神经生物学的常用研究方法ppt课件

1、五、神经生物学常用的研究方法（一）形态学方法（二）生理药理学方法（三）生物化学方法（四）电生理学方法 （五） 分子生物学方法 （六）脑成像（Brain imaging）技术 .（一）形态学方法1、束路追踪法2、免疫组织化学法3、原位杂交法4、受体定位法.束路追踪法 研究神经元之间的纤维联系是神经科学研究领域的一个基本问题，其研究方法主要有三：（1）利用神经元轴浆运输现象的追踪法，是目前应用最广者；（2）利用神经元胞体受损或轴突离断后远侧轴突的变性，或轴突切断后胞体的反应特性的变性追踪法；（3）利用某些荧光染料在神经细胞质膜扩散的神经元质膜荧光追踪法。.（1）轴浆运输追踪法 轴浆运输：神经元有长

2、短不等的轴突，由于轴突内缺乏参与蛋白质合成的核糖体，所以需要从细胞体不断地将各种成分运输至轴突及其分支以维持其代谢；在神经末梢释放的神经肽及合成经典递质的酶也需在胞体合成；从末梢也有影响细胞代谢的物质如神经营养因子等逆向传送至胞体。不同物质的运输速度不同。顺行运输：从胞体向轴突及其终末的运输。逆行运输：从轴突及其终末向胞体的运输。.常用方法：a 辣根过氧化物酶追踪法 1971年，Kristenson和Olsson首先报道辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）可被神经末梢摄取，经轴浆逆行运输至神经元胞体，然后用组织化学方法即可显示出神经元的轮廓，从而创建了HRP追

3、踪神经元示踪技术，即HRP法。 HRP即可作逆行追踪剂使用，也可作顺行追踪剂使用。 基本步骤： 将HRP注射至实验动物中枢核团或周围器官、神经的一定部位；存活一定时间后灌注、固定动物，取材作冰冻切片；然后用双氧水（H2O2）及呈色剂四甲基联苯胺（TMD）或二氨基联苯胺（DAB）显示HRP反应产物。 .将HRP注射于周围神经感觉末梢或神经干逆向标记背根神经节细胞后，HRP还可进一步沿背根节细胞的中枢突顺向标记其在脊髓的中枢终止部位，称作跨节标记。.HRP：1.游离HRP： 通过非特异性整体胞饮的方式被摄入 2.结合HRP：通过与细胞膜的特异性受体结合的介导进入神经元 麦芽凝集素（WGA）-HRP

4、 霍乱毒素（CT）-HRP 优点：灵敏度高，用量较少， HRP在胞内降解时间明显延长，能清晰地显示包括细微分支在内的整个神经元的全貌。 注意：因为HRP到达预定部位的时间取决于运输速度和距离，运输速度因动物及纤维种类而异。同时HRP被运至胞体后即被送入溶酶体内水解。因此在聚集和降解两个相反的过程中求得最佳存活期必须具体测试。呈色剂： 1.二氨基联苯胺(DAB): DAB作为供氢体，HRP在H2O2存在的情况下，能使DAB发生氧化，生成不溶性棕褐色反应产物沉淀，定位在抗原所在处。 2.二盐酸联苯胺(BDHC) 3.邻-联茴香胺(OD) 4.四甲基联苯胺(TMB)用途： 研究脏器的神经支配、中枢内

5、核团间的联系等。还可与免疫组织化学、电镜技术等结合。.HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat 10 40.HRP labelling neurons in dLGN40.b 荧光素追踪法-主要作逆向追踪 1977年，荷兰著名神经解剖学家Kuypers及其同事首先发现部分荧光化合物可被神经纤维的末梢摄取，并通过轴浆流逆行运输到各自的神经元胞体，切片后在荧光显微镜下可直接观察到这些胞体的定位，从而建立了研究神经纤维联系的荧光素逆行追踪法。 原 理： 将荧光物质注射至神经元的轴突分布区, 经分支的末梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。在荧光显

6、微镜 下可看到胞体内呈现荧光标记物。 .荧光素追踪剂是一种暴露在一定激发波长光照下，以一定发射波长发出一定颜色荧光的化合物。每一种荧光素都有各自的激发波长和发射波长，不同的发射波长决定了这些荧光素发出的荧光颜色各异。不同荧光素在神经元内的标记特征不同： 绝大多数标记细胞质，如荧光金（Furogold，灵敏度高，能较好显示树突分支，只标记胞浆；在胞体内分解慢，甚至在注射后存活2个月标记强度仍无明显变化；比较耐紫外线的照射，褪色比较缓慢；可以经受许多组织学染色处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等结合使用），fast bule（固蓝）等。 只有少数仅标记细胞核，如nuclear yellow（核黄

7、 ）, diamidino yellow（双脒基黄）等。. Fast blue labelling neuronsDRGSpinal cord2020.Fast Blue LadellingGanglion Cells of Retina 20.优点：可靠性，灵敏性， 利用其不同颜色可同时追踪和显示多重神经联系。因此可选择一种或两种以上的荧光素分别对神经元进行单标、双标或多重标记。 双重标记和多重标记可用来研究神经元轴突的分支投射。若在脑内不同核团或区域分别注射两种（或三种）不同荧光，在同一神经元胞体内能观察到两种（或三种）不同颜色的荧光，即说明该神经元的轴突分支分别投射到注射这些荧光剂的两个

