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1、细菌内毒素检查法与实验分析 #- -细菌内毒素检查法与实验分析编辑整理:尊敬的读者朋友们:这里是精品文档编辑中心,本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的,发布之前我们对文中内容进行仔细校对,但是难免会有疏漏的地方,但是任然希望(细菌内毒素检查法与实验分析)的内容能够给您的工作和学习带来便利。同时也真诚的希望收到您的建议和反馈,这将是我们进步的源泉,前进的动力。本文可编辑可修改,如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅,最后祝您生活愉快业绩进步,以下为细菌内毒素检查法与实验分析的全部内容。细菌内毒素检查法与实验分析细菌内毒素检查法与实验分析- - #-学习交流题目:细菌内毒素检查法与实验分析
2、莫水晶高级工程师)细菌内毒素检查法与实验分析- - -一、热原与细菌内毒素的研究进展(一)热原与热原反应一百多年前,在西方医药学的发展史上,一个重要的发展就是注射给药(特别是静脉注射)方式的创立,它在人类与疾病作斗争的过程中起了重大作用。但是无论过去还是现在,在临床上使用注射剂,常易发生不良反应(冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、肤色灰白、昏迷、休克)而加重病情,严重时导致病人重要器官功能衰竭或死亡。1875年(Brrdon-Sanderson)从腐肉中分离出不带活菌的物质,能引起上述一系列症状,并称之为热原(Pyrogen)。将上述一系列不良反应定为热原反应。为了克服热原反应的发生,保障输
3、、注药品的给药安全,对热原进行了广泛的研究。1923年Seibert肯定热原来源于细菌,它能从滤器滤过,对热稳定,注射剂虽经严格灭菌,仍不能排除热原反应的发生,而提出采用家兔检测热原的方法.1、热原检查法的建立及优、缺点1942年美国首先将家兔热原检查方法收入药典,作为检查药品注射液中发热物质的法定方法。因此,相继在世界各国药典均规定了这一检查方法.中国药典自1953年版开始收载了热原检查法(各国药典方法基本相同)。近半个世纪以来,这项保障药品安全的检查,发挥了重要作用。家兔热原检查法的优点:它能反映出“热原”引起哺乳动物细菌内毒素检查法与实验分析复杂的升温反应过程,除此之外很难列出这一检查方
4、法的更多优点。1952年,世界卫生组织生物标准化专家委员会,邀请了一些国家协作,试图建立热原标准品,使这一检查方法成为一种定量的方法。但实验结果表明,热原质的剂量与家兔升温反应关系的直线斜率是不一样的,有的很锐,有的很平,使热原检查方法成为一种定量方法的任何努力都失败了。而且随着科学技术和制药工业的发展,这一检查方法的局限性,首先是这一方法不能标准化.缺点:热原检查法之所以不能进行定量测定原因是:、热原的绝对不均一性(不同细菌来源的不一致性),不知道被检测品中存在热原到底是哪一种,因此无法确定选择从哪一种细菌制备的热原作为一个“标准品”、家兔经常处于被革兰氏细菌污染的环境中,通过吸入、食入、皮
5、肤受伤,感染了这些细菌,可以说每个家兔生活中已经或多或少地被革兰氏细菌免疫了。、家兔试验,常常处于被惊扰的条件下,惊扰可能引起降温或升温。、这一方法的精密度和灵敏度均很差,试验的重复性差,特别是对于边缘产品,主要原因是动物个体之间对热原反应性的差异,灵敏度差也是一个原因。目前美国、欧洲药典都拒绝以这一试验控制水的热原检查。、成本高。2、热原致热机理多年来的研究已经证明,热原进入人体血液循环系统后,并不直接引起发热和其它毒性反应,但它可使白细胞(单核细胞)释放出“内源性热原”质,这种内源性热原质是热原和炎症活性的细胞变动素(Cytokines)混合物,白细胞介素与肿瘤坏死因子a;白细胞介素和干扰
6、素等。自1988年英国学者Poole.S报道用放射免疫方法测定细胞变动素后,在欧洲药学界引起重视,它很有可能导致建立一种新型的热原检查方法。因此作为检测微量细菌内毒素的鲎试验(Limulnstest)的创立,除了在临床上用于检测内毒素血症外,一个重要的研究领域就是如何评价它在药品热原检查方面的地位以及它与经典的药品热原检查法的关系。在自然界,细菌属微生物中原核生物,根据细菌对革兰氏染色法的反应,可分为革兰阳性菌和革兰氏阴性菌,这种区别主要是与细胞壁的结构性质有关。这种毒素可归纳为两类:一类称外毒素(Exotoxin),它是细菌的代谢产物,大多数革兰氏阳性菌在生长繁殖的过程中,经常不断地向菌体外
7、分泌这些毒素,一旦细菌死亡、解体,毒素也不再产生,这些毒素的主要成份是复合蛋白,对光、热、酸、碱都很不稳定。另一类称内毒素(Endotoxin),它是革兰氏阴性菌的细胞壁细菌内毒素检查法与实验分析外壁层上的特有结构,革兰氏阳性菌则无,它在细菌生长、繁殖过程中,并不分泌到介质中,也不能从外壁层上自然脱落,它不是细菌的代谢产物,当细菌死亡解体后,才显示出一系列的内毒素生物活性.1、细菌内毒素化学组成细菌内毒素(Endotoxin)是6菌细胞壁层上的特有结构,内毒素为外源性致热原,它可激活性粒细胞,使之释放出一种内源性热原质,作用于体温调节中枢,引起发热。到目前为止,我们知道细菌内毒素作为G-菌细胞
8、壁外表层结构的一部分脂多糖主要是由多糖O抗原,核心多糖和类脂A三部分组成。类脂A位于最外层。多糖抗原向外由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链,具有特异性,核心多糖分为内核心及外核心,外核心由数种单糖,包括葡萄糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖等组成内核心含有庚糖及特殊的KDO(3脱氧一D甘露糖-辛酮糖)。KDO以耐酸的酮糖键与类脂A的氨基葡萄糖连接。所有G菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄糖胺二糖为单位,通过焦磷酸键组成的一种独特的糖脂化合物,具有致热作用,是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分.细菌内毒素检查法与实验分析细菌内毒素检查法与实验分析- - -脂多糖结构Qi卫-特殊链(多糖部分)2、械心部3、
