重组变构人TRAIL联合柔红霉素对白血病细胞诱导凋亡作用及其机制

1、重组变构人TRAIL团结柔红霉素对白血病细胞诱导凋亡作用及其机制张学军温丽王福旭罗建民潘崚刘小军杜行严董作仁杨世芳【摘要】为了研究重组变构人肿瘤坏死因子相干凋亡诱导配体rebinanatutanthuanTRAIL,rhTRAIL单用及与柔红霉素DNR团结应用对白血病细胞株U937、K562的诱导凋亡作用及其机制，以正凡人胚肺成纤维细胞株R-5作比较，接纳TT法检测体外造就的U937、K562白血病细胞株在rhTRAIL单用和团结DNR作用下增殖的按捺效应；用半定量逆转录多聚酶链反响RT-PR法检测DNR处置惩罚前后白血病细胞TRAIL殒命受体和诱杀受体的RNA表达程度。结果表白：rhTRAI

2、L对白血病细胞株U937、K562有较显着的按捺增殖作用，DNR与TRAIL团结对按捺肿瘤细胞具有协同性，与各药单独利用比力均有明显差异P0.05；经DNR作用后，U937、K562细胞的殒命受体DR4、DR5程度上调，而两种诱杀受体DR1、DR2表达未受影响。结论：在体外rhTRAIL单用或与DNR联用均能显着按捺白血病细胞增殖，rhTRAIL与DNR对白血病细胞的杀伤有协同作用，其诱导机制大概与U937、K562细胞殒命受体DR4、DR5表达程度上调有关。【关键词】rhTRAIL；U937细胞；K562细胞；柔红霉素binedEffetfRebinantutantHuanTRAILandD

3、aunrubiininInduingApptsisfLeukeiaellandItsehanis肿瘤坏死因子相干凋亡诱导配体TNF-relatedapptsis-induingligand，TRAIL是新近创造的肿瘤坏死因子超家属成员,可特异性地诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无显着杀伤作用。野生型TRAIL在不变性、溶解性及生物活性等方面存在不敷，重组变构人肿瘤坏死因子相干凋亡诱导配体rebinantutanthuanTRAIL，rhTRAIL是由北京沙东公司对野生型TRAIL布局举行环化变构后的优化产物，补充了上述不敷。我们以正凡人胚肺成纤维细胞株R-5作比较，检测rhTRAIL单用及团结柔红

4、霉素daunrubiin,DNR对人急性单核细胞白血病细胞株U937、人慢粒红白血病变细胞株K562的促凋亡作用，并在RNA程度阐发化疗药作用前后其两种TRAIL殒命受体DR4、DR5deathreeptr4、5和两种TRAIL诱杀受体DR1、DR2deyreeptr1、2表达的变革，探究rhTRAIL治疗急性白血病的大概性及其机理，为rhTRAIL作为新的抗肿瘤生物制剂治疗血液体系肿瘤提供理论根据。质料和要领重要试剂细胞株及造就K562细胞株由本实行室提供，U937细胞株、R-5细胞株均引自北京沙东生物技能。3种细胞均在37、5%2恒温条件下饱和湿度造就箱中造就，K562、U937细胞株造就

5、液为含10%新生牛血清的RPI1640造就液，48小时传代1次；R-5细胞株造就液为含10%新生牛血清的E造就液，72小时胰酶消化传代1次，均选用对数生恒久细胞举行实行。细胞生长按捺率的TT检测单独用药取对数生恒久的K562、U937接种于96孔平底造就板，R-5用2.5g/L胰卵白酶消化，制备单个细胞悬液接种于造就板，均每孔200l终浓度为2105/l。别离各自参加终浓度为8、40、200、1000ng/l的rhTRAIL、DNR，比较组细胞加等量造就液，每个浓度孔接种3个复孔，造就24小时后参加20lTT5g/l，造就4小时，377.4g离心10分钟，弃上清，参加二甲亚砜DS200l，震荡

6、溶解甲月替结晶，酶标仪490n测光汲取值A，盘算细胞按捺率。公式为细胞按捺率=1-A处置惩罚组/A比较组100%联适用药对3个细胞组别离参加终浓度为8、40、200、1000ng/lDNR，然后每个DNR组别离参加rhTRAIL8、40、200ng/l，每个浓度孔接种3个复孔，孵育24小时后处置惩罚，结果的盘算同上。两药协同作用断定尺度接纳海内金正均氏公式1断定rhTRAIL和DNR化疗药物的联互助用是否具有协同性。公式：Q=EA+B/EAEBEAEB。EA为A药rhTRAIL单独处置惩罚的细胞按捺率，EB为B药DNR单独处置惩罚的细胞按捺率，EA+B为两药归并处置惩罚的细胞按捺率。Q值介于0