8、（或三个）脑内不同核团或区域。 需要注意的是各种荧光素逆行运输的速度不同，所以动物存活时间也有差异。双重标记是，有时需要做两次手术先注射运输慢的荧光素，过一定的时间后，再注射运输较快的荧光素。缺 点：激发光照射下很快褪灭，因此允许观察的时间较短，保存时间也有限。应 用：研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。可与免疫组织化学结合，研究投射神经元的化学性质。.（2）变性束路追踪法 利用神经元的轴突被损伤之后，在损伤的近侧端和远侧端分别发生逆行和顺行溃变；神经元胞体受损后，其发出的轴突从胞体向终末方向的远侧端发生顺行溃变，来研究纤维的联系。.损伤手段：物理性方法 锐器的切割、电凝、电离破坏、超声破坏

9、等 特点：无选择性，除了损伤神经元和发出的纤维以外，也能破坏通过此损伤部位的纤维，导致非特异性标记。化学性破坏 单胺类神经毒剂：6-羟多巴胺（可选择性被儿茶酚胺类神经元摄入，经过自氧化形成若干具有细胞毒性的产物。由于整个神经元的细胞膜均可摄入6-羟多巴胺，故儿茶酚胺类神经元的任何部位都可被6-羟多巴胺破坏。不易通过血脑屏障，因此如欲造成中枢性破坏，需做脑室或脑内注射）、6-羟多巴、5,6-双羟色胺和5,7-双羟色胺（选择性破坏5-羟色胺能神经元） 胆碱类神经毒剂：乙基胆碱氮芥丙啶正离子 兴奋性氨基酸：海人酸和鹅高蕈氨酸（能够非选择性损伤神经元的胞体，而不损伤轴突，故无过路纤维受损问题）.研究方

10、法： 20世纪从40年代，镀银染色法，根据银染溃变纤维的形态变化来判断、追踪溃变纤维的方法。 20世纪从50年代，Nauta法，一种改进的溃变镀银法，能抑制正常纤维的染色而仅染出溃变纤维。 20世纪70年代，变性束路追踪法逐渐被轴浆运输追踪法所代替。可与逆行标记法、顺行标记法、免疫组织化学、原位杂交等技术结合运用。.（3）神经元质膜荧光染色法这类染料是利用它们能溶于细胞膜脂层内并在膜内扩散的特点。可用在活体或固定的标本上追踪纤维联系。这类染料中DiI、DiA和DiO最常用。主要优点是可用于固定标本，一些难以在活体注射的小核团在固定标本上常比较容易做到。缺点是其在膜内扩散的速度很慢，而且有效距离

11、比较短，因此最适用于胚胎或小动物。.免疫组织（细胞）化学法 20世纪70年代，免疫组织化学技术被引入脑研究领域，它以特异性强、灵敏度高的特点，使神经元内所含的神经活性物质、受体和转运体可视化，给形态学研究开辟了新的途径。.基本原理 利用免疫学中抗原与抗体特异性结合的特点以及组织化学的原理，在组织或细胞标本中加入特定的标记抗体，然后对标记物进行显示，从而对组织或细胞内的抗原物质进行定性、定位或定量研究。免疫酶技术显示Caspase-3免疫荧光技术显示MOR.因为抗原与抗体的结合是高度特异的，所以免疫组织化学方法具有高度的特异性、灵敏性和精确性。免疫组织化学的抗原通常是肽或蛋白，有数量不等的抗原决

12、定簇。抗原决定簇由暴露于抗原表面、在空间上相邻的3-8个氨基酸组成。一个抗原上可以有多个抗原决定簇。故由此而产生的抗血清中可能含有针对不同决定簇的多克隆抗体。用杂交瘤技术可以制成针对单个决定簇的单克隆抗体。抗体仅识别特定的抗原决定簇，而不识别抗原本身，因此不同物质只要有相同的抗原决定簇，均可被同一抗体识别，所以在免疫组织化学法中应注意抗体的特异性及交叉反应。. 抗体（antibody, Ab）机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末B 细胞浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。是介导体液免疫的重要效应分子。典型的免疫球蛋白分子呈Y字型，由两条相同的重链（heav

13、y chain, H）和两条相同的轻链（light chain, L）借二硫键连接而成。在氨基端，重链的1/4和轻链的1/2氨基酸序列变化很大，为可变区（variable region, V）；其他部分氨基酸序列相对恒定，为恒定区（constant region, C）。.Fab即抗原结合片段（fragment antigen binding），由一条完整的轻链和部分重链（VH和CH1）组成。该片段具有单价抗体活性，能与一个相应的抗原决定族特异性结合。Fc即可结晶片段（fragment crystalline），Fc段含有两条重链C端的一半，包含CH2和CH3两个功能区，它无抗体活性。Ig在异

14、种间免疫所具有的抗原性主要存在于Fc段，同时Fc段还具有活化补体、亲细胞、通过胎盘和介导与细菌蛋白结合等生物学活性。用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可将其裂解为两个完全相同的Fab和一个Fc片段。 . 多克隆抗体（polyclonal antibody, PcAb） 大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克隆抗体是多个抗原决定簇刺激机体后，由多个免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混合物。 PcAb 特异性差，易出现交叉反应。.由单一克隆B细胞杂交骨髓瘤细胞产生的，只识别一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。