9、类脂A(0-5pec:iichain)樓心部分一(Cure)-类脂A结构RRRRneinredUQng一QSendOfLipidAModelOHrmirnt4-AraNHOQNHqOHHOOH(1)、致热性(2)、致死毒性(3)、白细胞减少(4)、降低血压、休克(5)、激活凝血系统(6)、诱导对内毒素的耐受性(7)、鲎血细胞溶解物的凝集(8)、诱导抗感染的非特异抵抗力(9)、肿瘤细胞坏死作用- - -封闭G因子支链反应示意图IIamamamamamamamamamamamlllji葡聚糖IIIIII:(13)-PDIIIIIIIIIIIIIIIII:IIjII!IIiIl:IIIII加入真菌多
10、糖(_)活化G因子B因子活化B因子(+)G因子凝固酶原凝固酶3ocLeuGly一ArgC0NH一pNA显色合成基质H_AlaLeu_Gly一Arg一ThrArg_Gly细菌内毒素检查法与实验分析二、细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理,判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法,内毒素的量用EU/ML表示:鲎试剂反应机理光度法定量鲎试剂反应示意图细菌内毒素Endotoxinglucan(加入碱土金属离子I(+)c因子活化c因子pheOH1161718194647175Boc-LeuGlyArg-OHHThrArgOHNaN02/HcL1946细菌内毒素检查法与
11、实验分析细菌内毒素检查法与实验分析 - -铵基硫酸铵H-Glyphe-OH(鲎肽链C)H一AlaLeu-Gly一Arg一OH116171847175(SS)2重合化(浊度上升)A380405A492-660偶氮兰复合物(呈玫瑰红色)A545A545-630比色法(显色合成基质法)比浊法细菌内毒素试验(简称“鲎试验)。自1973年以来,鲎试验被证明是一种有效检测细菌内毒素(热原)存在的试剂。于是1973年美国食品与药品管理署(FDA)就推荐鲎试验用于生产工艺流程的内毒素质量控制。因为这种鲎试验的灵敏性被证实为防止给药或使用产品存在细菌内毒素而导致人或动物发热、休克和死亡具有重要价值.此后由于鲎试
12、剂生技术的改进和标准化研究的进展,鲎试剂的灵敏度要比早期产品高出100倍,而且人们普遍认识到 - -细菌内毒素检查法与实验分析在所有药学领域和药品生产中对内毒素污染进行监督是非常重要的。用鲎试验要比家兔试验迅速、经济、所需要样品量少,操作过程工作量小,每天可以进行许多样品检测。于是1980年美国药典(USP)20版收载了细菌内毒素检查法(BacterialEndotoxinsTest)而中国药典1990版收截,可是在任何品种正文中,仍未要求进行该项检查.1980年,FDA宣布鲎试验法可以检测人用或兽用注射药品的内毒素。1983年USP增补本在规定了5种水和40种放射性药品的细菌内毒素限值的同时
13、,删除了这些品种的热原试验。1985年USP21版正文收载5种注射用水及40种放射性药品的鲎试验法检测内毒素,并规定了这些品种细菌内毒素的限量。1990年USP22版除放射性药品外,又增加了10种品种以细菌内毒素检查法代替热原检查法。1991年11月执行的USP22版第五增补版公布了185种药品删除家兔热原检查法,用细菌内毒素检查法代替.在此之后,USP的第六和第七增补本还发布了众多品种过去未要求进行热原试验也新增加细菌内毒素检查项.根据这一总的趋势可以肯定,凡不干扰细菌内毒素检查或虽有干扰,但可以克服的药品注射剂,将全部以细菌内毒素检查代替家兔热原检查.1995年USP23版注射液热原检查项
14、几乎都被细菌内毒素检查代替.(二)实施细菌内毒素检查法的基本条件鲎试剂细菌内毒素检查法与实验分析细菌内毒素标准品(79-5;863;89-6;924;962;98-1)细菌内毒素检查用水相关的实验器械(玻璃试管、吸管、恒温水浴箱振荡器封口膜等)三中国药典细菌内毒素检查法学习与讨论本法系利用从鲎的变形细胞中提取的试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素,以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定的一种方法.细菌内毒素检查包括两种方法,即凝胶法和光度测定法,后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法结果为准.细菌内毒素的
15、量用内毒素单位(EU/)表示。细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成,用于标定复核仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价.细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素标准品为基准标定其效价,用于试验中鲎试剂灵敏度复核干扰试验及设置的各种阳性对照。细菌内毒素检查用水系指与灵敏度为003EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37C1C条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水.细菌内毒素定量测定用的检查用水,其内毒素的含量应小于0。005EU/ml。细菌内毒素检查法与实验分析试验所用的器皿需经处理,以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250C干烤至少1小时,也可用其他确证不干扰细菌内毒素检
