠单抗单药

10、N=30化疗N=39帕博利珠单抗单药N=12化疗N=17帕博利珠单抗单药N=127化疗N=105ORR%56.71866.723.529.121mPFSm12615666PFSHR0.51(0.29-0.87)0.27(0.10-0.71)1.00(0.75-1.34)mOSm2811NR81512OSHR0.42(0.22-0.81)0.28(0.09-0.86)0.86(0.63-1.18)（表二KRAS突变与帕博利珠单抗单药治疗的疗效，NR为未达到）从上表可见，KRAS突变患者，包括KRASG12C突变患者帕博利珠单抗单药治疗的疗效优于化疗，也优于非KRAS突变患者。研究人员也对KEYN

11、OTE-189研究的数据进行探索性分析24这是一个帕博利珠单抗联合培美曲塞+铂类化疗一线治疗非鳞非小细胞肺癌的临床研究。分析结果显示在有进行基因检测的289例患者中，89例（31%）为KRAS突变，包括了37例（13%）的KRASG12C突变。KRAS突变患者与非KRAS突变患者相比，PD-L1表达和TMB（肿瘤突变负荷）更高。中位PDL1TPS中位TMEKRAS突变30K204mut/exome非KRAS突变5%141mut/exame（表三KEYNOTE-189研究KRAS突变与非KRAS突变患者PD-L1和TMB对比）Public帕博利珠单抗联合化疗治疗KRAS突变患者疗效如何呢？详见下

12、表:KRAS突变KRASG12C突变非KRAS突变帕博利珠单抗+化疗N=59安慰剂+化疗N=30帕博利珠单抗+化疗N=26安慰剂+化疗N=11帕博利珠单抗+化疗N=145安慰剂+化疗N=55ORR%40.726.75018.247.610.9mPFSm9511595PFSHR0.47(0.29-0.77)0.48(0.22-1.06)0.40(0.29-0.57)mOSm21141825239OSHR0.79(0.45-1.38)1.14(0.45-2.92)0.55(0.37-0.81)（表四KRAS突变与帕博利珠单抗+化疗治疗的疗效，NR为未达到）从上表可见，KRAS突变患者，帕博利珠单抗

13、+化疗疗效总体也优于化疗，但是KRASG12C突变患者帕博利珠单抗+化疗的总生存期获益与化疗没有明显差异，这可能是因为化疗组患者数量较少造成。我们可以看到KRASG12C突变化疗组的中位总生存期为25个月，这远优于历史数据，不代表普遍情况24。KRAS药物开发的展望1）首先，考虑靶向其它RAS突变，比如最常见的G12D和G12V。因为这类蛋白缺乏合适的Cys或者其它非天生的可共价结合的氨基酸，要取得足够的活性和选择性比较困难。今年8月份报道了一个纳摩尔活性的结合在Switch区域的非共价抑制剂BI-2852。机制上不同于G12C抑制剂，这个化合物可以同时抑制活性和非活性状态RAS，且不限于G1

14、2C。令人遗憾的是，细胞测试上活性不高，而且出现了类似于BRAF抑制剂的反向激活的老问题；2）另外，药物联用是克服耐药和提高疗效的一个常用办法。临床前研究表明，KRAS变异对肿瘤免疫疗法比较敏感，特别是P53共变异的病人。AMG510与PD-1单抗联用的临床研究即将展开，让我们拭目以待。KRAS抑制剂与RAS通路上其它药物的联用也值得探索，比如EGFR、BRAF、MEK、PI3K,以及SHP2抑制剂，等等；3)寻找与RAS变异合成致死的药物，最近的例子有XPO1抑制剂和铁死亡诱导剂等；4)随着新技术的发展，人们也将眼光转向了其它非小分子药物形式，比如siRNA(23)、细胞内单抗碎片(24)等

15、。用于RAS蛋白降解的PROTAC也有不少专利公开。这些研究都是很好的尝试，但离真正的临床应用还有很长的路。比较有意思的是，细胞治疗的权威Rosenberg教授最近在NEJM上报道了一例针对KRASG12D的TIL疗法。经过G12D特异和HLA-C*8:02等位基因限制的T细胞治疗，个50岁的带有肺转移的女性肠癌患者取得了9个月的PR。然而，HLA-C*8:02的广泛性如何还有争议。参考文献：Nature1964;204:11041105.9NatlCancerInst.1967;39:311-335Nature1982,297:474Cell2015Nov19;163(5):1237-125

16、1ProcNatlAcadSciUSA.1989Nov;86(21):8323-7JBiolChem1997,14459Nature2013May30;497(7451):638-42NatCommun.2016Apr20;7:11360BioorgMedChem.1997Jan;5(1):125-33NatureReviewDrugDiscovery2016,15,771ProcNatlAcadSciUSA.2012Apr3;109(14):5299-304MolCancerTher17:1051-1060.PNAS2019,116(7),2551-2560Nature2013Nov28;503(7477):548-51ProcNatlAcadSciUSA2000Aug15;97(17):9367-72Science2016February5;351(6273):604-608NatStructMolBiol.2018Jun;25(6):454-462Angew.