15、优点：结构均一、纯度高、特异性强、效价高、易大量制备。制备单一表位特异性抗体的理想方法是获得针对单一表位的浆细胞克隆，使其在体外扩增并分泌抗体。但浆细胞在体外的寿命较短，也难以培养。于是，将可产生特异性抗体但短寿的浆细胞与无抗原特异性但长寿的恶性浆细胞瘤细胞融合，建立了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞和单克隆抗体技术。 单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）. 组织（细胞）化学是介于细胞学与化学之间的一门科学。细胞化学的目的是使用细胞学和化学的方法使细胞（组织）内的某些化学成分发生反应，在局部形成有色反应物，藉此对各种活性物质在显微镜水平进行定性、定位和定量分析。 酶组织

16、化学：利用酶对底物的催化作用，使底物发生颜色变化，其次对该酶进行定位、定量分析。. 在应用组织化学技术显示组织和细胞内化学物质及定位和定量以及代谢状态时，需要满足以下要求：保持组织和细胞形态结构的良好状态，以便反应产物的定位精确。如果形态结构破坏而失真，则定位困难。具备一定的特异性，以便获取正确的实验结果。具备一定的灵敏性，以便含量极微的物质也能被显示出来。 生成的反应产物必须是有色沉淀，颗粒微细不溶，定位于原位。反应物沉淀的颜色深度与相应物质含量或酶的活性具有一定的量效关系。反应产物具有稳定性，以便于重复观察要有重复性。 选择的试剂必须是分析纯，对被检测物质或酶应无任何影响；实验所用器皿必须

17、清洁无污染杂质，使用的蒸馏水应为双蒸水。为了保证实验的可靠性、科学性，防止假阳性的发生，必须同时作对照实验。.免疫组织化学的技术分类 根据AgAb结合方式分成： 直接法 间接法 多层法 根据染色方式分成： 贴片染色 漂浮染色.按标记物的性质分成：免疫荧光技术（免疫荧光法）免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、 ABC法）免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）标记物必要性：组织细胞内AgAb结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。所以需要用标记的方法将某种标记物（如酶、荧光素）结合到抗体上，再用组织化学方法显示此标记物或在荧光显微镜下观察荧光素发出的荧光。

18、.常用标记物 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate, FITC） 荧光显微镜下呈绿色荧光；Texas red 荧光显微镜下发红色荧光 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 生物素：Biotin 铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）.应 用 凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位，进而深入研究其

19、功能。.免疫组织化学染色的基本过程固定：由于在进行免疫组织化学反应时，蛋白质或肽类在体内易分解，并从活体存在的部位流失，而必须尽可能在接近活体的状态下，在尽可能短的时间内用固定剂将之交联起来，在原位固定那些物质。常用的固定液包括甲醛、多聚甲醛、戊二醛等。制片：切片（冰冻切片对抗原保存性好，石蜡切片，树脂切片，震动切片）、铺片（视网膜）、细胞爬片反应.固定方法：推注，滴注滴注步骤： 1、开胸 2、暴露心脏 3、自心尖剪开左心室 4、插入灌流针至主动脉弓 5、固定灌流针 6、快速注入冲洗液（有时可免） 7、先快后慢注入固定液 8、慢注毕，将动物装入含 有少量固定液的塑料袋 置4C冰箱内静置2h后取

20、材.染色方法ABC法PAP法.荧光标记免疫组织化学酶联免疫组织化学.1、免疫荧光细胞化学染色方法（1）直接法 荧光素直接标记在特异性第一抗体上，荧光素标记的抗体直接与组织切片上相应的抗原结合，一次孵育成功，在荧光显微镜下观察检测抗原。 优点：简单，时间短，特异性强。缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。应用：基本不用了.（2）间接法 先用第一抗体孵育组织切片，在第一抗体与组织中的抗原结合后，再用荧光素标记的第二抗体孵育，第二抗体是抗产生第一抗体的动物（如兔、羊、小鼠等）的IgG的抗体。通过上述步骤用荧光素标记的第二抗体与第一抗体结合的方法来间接显示抗原所在的部位。 优点：较直接法灵敏，而且只

21、需标记一种抗IgG抗体即可鉴定多种抗原。.免疫荧光双标记法（1）直接法甲荧光标记的抗甲抗原抗体乙荧光标记的抗乙抗原抗体甲抗原乙抗原.（2）间接法甲抗原乙抗原抗甲抗原抗体抗乙抗原抗体乙荧光标记的第二抗体（二抗）甲荧光标记的第二抗体（二抗）. 两种第一抗体需来自不同种属的动物。将两种第一抗体混合后与组织孵育，然后用不同荧光素（如FITC和Texas Red）标记的二抗混合孵育，各自与其一抗结合。两种荧光素在荧光显微镜下发出不同荧光，可以更换滤色片系统分别进行观察。.免疫荧光双标记法的应用：1.将两种抗体分别用不同的荧光素加以标记，用来显示含有不同成分的两种细胞在同一区域的定位模式激光扫描共聚焦显微

22、镜观察.免疫荧光双标记法的应用：2. 将两种抗体分别用不同的荧光素加以标记，用来定位同一细胞内存在的两种不同成分.2、免疫酶组织化学染色方法 用酶标记抗体和用组织化学方法显示结果，间接的对抗原物质进行定位。酶类标记物满足的条件：酶催化底物必须是特异的，并容易被显示（产物易于镜下观察）；酶反应形成的终产物必须是稳定的沉淀，不能从酶活性部位向周围组织弥散；容易获取（纯）；中性pH值时，具有稳定性；酶标记至抗体上不影响酶和抗体的活性。 .常用酶类标记物辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP），H2O2和DAB（diaminobenzidine, 二氨基联苯胺）为其常用

