食管鳞癌P16、P15基因杂合子缺失的研究

1、食管鳞癌P16、P15基因杂合子缺失的研究摘要目的：讨论P16和P15基因与ES发生开展的关系。方法：应用显微切割、PR、凝胶电泳、AgN3染色等技术，检测食管鳞癌ES和高级别不典型增生中P16、P15基因杂合子缺失LH，对照正常细胞，分析ES和高级别不典型增生组织中LH的变化，并就LH率与患者的临床病理参数分别进展单因素分析。结果：ES组织中的LH率为29.7%，高级别不典型增生组织中的LH率为16.5%。应用SPSS软件对LH率与患者的性别、组织分化、淋巴结转移进展单因素分析，差异均无显著性P0.05。结论：从正常鳞状上皮到不典型增生再到癌变的过程中存在基因的异常累积。P15基因可能与食管

2、鳞癌的发生开展相关。D9S162位点或其附近可能存在与ES开展相关的抑癌基因。关键词食管鳞状细胞癌；P16；P15；抑癌基因；杂合性丧失Abstratbjetive：TinvestigateP16prtEinexpressin,einfertherleandlinialsignifianefP16geneduringtheurreneanddevelpentfhepatellulararina.ethds：P16prteinexpressinasquantitativelydeterinedbyiun-histheistryin26asesfhepatellulararina.Siultane

3、uslyadjaentturtissueserentrasted.Results：P16prteinexpressinin26asesfhepatellulararinaassignifiantlylerthanthatinadjaentturtissues.TheexpressinfP16prteinbeesleriththeinreaseingrading(P0.05).nlusins：ExpressinabsenefP16geneexistinpartfHell,hihayberelatedithdevelpentandhist-differentiatinfH.P16prteinays

4、erveasanindiatrtpredittheprgnsisfpatients.KeyrdsHepatellulararina;P16gene;Iunhistheistry食管癌分子生物学研究证明E中存在一些有规律的染色体改变。P16和P15基因定位于9p21，是目前公认的抑癌基因，但其与ES发生开展的分子机制尚不非常清楚。我们通过显微切割、PR、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、AgN3染色等技术，检测食管高级别不典型增生和鳞癌组织中P16、P15基因上3个微卫星位点的LH情况，并就LH率与患者的临床病理参数进展相关分析，讨论ES发生开展过程中基因的变化，为ES的早期诊断及预防提供一定的根据。1材

5、料与方法1.1材料45例ES标本均伴有高级别不典型增生及正常组织均来自山西省肿瘤医院，按照世界卫生组织2022年新标准进展病理分级、分期。所有标本术后立即无菌取材，70%酒精固定，石蜡包埋，同时搜集病人有关的临床病理资料。1.2主要试剂及仪器主要试剂购自美国ResearhGenetis公司；基因扩增仪：T-48/Ht美国；高压电泳仪：E3000-90(美国)。1.3制片选定具有鳞状细胞癌、高级别不典型增生及正常组织的蜡块，切取5厚的切片假设干张，取其中1张做HE染色，供判断病变部位和显微切割参照用。其余切片采用改进HE染色：常规脱蜡,去离子水冲洗1次；快速伊红染色,去离子水冲洗2次，浸泡在10

6、%的甘油TE缓冲液中待用。1.4显微切割并制备目的DNA将改进HE染色的组织切片置于显微镜工作台上，根据HE染色切片所示区域，在低倍显微镜下找到目的细胞区，用一次性的无菌皮试针头在被切割组织周围刻划，将目的细胞与周围组织别离，然后用针尖粘取纯目的细胞组织，分别放入已标记好的盛有1%蛋白酶K消化液的eppendff管中。37恒温消化24h48h，95灭活蛋白酶K10in，离心后取上清制成样本DNA液，4保存。1.5PR扩增反响体系：10L包括ddH25.7L、10buffer液1.0L、dNTP2.5L/L0.8L、引物20L/L0.2L、Taq酶5U/L0.1L、待扩增样本DNA液2.0L；反

7、响条件：95变性10in、95变性1in，55退火1in，72延伸1in，35个循环、72延伸10in；取出PR反响管后立即放入冰盒中，6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：取40%聚丙烯酰胺母液15L，参加尿素48g，5%TBE20L，加水至100L；用前取上述液80L，参加500L的APS和35L的TEED混匀。电泳液为1%TBE缓冲液。60,1800V电泳1.5h2.5h。AgN3染色，室温凉干。1.6结果判断当正常组织扩增产物为2条分开的主要条带时，说明此位点为杂合性，判为有意义的信息个体。肿瘤条带中的一条信号强度与其正常对照组织相应产物比拟，如减弱50%以上或消失，判断为杂合性丧失；与正常对照

8、相比，如显示两个密度相似的条带，判为未丧失；当样本的正常对照组织的扩增产物仅为1条时，说明此位点为纯合子，为非信息个体。2结果45例伴有高级别不典型增生的ES患者，男29例，女16例；年龄41岁70岁，平均年龄为65.2岁；高分化5例,中分化34例,低分化6例；15例伴有淋巴结转移。2.1等位基因的LH分析45例ES标本中3个微卫星点的检测结果见图1、表1。表145例伴高级别不典型增生的ES患者的LH检测结果略食管鳞癌P16、P15基因杂合子缺失的研究有信息的病例中，食管鳞癌总LH率为29.7%，高级别不典型增生总LH率为16.5%；在食管鳞癌组织中，3个微卫星位点的LH率依次为D9S1713