16、查的适宜方法。若使用塑料器械,如微孔板和与微量加样器配套的吸头等,应选用标示为无内毒素并且对试验无干扰的器械.试验操作过程应防止微生物的污染液中浸提制成供试品溶液一般要求供试品溶液的PH值在6.08.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品,需调节被测溶液(或其稀释液)的PH值,可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲剂调节PH值。酸或碱溶液须用检查用水在已去除内毒素的容器中进行配制。缓冲剂必须经过验证不含内毒素和干扰因子。供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶内毒素限值的建立药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定:L=K/M式中L为供试品的细菌
17、内毒素限值,以EU/ml、EU/mg或EU/U活性单位表示,注射剂K=5EU/(kgh),放射性药品注射剂K=2.5EU/(kgh),鞘内用注射剂K=0.2EU/(kgh);M为人用每公斤体重每小时最大剂量,以ml(kgh)、mg(kgh)或u活性单位/(kgh)表示,人均体重按60kg计算,注射时间若不足1小时按1小时计算。确定最大有效稀释倍数(MVD)是指供试品溶液被允许稀释的最大倍数,在此稀释倍数下可进行内毒素限值的检测.用以下公式细菌内毒素检查法与实验分析细菌内毒素检查法与实验分析 #- -来确定MVD:MVD二CL/入式中L为供试品的细菌内毒素限值:C为供试品溶液的浓度,当L以EU/
18、ml表示时,则C等于1.0ml/ml,当L以EU/mg或EU/U活性单位表示时,C的单位需为mg/ml或U活性单位/ml;入为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml),或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。方法1凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或定量检测内毒素的方法。在本检查法规定的条件下,使鲎试剂产生凝集的内毒素最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。鲎试剂灵敏度复核试验当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时,应进行鲎试剂灵敏度复核试验.根据鲎试剂灵敏度的标示值(入)将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细
19、菌内毒素检查用水溶解,在旋涡混合器上混匀15分钟,然后制成2。0入、1。0入、0.5入和0.25入四个浓度的内毒素标准溶液,每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取含有分装了01ml鲎试剂溶液的10mmX75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支,其中16管加入0.1ml内毒素标准溶液,每一个浓度平行做4支;另外两管加入0。1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后 - #-细菌内毒素检查法与实验分析封闭管口,垂直放入37C1C适宜恒温器中,保温60分钟2分钟.将试管从恒温器中轻轻取出,缓缓倒转180时,管内凝胶不变形,不从管壁滑脱者为阳性,记录为(+)
20、;凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性,记录为(-)。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。若最大浓度2。0入管均为阳性,最低浓度0.25入管均为阴性,阴性对照管为阴性,试验方为有效。按下式计算反应终点浓度几何平均值,即为鲎试剂灵敏度的测定值(入c)。入c=1gT(ZX/4)式中X为反应终点浓度的对数值(1g)反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当入c在0.5入-2。0X(包括0。5入和2。0入)时,方可用于细菌内毒素检查,并以标示灵敏度入为该批鲎试剂的灵敏度。干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D,使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数
21、(MVD)的溶液,按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。只有当A和D的所有平行管都为阴性,并且C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时,试验方为有效。按下式计算C和B的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)。Es=1gi(ZXs/4)Et=1g-i(ZXt/4)式中Es和Et分别为溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值细菌内毒素检查法与实验分析细菌内毒素检查法与实验分析 - -(1g)。当Es在0.5入一2。0入(包括0。5入和2。0入)时,且当Et在0.5ES-2。0Es(包括0。5入和2.0入)时,则认为供试品在该浓度下无干扰作用,如果供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰,将供试品溶液进行不超
22、过MVD的进一步稀释,再重复干扰试验.表1凝胶法干扰试验溶液的制备编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液2B2入/供试品溶液供试12入4品溶21入4液40。5入480.25入4C2入/检查用水检查12入4用水21入4480.5入0。25入44D无/检查用水2注:A供试品溶液;B干扰试验系列;C鲎试剂标示灵敏度的对照系列;D阴性对照。使用更高灵敏度的鲎试剂并对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效且不会使内毒素失去活性,要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进