23、底物，产物为稳定的棕黄色沉淀.碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP）：BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate，5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐) 和 NBT（Nitro-Blue-Tetrazolium，四氮唑蓝）是AP的常用底物组合，其中，NBT作为氧化剂, BCIP作为AP底物。BCIPBCIP被AP水解成一种蓝色的中间物，后者然后被NBT氧化形成二聚体（不溶性紫蓝色沉淀）。.（1）PAP法 过氧化物酶抗过氧化物酶（Peroxidase anti-peroxidase method, PAP）法PAP作为特异性显色基团。

24、每个PAP复合物含个抗HRP的IgG分子及个HRP分子。DAB作为供氢体，HRP在H2O2存在的情况下，能使DAB发生氧化，生成不溶性棕褐色反应产物沉淀，定位在抗原所在处。首先，特异性第一抗体（多为兔、羊或小鼠IgG）孵育组织切片。其次用抗第一抗体的抗体（如羊抗兔IgG 或驴抗小鼠IgG ）作桥接。然后用PAP复合物与桥抗体结合。最后，用HRP的底物来显示PAP复合物。.优点：灵敏度高，所用第一抗体的浓度可低于间接荧光法倍左右，并可长期保存。注意：桥抗体IgG分子有两个Fab段，一个与第一抗体结合，另一个与PAP复合物结合。桥抗体的两个Fab段是相同的，因此第一抗体及PAP复合物中的抗HRP抗

25、体必须来自同一种动物。.（2）ABC法卵白素-生物素- HRP复合物染色法（Avidinbiotinylated horeseradish peroxidase complex method，ABC法） Avidin：卵白素，一种糖蛋白，每个分子上有4个与生物素亲和力极高的结合位点，可以结合4个生物素。Biotin ：生物素，为一小分子维生素，易于很多生物分子交联。ABC是卵白素-生物素结合的 HRP复合物的简称，每一个卵白素分子上结合个带HRP 的生物素，留出一个能与其他生物素结合的空位。ABC复合物HRP卵白素生物素.ABC法是在第一抗体反应后，用生物素结合的IgG抗体（ biotinyl

26、ated IgG）桥接。然后用ABC孵育，使桥抗上的生物素与ABC中卵白素上的空位结合。最后仍用HRP的底物呈色。B-IgGABCHRP卵白素生物素优点：由于生物素与卵白素间的亲和力极强，故ABC法比PAP法灵敏度更高。操作时间短，可长期保存。注意： ABC复合物与桥抗体之间是通过生物素结合的，因此ABC复合物没有种属特异性，可适合于任何种类的第一抗体。当然生物素结合的第二抗体必须是针对第一抗体属性的。.荧光显微镜在照明系统的光源中使用高压汞灯提供全波段激发光为延长汞灯寿命，打开后不可立即关闭（至少15min），以免水银蒸发不完全而损坏电极；汞灯关闭后则不可马上打开（至少30min），否则灯内

27、汞蒸汽尚未恢复液态，内阻极小，再次施加电压会引起短路，导致汞灯爆炸。.激光共聚焦显微镜用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。分辨率，是普通光学显微镜的3倍。用于观察细胞形态、细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。./hbchendl/article/i5275.htm.免疫组织化学染色的对照实验阳性对照，用已经证实的含有靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，免疫组织化学染色结果应为阳性，称阳性对照。证明靶抗原有活性，抗体的特异性高，染色过程中各个步骤以及所使用的试剂都合乎标准，染色方法

28、可靠。阴性对照，用确知不存在靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阴性。可排除染色过程中由于非特异性染色或交叉反应等因素造成的假阳性结果。 常用空白试验：即用稀释一抗的稀释液， 如10% NSS等，或 PBS替代一抗，反应应呈阴性；检查显示系统本身能否使组织染色。 替代试验：正常兔血清或 正常羊血清代替兔抗血清或羊抗兔IgG，反应应呈阴性；吸附实验：先将抗体与过量的与其针对的抗原（通常用10-6M）混合孵育，两者形成特异性结合，再用结合后的混合物孵育切片，染色结果应为阴性。若染色结果仍为阳性，则为非特异性染色。此法可证明待检组织切片的阳性结果是该抗体与组织内靶抗原特异性反应的结果。.免疫

29、组织化学法中的交叉反应抗体仅识别特异的抗原决定簇而不识别抗原本身，具有相同抗原决定簇的不同物质可以和同一种抗体结合。解决的最可靠的方法是将抗体用可能与之有交叉反应的抗原吸收，去除有交叉反应的抗体后，再用作免疫染色，或用已证明没有交叉反应的单克隆抗体。制成针对抗原不同片段的抗体，如各抗体均得出相同的染色结果，则存在交叉反应的可能性要小得多。但是，无绝对对照实验，其结果也是相对的。.原位杂交组织化学法 原位杂交组织化学（In situ hybridization histochemistry，ISHH）是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记

30、物相应的检测系统通过组织化学或免疫组织化学在核酸原有的位置进行细胞内定位。.原位杂交组织化学法创于1969年。在神经形态学研究中，ISHH法主要用于显示细胞内的mRNA。此法目前很成熟，其灵敏度已达到可以显示细胞内仅几个拷贝的mRNA的程度。ISHH法是用标记的单链核酸探针与组织切片反应的方法。.探针的类型1）按标记物 放射性探针（32P、35S及氚） 非放射性探针（生物素、碱性磷酸酶等物质标记的探针）2）按核酸性质 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 分别于组织内相互补的mRNA结合，形成DNA- RNA或RNA- RNA杂交体。.cDNA是指与mRNA互补的DNA链，由克隆技术产生，原