9、6%、D9S16236%、D9S174817%；在高级别不典型增生组织中，3个微卫星位点的LH依次为D9S17129%、D9S16215%、D9S17487%。其中，第6例患者的D9S162位点，在高级别不典型增生组织中出现了LH，而在相应的鳞癌组织中却未出现LH。2.2临床病理参数分析应用SPSS11.0软件对LH检测结果与患者的性别、病理组织学分化及淋巴结转移进展单因素分析未见明显相关性P0.05，故未再进展多因素分析。3讨论食管癌的发生是环境因素和宿主因素互相作用的结果，涉及多因素的作用、多基因的变化和多阶段的开展过程，其中一项重要的遗传变化就是多种抑癌基因的失活和癌基因的激活，研究发现

10、抑癌基因的失活常伴有邻近DNA多态标记的丧失,假设观察到癌组织的某一染色体区域频发的LH,此现象提示目的区域可能存在与所研究的肿瘤相关的抑癌基因。P16和P15属于INK4I(ylin-dependentkinase4inhibitrs)家族,都定位于9p21，在细胞周期G1期调控细胞增生。P16蛋白为DK4特异性抑制剂，通过与细胞周期素D-DK4复合物严密结合或与DK4结合竞争性地阻断细胞周期素D-DK4复合物的形成，维持RB蛋白非磷酸化状态，阻止细胞从G1期进入S期，抑制细胞增殖。P15从P16别离而来，与P16有95%的序列一样，P16的改变往往伴有P15的改变，目前已被认为是另一个具有

11、研究意义的新的抑癌基因。P16和P15通过不同的机制失活2，3，P16失活占优势作用的是启动子区PG岛异常甲基化，突变和纯合性缺失相对较低，而P15常发生纯合性缺失。对某种肿瘤的抑癌基因此言，假设受检病例中的25%以上发生LH可视为有意义4。有关9p21区域的LH在各种肿瘤中可见报道，但检测结果很不一致。Hu等5通过对56例ES患者9p21p22上多个微卫星位点LH的检测，并就其与DKN2A(P16)和DKN2B的相关性分析认为，DKN2A的突变和基因内的等位基因丧失在ES的演进中都起着重要的作用。本实验检测了与P16基因严密连锁的D9S1748位点的LH情况，结果显示其在高级别不典型增生中L

12、H率为7%2/30，在癌组织中LH率为17%5/30，提示该位点与食管癌早期的发生关系较少。我们检测的另一个位点D9S171，距9号染色体短臂末端42，是距P16较远的着丝粒侧的微卫星位点，座位于P15基因，故D9S171的LH也就意味着抑癌基因P15的丧失。D9S171的LH在诸如头颈癌、肺癌、宫颈癌、食管癌等人类肿瘤中都被检测到，但LH率上下不一，因此推测15的失活可能在各肿瘤中发挥的作用不尽一样。Xingetal.2通过对中国食管癌高发区林县的60例ES的研究认为P15附近的D9S171的LH率很常见47%。王全红等6等研究发现无论在食管癌高级别不典型增生组织还是癌组织中，该位点都存在较

13、高的丧失率33%，33%。本实验检测到该位点在高级不典型增生和癌组织中的LH率分别为29%和36%，结论与前者相一致，提示P15基因可能与ES的发生开展相关。D9S162(9p22p23)距P16编码区6，是距P16较远的端粒侧的微卫星位点。有关D9S162的LH报到较少，早期报道9p22p23区域存在着很高的LH(41.9%),提示该位点附近可能存在着食管癌抑癌基因。Lihun等7对食管癌9号染色上的17个多态性标记的LH情况进展了检测，其中9p22p23区域观察到缺失42.9%，我们检测的结果为36%,结果与前者一致，提示该区域可能存在有与食管癌开展有关的抑癌基因。食管癌是一系列组织病理改

14、变的结果，典型的病理改变包括食管炎、单纯增生、轻度到重度的不典型增生、原位癌，直至最终形成浸润癌，每一步骤包含着许多分子程度的改变。本实验显示正常组织中未发生LH，高级别不典型增生总LH率为16.5%，食管鳞癌总LH率为29.7%，并且各位点随着病变的加重LH都有不同程度的增加，说明在从正常鳞状上皮到不典型增生再到癌变的过程中存在基因的异常累积。总之，LH的检测对筛癣定位和克隆食管癌相关的抑癌基因提供了一个很好的手段，食管癌的发生可能是众多失活抑癌基因协同作用的结果。参考文献TavassliF.A.,DevileeP.rldHealthrganizatinlassifiatinfTurs.IA

15、RPress,Lyn，2022，261.2XingEP,NieY,angLD,etal.AberrantethylatinfP16INK4aanddeletinfP15INK4barefrequenteventsinhuanesphagealanerinLinxian,hina.aringenesis，1999，20:7784.3TkugaaT,SugiharaH,TaniT,etal.desfsileningfP16indevelpentfesphagealsquausellarina.anerRes.2002，62:49384944.4uzeauF,FlejuJF,ThasG,etal.Lssfheterzygsitynhrse9andP16(ST1,DKN2)geneutatinsinesphagealaner.IntJaner.1997，72:2730.5HuN,ang,SuH,etal.HighfrequenyfDKN2Aalteratinsinesphagealsquausella