23、行干扰试验。当进行新药的内毒素检查试验前,或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时,须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时,须重新进行干扰试验。检查法1)凝胶限量试验按表2制备溶液A、B、C、D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。表2凝胶限量试验溶液的制备编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数A无/供试品溶液2C2入/检查用水2B2入/供试品溶液2D无/检查用水2注:A供试品溶液;B供试品阳性对照;C阳性对照;D阴性对照.
24、结果判断保温60分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管为阴性,供试品阳性对照B的所有平行管为阳性,阳性对照溶液C的平行管都为阳性,试验有效。若溶液A的两个平行管都为阴性,判供试品符合规定;若溶液A的两个平行客都为阳性,判供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性另一管为阴性,需进行复试。复试时,溶液A需做4支平行管,若所有平行管都为阳性,判供试品符合规定。2)凝胶半定量试验本方法系通过确定终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。依表3制备溶液A、B、C和D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作.结果判断保温60分钟2分钟后观察结果.若阴性对照溶液D的所有平行管为阴性,供试品阳性对照B的所有平
25、行管为阳性,溶液C的终点浓度的几何平均值在0。5入一2入之间,试验有效。溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以入,为每个系列的终点浓度,所有平行管终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度(按“灵敏度的复核”中的公式)。如果试验的是供试品的稀释液,则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘上稀释倍数.如试验中供试品溶液的结果都为阴性,应记为内毒素浓度小于入(如果检验的是稀释过的供试品,则记录为小于入乘以该供试品的最低稀释倍数)。如果结果都为阳性,应记为内毒素的浓度大 #- -细菌内毒素检查法与实验分析于或等于最大的稀释倍数乘以入。若内毒素浓度小于规定的限值,判供试品符合规定。若内毒素浓度大于规
26、定的限值,判供试品不符合规定。表3凝胶半定量试验溶液的制备编内毒素浓度/配制稀释稀释所含内毒平行号内毒素的溶液用液倍数素的浓度管数A无/供试品溶液检查12用水224282B2入/供试品溶液2入2C2入/检查用水检查12入2用水21入240。5入2细菌内毒素检查法与实验分析细菌内毒素检查法与实验分析- - #-80。25入2D无/检查用水2注:A:没有超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。用检查用水进行2倍系列稀释,从通过干扰试验的稀释倍数开始再稀释至1倍、2倍、4倍和8倍,但随后的稀释也不得超过MVD;B:含2入浓度标准内毒素的溶液A(供试品阳性对照);C:含2入、1入、0.5入、0.25入
27、浓度标准内毒素的检查用水系列;D:阴性对照。方法2光度测定法光度测定法分为浊度法和显色基质法。浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中浊度变化而测定内毒素含量的方法.根据检测原理,可以分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反映混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度和透光率)之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间,或是检测浊度增加速度的方法。显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特殊底物显色释放出的有色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理,分为终点显色法和动态显色法。终点显色
28、法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的有色团的量之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显- - -细菌内毒素检查法与实验分析色法是检测反应混合物的色度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间,或是检测色度增长速度的方法.光度测定试验应在特定的仪器中进行,温度一般为37C1C。为保证浊度和显色试验的有效性,应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品溶液的干扰试验。当试验环境中发生了任何可能影响检测结果的改变时,试验的有效性应重新检测.标准曲线的可靠性试验标准曲线的制备用标准内毒素配成溶液并制成至少3个浓度的稀释液(稀释度不得大于10),最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法,每一浓度至少做3支平行管
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