31、位杂交的特异性强，比RNA探针简便，应用较广。主要缺点是cDNA探针通常是双链的，必须在使用前加温，使之分离成两条单链，其中之一条为cDNA链，能参与杂交。但无关DNA链可以和cDNA链重新结合（退火），在杂交过程中与mRNA争夺cDNA，而且其与cDNA链的结合可能比与mRNA的结合更容易。.RNA探针也是由克隆技术产生，技术上比cDNA困难。其优点是所产生的探针是单链的，不存在退火问题，因此灵敏度更高， RNA- RNA结合还比DNA- RNA结合稳定。寡核苷探针是人工合成的一段与mRNA互补的短核苷链。短探针有利于透入组织，寡核苷探针的制备容易，针对性强，因而特异性强。但由于探针短，其与

32、mRNA结合不够牢固，故杂交及杂交后清洗的条件不能太苛刻。.原位杂交组织化学技术的基本方法 由于核酸探针的种类和标记物的不同，故具体应用技术方法上有差异，但基本方法和应用原则大致相同。大致可分为： 杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等； 杂交； 杂交后处理； 显示（visualization）：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。.固定 原位杂交组织化学技术（In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH）在固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面：保持细胞结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；使探针

33、易于进入细胞或组织。 DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。 在固定剂中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。 .玻片和组织切片的处理 玻片的处理玻片包括盖片和载片应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在150或以上过夜以去除任何RNA酶。由于ISHH的实验周期长，实验程序繁杂，因此，要应用粘附剂预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致脱落。多聚赖氨酸液具有较好的粘附效

34、果。.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性 增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂（detergent）或称清洗剂Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。这种广泛的去蛋白作用可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低RNA的保存量和影响组织结构的形态，因此，在用量及孵育时间上应慎为掌握。 蛋白酶K（Proteinase K）的消化作用在ISHH中是应用于蛋白消化的关键步骤，其浓度及孵育时间视组织种类、应用固定剂种类、切片的厚薄而定。一般应用酶k 1g/ml(于0.1mol/l Tris/50mm

35、ol/L EDTA, pH8.0缓冲液中),37孵育1520min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。 在蛋白酶K消化后，应用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以终止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂。为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定。 .减低背景染色 杂交后（Posthybridization ）的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。 预杂交（Prehybridization）是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交

36、点的目的，从而减低背景染色。 防止RNA酶的污染 在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温（240）烘烤以达到消除RNA酶的目的。要破坏RNA酶，其最低温度必须在150左右。 .杂交（Hybridisation） 是ISHH中关键的而且是最重要的一个环节。 杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。加盖片的目的是防止孵育过程中的高温（50左右）导致杂交液的蒸发。杂交液的成分和预杂交液基本相同，所不同的是加入了标记的核酸探针和硫酸葡聚糖。 探针的浓度和长度，杂交的温度和时间。探针的长度，一般应用于ISHH探针的最佳长度应在50100个碱基之间。探针

37、短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。 杂交反应温度方面，甲酰胺起了极为重要的作用，从而有助于保持组织的形态结构。 硫酸葡聚糖的主要作用是促进杂交率，特别是对双链核酸探针。.杂交后处理（post hybridisation treatment） 杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。 在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。洗涤的条件如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。 显示（Visualization） a 放射性自显影 b 非放射性标记显示：碱性磷酸酶标记

38、探针杂交结果用硝基四氮唑蓝等底物显示。.对照实验同时设置证明特异性 由于mRNA分子仅由4种核苷组成，因此存在着不同mRNA分子有某些相同核苷片段的可能性。因此原位杂交也存在与免疫组织化学相类似的交叉反应问题。探针越短，交叉反应的可能性越大。 首先，在决定探针的碱基序列时，可用 Northern Blot法检查该探针能否识别正确的mRNA位置。.在组织切片上的对照可采用：用核糖核酸酶进行杂交前处理， mRNA应不再出现；用有意义探针在相邻切片进行杂交，应为阳性结果。用过量的未标记探针作竞争试验，标记探针的特异结合将大为减弱。在相邻切片对同一mRNA使用数种针对不同片段的探针进行杂交，能否得到同

39、样结果。.原位杂交法和免疫组织化学法都是显示细胞化学成分的方法，两者相辅相成。两者的一个共同问题是反应的特异性问题。两种方法的互相印证可以彼此作为其特异性的证据。原位杂交法能更确切地反映某种物质表达的调节。mRNA量的消长通常反映了其表达的下调和上调，而免疫组织化学虽然也能反映细胞内物质的量的变化，但这种变化可以是由于其在细胞内合成量的变化，也可以是其从胞体释放或被代谢、分解量的变化。.受体定位法神经活性物质担负着在神经元间传递信息的作用，在其所作用的神经元上（内）存在着特异性地与某一具有特定构造的神经活性物质特异性结合，而使其发挥调节效应的物质，称为受体。受体不仅分布在细胞体的胞膜上，也存在