7、.85-1.15为单纯相加，介于1.15-2.0为加强，大于2.0为显着加强，介于0.85-0.55为拮抗，小于0.55位显着拮抗。TRAIL4种受体RNA表达的半定量RT-PR检测引物方案由北京赛百盛公司合成,序列如下：DR4(506bp)：上游5-TGAGAAGAGATGTGTA-3，卑劣5-TAAGGAAGGAGAGTGTGAT-3；DR5(502bp)：上游5-GTATGGAAATGAGATAAAGGTGGT-3，卑劣5-AAATTAAAGTAGAAAAGG-3；DR1(612bp)：上游5-GAAGAATTTGGTGAATGATG-3，卑劣5-TTTGGATTGGTGGGTTATGT

8、TT-3；DR2(453bp)：上游5-TTTTGGGGGTTATGTTT-3，卑劣5-GTTTTTAGGTTTTTGTAG-3；-atin(155bp)：上游5-TATAATTGGAATGAG-3，卑劣5-ATGTGTTGGGTAAGGT-3。细胞内总RNA的提取将U937、K562、R-5别离与200ng/lDNR配合孵育24小时后，网络细胞各约2105个，同时各以未处置惩罚过的细胞作比较，用PBS洗2遍。用TRIzL一步法提取细胞总RNA，在紫外分光光度计下测定吸光度A260/A280值。DNA合成取3gRNA，37中反响1小时、95反响5分钟逆转录合成DNA。RT-PR反响取3lDNA

9、于50l反响体系举行PR反响。DR4、DR5、DR1、DR2反响条件为95变性3分钟；94变性30秒，58退火45秒，72延伸60秒，40个循环；72延伸5分钟。内比较-atin的扩增条件：94变性5分钟；95变性60秒，55退火60秒，72延伸60秒，30个循环；72延伸10分钟。PR产物的检测和阐发上述扩增产物取6l在2%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像阐发软件体系对电泳条带举行光密度阐发，盘算各目的基因条带与内比较-atin产物条带灰度值之比。统计学阐发接纳SPSS11.0统计软件举行阐发。数据以均数尺度差XSD表现，多组数据比力接纳方差阐发，两组间比力接纳t查验。结果细胞增殖按捺率单独用药

10、雷同时间内，rhTRAIL随着作用浓度的增长，对K562及U937的细胞生长按捺率呈剂量依靠性增长P0.05表1；而对R-5细胞的生长按捺率为10.301.28%-14.902.89%，在差异浓度rhTRAIL组间均无显着差异P0.05。DNR对正常细胞和肿瘤细胞均有生长按捺作用，且表现为剂量依靠性，q查验比力组间差异具有统计学意义P0.05。Table1.InhibitinnK562，U937andR-5elllinesinduedbyrhTRAILrDNRalne(略)联适用药rhTRAIL团结DNR作用于3种细胞,对细胞生长按捺的影响见表2。在K562、U937细胞中联适用药组的按捺率与

11、单独利用rhTRAIL或DNR组比力皆有明显差异P0.05，随着药物作用剂量的增长，两种药物对K562、U937细胞的团结按捺作用呈加强趋势(P0.05)。用金正均氏公式阐发表现：在差异浓度两药联用后，K562细胞Q值介于单纯相加与加强以致显着加强之间0.980.13-2.750.18；U937细胞Q值介于单纯相加与加强之间0.820.12-1.240.13；而R-5细胞Q值介于拮抗与单纯相加之间0.590.09-1.010.13表3。由此可以看出，对付K562、U9372种细胞，联适用药均比两者单独用药结果好，而对付R-5联适用药无显着的协同结果。Table2.Inhibitinsnthre

12、eelllinesinduedbyrhTRAILbinedithDNR略Table3.SynergistieffetsfrhTRAILithDNRnK562，U937andR-5elllines略RT-PR检测处置惩罚前3种细胞受体的表达程度检测K562、U937及R-53种细胞4种受体RNA表达程度创造，3种细胞DR4和DR5RNA均有表达图1、2，DR4在K562表达最高，而DR5在R-5表达最高表4。DR1RNA仅在R-5较高表达(1.230.01)，K562、U937细胞未见表达图3。DR2RNA在R-5较高表达(1.780.01)图4，在K562、U937细胞表达较低别离为0.160