40、于树突、轴突等的膜上，还存在于胞核和胞浆内（儿茶酚胺类和肽类等亲水性物质的受体存在于胞膜上，类固醇激素等疏水性物质的受体存在于胞核或胞浆内）。免疫组织化学法：用针对受体的特异性抗体原位杂交法：已知受体的氨基酸序列，人工合成针对它们的特异性分子探针。配体法：主要在组织切片上进行，利用标记的配体和受体结合以示踪其部位。配体是与受体有亲和力的物质的总称。此法目前很少用。.（二）生理药理学方法1、神经递质释放量的测定2、神经递质功能的测定 3、行为学方法.1、神经递质释放量的测定（1）推挽灌流（2）脑内微透析术（3）伏安法（4）微穿刺术（5）脑片. 在中枢神经系统中，复杂的神经联系要通过突触来传递。当

41、动作电位到达突触前末梢时，突触前膜去极化，Ca2+内流，引起突触前膜内神经递质的释放，神经递质进入突触间隙后，通过扩散到达突触后膜，与位于突触后膜上的受体结合，引起突触后神经细胞的功能状态发生变化。从生理功能上来看，神经递质的释放是整个神经递质代谢各环节中的最重要的一环，它代表了中枢神经系统功能的主要方面。.神经递质释放的动态变化可用在体和离体方法进行研究。推挽灌流是在体研究中枢核团递质释放的有用方法，通过推挽灌流套管，使灌流液直接灌流脑组织，从流出液中分析神经递质的变化。脑内微透析术是在推挽灌流基础上发展起来的新技术，其特点是灌流液在半透膜管内流动，不与脑组织直接接触，可测定脑组织细胞外液中

42、不同生理状态下基础的、对药物反应的神经递质及其代谢产物释放量及其变化。伏安法是应用微电极测定脑内的生物胺及其代谢产物的方法，其时间分辨率比脑内微透析术高。微穿刺术能快速、简便获取脑核团组织进行化学测定。同位素标记脑片是离体研究神经递质释放过程及其机制的重要手段。.在体研究特定脑区或核团递质释放的方法，通过推挽灌流套管，使灌流液直接灌流脑组织，从流出液中分析神经递质的变化。实验装置由三部分组成：灌流液泵和进液系统、灌流探头、灌流液收集系统。灌流液泵和进液系统由一个恒速泵和进液管组成。灌流液在恒速泵的推动下通过进液管进入到灌流探头内。灌流液通常为人工脑脊液。为减轻对脑组织的刺激，灌流时灌流液通常维

43、持在36-37。灌流探头有多种形式，并列式推挽灌流探头结构较简单，但对脑组织损伤较大。同心圆式推挽灌流探头对脑组织损伤较小，是目前国内外常用的灌流探头。（1）推挽灌流.同心圆式推挽灌流装置由直径不同的同心圆不锈钢内、外套管和灌流泵组成。灌流时，灌流液经内套管进入局部脑组织，再由外套管经侧管吸出流入收集器。为了防止套管末端处的负压对脑组织的局部抽吸作用，减少脑组织的损伤，在外套管与侧管交接处开一小孔，在抽吸灌流液时让空气从小孔进入侧管，避免套管末端形成负压。. 收集的样品可通过高效液相层析、放射免疫测定等方法进行测定。两个问题：1 推挽灌流时，灌流液直接与脑组织接触，可能造成灌流部位脑组织的损伤

44、；2 脑组织所释放的各种化学物质，包括各种蛋白质、多肽、氨基酸和小分子化学物质均可进入灌流液中，为测定灌流液中的特定神经化学物质带来干扰。 因此，发展起来一种新的脑组织灌流技术，即脑组织微透析方法。.（2）脑内微透析术脑内微透析术是在特定的脑区内，植入由透析膜组成的透析管。当用灌流液持续灌流透析管时，待测的物质可顺浓度梯度进行扩散，或从脑组织的细胞外液进入透析管，或从透析管扩散至细胞外液，通过收集灌流液，测定其中的待测物质的含量，就可监测该物质的含量变化。脑内微透析时可以选用通透性不同的透析膜，以选择性地允许分子量在某一范围内（小于透析膜孔径）的化学物质通过透析膜进入灌流液中。所以，脑内微透析

45、所能监测的神经化学物质主要是一些分子较小的神经递质和较小的神经肽，如去甲肾上腺素、多巴胺、脑啡肽等。.脑内微透析术的装置包括探头、导管、微量灌流泵、样品收集器和定量分析仪等。探头由流入管、流出管和中空纤维管构成。中空纤维管是能通过最大分子量为5000-50000的物质的透析管。探头按植入的方式可分为跨脑探头、U型探头和型探头。所有探头的植入均根据脑立体定位图谱，借助脑立体仪进行。.常用透析液是人工脑脊液，透析的速度一般为0.1-10l/min。样品的采集一般在透析开始后30-60min开始，这时透析液中的神经化学物质的回收率趋于稳定。注意灌流液中钙离子浓度要合适，过高或过低都会影响神经递质的释

46、放和更新。分析结果时注意，所得结果仅仅是神经末梢释放到突触间隙的神经递质浓度的平均变化，这是以分钟或小时为单位时间的变化，而不能检测突触间隙神经递质浓度的瞬时变化。.应用测定体内不同脑区各种内源性化学物质的浓度；刺激不同核团或神经通路对不同脑区神经递质的释放量的影响；动物自然行为的变化以及外界各种刺激引起的反应与内源性神经递质释放的关系；研究脑内各化学系统的功能性的相互作用；研究药物对脑内化学物质的影响；通过测定体内回收率的变化，可研究神经递质的释放和摄取及它们的调节；研究影响脑化学的病理变化如脑缺血时脑组织内的兴奋性氨基酸含量的变化等。.（3）伏安法 活体内包括脑内的细胞外液中存在一些具有氧

47、化还原电活性的物质，如生物胺神经递质（去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺） 及它们的代谢产物、抗坏血酸、尿酸、谷胱甘肽等。若在细胞外液中加入2个电极，接通电源，在电极处就会出现电解反应（在阴极出现氧化反应）。应用微电极进行电解，并记录电流-电压曲线（又称伏安图），这个过程称为伏安法。.基本原理.递质释放的动态过程.测量仪器与设备碳纤维电极： 聚丙稀微碳纤电极（细胞，脑片） 柱状碳纤电极（在体）膜片钳放大器（电压钳模式）数据采集接口卡计算机系统.优 点胞吐活动的检测不受胞吞活动重叠的干扰直接检测释放的物质量化测量单个囊泡的分泌实时监测无创伤测量.局限性可检测的物质：氧化电压小于1000m

48、V的递质分子（肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、组胺、抗坏血酸等）。 谷氨酸、乙酰胆碱、GABA、胰岛素等不能被检测。碳纤电极测量的只是直接与碳纤电极尖端相接触或距离小于5m 范围内的那些小泡分泌。只能测量胞吐但不能测量胞吞。 .恒电位（安培法，amperometry） 时间分辨率高三角波循环电压（伏特法，voltammetry） 能鉴别是哪种递质分子 但测量灵敏度比安培法低 因此，如果已知该细胞分泌的是哪一种递质，一般都使用安培法来记录细胞分泌。.碳纤电极性能测试1. 电学特性测试 电极尖端缓慢浸入生理溶液中, HP=780 mV。由于电极极化作用, 碳纤电极的检测电流( Iamp

49、) 波形会有一上冲。好的电极由于其漏电流很小, 在十几秒到几十秒后电流波形会降至10 pA 以内。.2. 电极氧化性能测试.3. 肾上腺嗜铬细胞分泌的检测和判定. 伏安法的优点是时间分辨率高，伏安法电极的反应时间短，可用于检测脑内单胺递质快速的动态变化。伏安法的碳素纤维微电极（一般在10-20m）远比脑内微透析中的微透析管（大于200m）口径小，可减少脑组织的损伤及可检测脑内小核团的神经活性物质。但微透析法中用HPLC检测样品，有很高的特异性，而且一次可同时检测多种神经活性物质，可同时了解不同物质的动态变化及它们之间的相互作用，这是伏安法难以做到的。.假递质标记法：原理是对于特定的分泌细胞，寻

50、找一种该细胞的分泌小泡内本来不存在，但分泌小泡能够自动摄取的“易氧化分子”。将该易氧化物质放到细胞外液中，待分泌小泡摄取足够易氧化分子后便可做CFE实验。电极涂层法：原理是对于待测量的特定递质，寻找一种能够选择性“催化”该递质的化学物质或生物酶，并将该物质“镀”到CFE 电极尖端，当递质分子到达CFE电极尖表面时，首先经“镀层”物质催化而在小于1000mV条件下氧化，氧化电流成为涂层CFE的信号。寻找高效率并且稳定性较高的涂层是本方法的关键。 .（4）微穿刺术微穿刺术是利用中空针管切取脑片中的特定核团，用于检测其化学成分，包括神经递质及其代谢产物等。动物处死后立即取出脑，迅速将所需的脑区作冷冻

51、切片。在显微解剖镜下，确定脑片中要切取的脑核团的位置，然后用中空针管穿刺脑片切取样品。然后，将样品进行适当的处理，如匀浆、超声波破碎或提取等，最后进行化学测定。能快速、简便获取脑核团组织进行化学测定。微穿刺术广泛应用于神经科学的研究。用于了解神经递质、神经肽、酶和受体等在脑区中的分布，测定这些化学物质在实验条件和病理条件下的改变。优点：操作简单快捷且非常可靠，有很高的解剖结构的分辨率，样品经过适当处理后可用许多分析技术进行测定。缺点：组织样品是在死后获得的；样品中的神经元失去了传入和传出的联系；在处理过程中如匀浆等会引起缺氧。.（5）脑片离体研究神经递质释放过程及其机制的重要手段。过程包括：

52、脑片制备：麻醉后取脑，将选择好的脑区切成脑片。 孵育：5CO2、95O2饱和的缓冲液，37。 标记脑片：孵育液中加入适量的含放射性同位素的神经递质或其前体标记脑片。脑片的神经末梢对这些物质应具有高亲和力摄取，使神经末梢的递质贮库被放射性物质选择地标记。.灌流装置释放量的测定：基础释放量去极化刺激引起的释放量：电场刺激高钾浓度去极化 最后检测流出液和组织的放射活性，或用HPLC检测。.2、神经递质功能的测定 突触前神经末梢的递质是以量子式释放的，其量很微小，因此在进行神经递质功能测定时，只能用最小而有效的剂量模拟神经递质的生理效应。 （1）微电泳：能将微量的神经递质导入神经元附近，观察其作用。（