13、.01、0.310.01)P均0.05；且DR2在K562、U937细胞之间表达无差异P0.05。处置惩罚后3种细胞受体的表达程度变革3种细胞别离与DNR200ng/l配合孵育24小时后：K562、U937细胞的DR5RNA表达水均匀有进步P0.05，K562的DR4RNA表达程度也有进步，两种肿瘤细胞的诱杀受体DR2表达程度变革无影响表4；正常细胞株R-5的4种受体表达均未受到DNR作用的影响。Table4.ExpressinlevelsffurrhTRAILreeptrRNAsinK562,U937andR-5(略)DNR讨论TRAIL是由iley等2于1995年新创造的肿瘤坏死因子超家属

14、成员，它普及表达于多种正常构造和细胞2，3，通过与细胞膜上差异受体团结而发挥差异作用。如今已创造了5种受体，别离是DR4、DR5、DR1、DR2及可溶性受体steprtegerin，PG4。此中DR4、DR5是殒命受体，TRAIL与之团结后能诱导细胞凋亡；DR1、DR2及PG是诱杀受体，由于其布局缺乏胞内信号段，与TRAIL团结后细胞不克不及通报凋亡信号而躲避凋亡。因此，差异于其他肿瘤坏死因子TNF和Fas配体(FasL)对正常构造的非特异性杀伤作用，TRAIL能特异性的诱导肿瘤细胞产生凋亡。已有报道TRAIL在体外可诱导多种实体肿瘤细胞凋亡5，同样对血液病恶性肿瘤也有差异程度的促凋亡作用。本

15、实行通过研究证明rhTRAIL对白血病细胞K562、U937均有较明显的生长按捺作用，且必然浓度范畴内呈剂量依靠性。rhTRAIL对正常细胞株R-5仅有轻度的杀伤作用，随着剂量的增长并没有显着影响按捺率，与文献报道同等。本实行中，我们接纳RT-PR法检测两种血液病肿瘤细胞和一种正常细胞中TRAIL受体RNA的表达程度，创造殒命受体DR4、DR5在肿瘤细胞和正常细胞株都有差异程度的表达；而诱杀受体DR1和DR2仅在正常构造呈高表达，在肿瘤构造表达较低或不表达。因此，TRAIL对细胞特异性凋亡作用中诱杀受体的表达大概有着更为紧张的意义。正常细胞和肿瘤细胞外貌诱杀受体表达程度的差异，是TRAIL对其

16、杀伤力差异的一个紧张缘故原由。诱杀受体的表达发挥着庇护正常细胞逃逸TRAIL杀伤的作用，以及对TRAIL诱导的凋亡举行调控的作用6。别的，各受体的表达并不是TRAIL诱导凋亡作用的唯一决定因素，NF-B的激活、P53的调控、FLIP和凋亡按捺卵白的表达等多种因素会综合影响TRAIL的凋亡通路。柔红霉素DNR是如今临床血液病肿瘤化疗一线用药，但其恒久应用可引起严峻的心脏毒性及产生耐药性。本研究对白血病细胞株K562、U937团结应用rhTRAIL和DNR，结果提示团结应用组比各单药组对白血病细胞株的生长按捺率更高、杀伤作用更大。接纳海内金正均氏公式盘算证明两药联用对K562、U937细胞的促凋亡

17、作用有显着协同性，而这种药物间的协同性在正常细胞株R-5并不显着。因此，在协同作用的底子上，联适用药减低了每种药物各自的用药剂量，可减轻药物的毒性和不良反响；且抗肿瘤结果凌驾单用各药，对付落服肿瘤细胞对药物的耐受性有紧张意义。关于化疗药物对TRAIL协同作用机制有多种说法：可通过促进肿瘤细胞表达TRAIL及其相干受体7，使TRAIL与殒命受体团结增多，导致白血病细胞凋亡；由于TRAIL和受体团结后，能活化aspase-8，使化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的阈值低落7；化疗药物可以下调bl-2的表达，低落TRAIL诱导凋亡的阈值8；化疗药物导致DNA损伤后，诱导p53天生增长，p53可以或许与DR5的加强子团结，直接调控DR5的表达，通过DR5诱导的凋亡途径调治细胞的凋亡9。此中，很多学者以为与TRAIL受体在肿瘤细胞外貌诱导性表达有关，即化疗药物可同时诱导DR4、DR5在肿瘤细胞外貌大量表达。本实行中，我们检测到K562、U937细胞在经DNR孵育后殒命受体表达程度进步，同时诱杀受体表达程度未受影响；正常细胞株R-5的4种受体表达均未受到DNR作用的影响。因此，推测化疗药物可进步肿瘤细胞株的殒命受体DR4、DR5表达程度，