53、2）抗体微量注射. 定义：借助微电极通以一定的电流将解离物质电泳到神经元附近，观察神经递质或其他药物对该神经元的作用。 基本原理：外加电流通过含解离物质溶液的微电极时，会将微电极内的解离物质从管尖释放出来。例如在微电极接正极，动物头皮接负极时，带阳离子的物质从微电极中释出。相反，微电极接负极，头皮接正极（内向电流）时，微电极释出的是带负离子的物质。微电泳时解离物质从微电极释出量，与它通过的电荷量成正比。因此，通常用微电极的电流强度表示解离物质的释放量。 方法：1）拉制微电极：五管：每管尖端直径1-3m, 五管总直径510m.其中，一管为纪录，一管为对照，三管为药物。若需作细胞内记录，则有一管应

54、较其他管略长，以便插入细胞内。 （1）微电泳 Microelectrophoresis. 药物管可根据实验需要，将神经递质或药物配成离子化溶液。为此常用稀释的NaOH溶液或HCl溶液制备，并调整溶液的pH值，使要作微电泳的物质呈阳离子或阴离子，以便微电泳时能将所需要的解离物质导入所要观察的神经元。 2）微电极充满溶液后，在立体定位仪帮助下，将微电极插至所需要观察的脑核团内的神经元附近。微电泳仪上的输出接头通过Ag-AgCl细丝插入微电极各管中，另一共用接头连在动物头皮上，是每一管电极与头皮电极之间形成回路。然后，立即施加滞留电流防止自发性外溢。微电泳时选择一定强度（nA）的电流通过微电极，微电

55、极中的解离物质释放量与通电电流强度成正比。.多管微电泳方法具有三大特点。第一，与离体实验相比，应用这种方法得到的实验结果能够提供整体条件下目标细胞功能状态的信息。第二，药物的作用范围很小，可以精确定位到一个或几个细胞的反应，所以用来研究药物对单个神经细胞的直接作用。第三，可以通过改变微电泳电流的大小来调节所施加药物的量。.Microionphoresis:This methods enables a researcher to apply very small amounts of drugs or neurotransmitter candinates to the surface of n

56、eurons.应用：将神经递质或药物越过血脑屏障直接作用于神经元，甚至突触前膜和后膜，观察这些递质和药物对它们的作用。可以直接对所记录的神经细胞施加多种受体的激动剂或拮抗剂，确定该神经细胞膜上是否存在这种受体，激活或阻断这种受体引起神经细胞发生兴奋还是抑制。另外，还可将跨膜信号传导通路中某些关键因子如G-蛋白、第二信使等的激动剂或抑制剂通过微电泳方法施加到记录的神经细胞处，从而研究受体激活后的信号传导通路。. 基本原理: 抗体抗原中和反应。特异性抗体注射在某一脑区，可中和神经末梢释出而进入突触间隙的神经肽，防止其与受体结合。因此，用此方法可解释消除该神经肽的生理效应的结果，从而推测内源性神经递

57、质的作用。 中枢内直接注射法包括：脑室内注射，通过脑内埋植慢性套管和脊髓蛛网膜下腔慢性插管进行恒速微量注射等方法，或通过玻璃微电极向被纪录的神经元附近微量注射。 （2）抗体微量注射.3、行为学方法经典条件反射操作式条件反射 动物必须完成某种运动或操作后才能得到强化。例如，将大鼠放入实验箱内，当它在走动中偶然踩杠杆时即喂食，以强化这一操作，如此重复多次，大鼠即学会自动踩杠杆而得食。踩杠杆这样一个特定的动作就是条件反应，简称反应。操作式条件反射代表了反应与强化之间的关系。 .（三）生物化学方法 神经科学中，生物化学方法的主要任务是分离和分析神经组织以及与神经活动有关的种类繁多的化学组分，特别是诸多

58、的神经递质、调质、激素、生长因子及其受体，这些物质的含量极微，有些组分很容易失去活性。因此，和其他领域比较，更需要用温和的、高回收、高分辨和高灵敏度的分离分析方法。.1、层析分离技术2、放射免疫测定法3、酶联免疫吸附法4、免疫印迹法. 层析，也称为色谱分析，是一种分离技术，其基本原理是利用不同的物质在两个相（即固定相和移动相）之间具有不同的分配系数，即不同物质和固定相缔合的紧密程度以及用液体（即移动相）淋洗时被洗脱的难易程度的不同，而达到将样品中所含的各种物质分离的目的。其优点是分离条件温和，有利于保持生物活性，并适合于大量制备。1、层析分离技术. 层析法进行时有两个相，一个相称为固定相(St

59、ationary phase )，通常为表面积很大的或多孔性固体；另一相称为流动相(Mobile phase ) ，是液体或气体。当流动相流过固定相时，由于物质在两相间的分配情况不同，经过多次差别分配而达到分离，或者说，易分配于固定相的物质移动速度慢，易分配于流动相中的物质移动速度快，因而得到逐步分离。.层析分离法基本原理.层析技术的分类 按两相所处的状态分类 以液体作为流动相的层析称为液相层析，以气体作为流动相的称为气相层析。 其固定相也可有两种状态，一种是以固体作为吸附剂的固定相，另一种是以涂布在固体载体表面的液体作为固定相。.层析气相层析（gas-chromatography）液相层析（

60、liquid-chromatography）气-固层析（gas-solid chromatography）气-液层析（gas-liquid chromatography）液-固层析（liquid-solid chromatography）液-液层析（liquid-liquid chromatography）.2.按操作技术形式分类.柱层析（colum chromatography） 将固定相装在层析柱中，使样品朝着一个方向移动，通过各组分随流动相流动而得到分离的方法。纸层析（paper chrmatography） 用纸作为液体的载体，样品点在纸上随后展开达到分离鉴定的方法。薄层层析（thin