【生物课件】生物化学与分子生物学实验原理蛋白质的分离纯化(上)( 115)

1、生物化学与分子生物学实验原理（I）-蛋白质的分离纯化蛋白质的背景介绍2. 蛋白质分离、纯化的目的3. 蛋白质(粗)分离: (I)从细胞和组织-天然蛋白的提取 (II)表达蛋白的提取4. 蛋白质的纯化色谱(液相) Chromatography1. 背景介绍1.1 蛋白质(Proteins)的概念1.2 蛋白质的理化特性1.3 其它1.1 蛋白质（Proteins）蛋白质由二十种标准氨基酸组成.所有的氨基酸均有一共同的中心结构（-碳原子）,并由肽单位形成蛋白质的骨架.氨基酸的侧链可以是非极性的，极性的，或者带电荷的.蛋白可以折叠为一特定的形状或者保持一定的扭动。多数蛋白的密度在1.31.4g/cm

2、3细胞经常添加磷酸基团,糖基及酰基到侧链上以改变蛋白的形状及活性。1.2 蛋白质的理化特性每个蛋白质均有特定的等电点. 由其可解离的侧链基团所决定在一定的pH值下，每个蛋白的荷电状况不尽一致虽然很多蛋白质（水溶性的球蛋白）其大部分的极性侧链基团（亲水基团）折叠在外部，但是其表面仍有部分的疏水性区域。1.3 其它蛋白质是细胞生物功能的执行者酶细胞内外物质的运输结构支撑物免疫系统细胞与细胞以及细胞与外界环境信息传递体内蛋白质的制造受控于遗传信息DNA:TAC CGA TCG TGA ACTmRNA: AUG GCU AGC ACU UGAProtein:Met-Ala-Ser-Thr-StopTr

3、anscriptionTranslation基因突变对于蛋白的效应DNA:TAC CGA TCG TGA ACTmRNA: AUG GCU AGC ACU UGAProtein:Met-Ala-Ser-Thr-StopTranscriptionTranslationCGGlyProtein In 1 week blood out蛋白的免疫学效应基因组, 转录组及蛋白组( Genome, Transcriptome and Proteome)Genome (DNA)Transcriptome(RNA)Proteome(Protein)2. 蛋白质分离、纯化的目的 活力的生化分析 蛋白的翻译后修饰

4、（Post-translational modifications) 相互作用和蛋白的装配(Interactions and assembly) 三维结构(3-dimensional structure) 生物功能分析(Analysis of biological function) 药物开发(Drug development) -3. 蛋白的纯化方法离心(Centrifugation)过滤(Filtration)沉淀(Precipitation)色谱(Chromatography)电泳(Electrophoresis) : 常用于小规模（分析目的）制备策 略尽可能的用较少的步骤尽可能少的丢失

5、活力从有机体中获得纯的蛋白从哪儿开始?细胞与组织(材料来源有限，但是蛋白是天然的状态)。折叠均一, 可溶（主要指非膜蛋白）；可通过差速离心分离细胞组份；纯化可用色谱方法（chromatography）。cDNA克隆（为目前蛋白来源的主要方法，但是蛋白易形成包涵体（inclusion body）重组蛋白基因在大肠杆菌， 昆虫细胞， 哺乳动物细胞或植物细胞中表达。也用差速离心及色谱方法纯化。在重组的蛋白中可以添加Tags以便于纯化。从哪儿开始?3.1 蛋白质粗分离:(I)从细胞和组织-提 取 哪个物种合适？丰度及活力特点大小，成本及物种的可获得状况哪个组织合适?对于特定的细胞哪个组织丰富组织中哪种

6、细胞中有这类蛋白 纯化过程中的作为应该与特定的方案相关 非常有益的信息大小组成了解有关蛋白的必备知识有关组织提取的影响因素Buffer（缓冲液）pH值inoic strength（离子强度）metal ion chelators（金属离子螯合剂）reducing agents（还原剂）protease inhibitors（蛋白酶抑制剂）Temperature（温度）tissue disruption（组织的破碎方式）这些影响因素在蛋白(包括表达蛋白)纯化的整个过程中必需给予足够的重视.pH值缓冲液的pH对于成功提纯蛋白尤为重要缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH值的改变一般地，纯化过程中的pH值要

7、远离其等电点pI的稳定范围内酸性的蛋白 pH 7可溶;碱性蛋白组pH 7可溶;中性蛋白在偏离其等电点时可溶避免极端的pH造成蛋白化学成分的改变高pH一些氨基酸残基（Gln and Asn）的脱氨作用丝氨酸及苏氨酸（Ser and Thr）残基的消去反应肽健的部分水解低pH引起蛋白的沉淀及变性。修饰的磷酸基团丢失.缓冲液选择一种缓冲液使其可以有效的覆盖想要pH范围。一些缓冲液（如Tris-HCl）的pH可以发生改变。对此，必须小心，以免发生错误或变性你的蛋白。应当在buffer所使用的温度下调节溶液的pH值 eg. Tris buffer 25 pKa 8.06 0 pKa 8.85保证缓冲液能

8、与后续的过程（比如色谱）相容已知较好的非常有用的缓冲液(HEPES, PIPES, etc)。离子强度（Ionic strength）蛋白的溶解性依赖于离子强度高离子强度可造成蛋白的聚集或沉淀低离子强度能影响酶的稳定性一些蛋白对一定的离子(Na+, K+, Cl-, SO42-)有选择性（偏好性）0.1-0.2mol/L NaCl or KCl模拟生理状况下的离子强度.金属离子螯合剂(Metal ion chelators)一些组织含有Mg2+, Ca2+及 Mn2+ ions一些螯合剂常被用于除去阳离子(2-10mM)。 e.g. (EDTA（0.1-5mmol/L ）-大多数金属离子 EG

9、TA-Ca2+， o-phenanthroline, 邻二氮杂菲-Zn2+螯合剂可使提取物粘度降低,使蛋白更好的溶解。还原剂(Reducing agents)氧化作用会发生.半胱氨酸,甲硫氨酸及色氨酸的氧化.巯基还原剂经常被应用(1-10mM)巯基乙醇（ -mercaptoethanol）二硫苏糖醇(DTT)还原型的谷胱甘肽（Glu-Cys-Gly）TCEP二巯基乙醇: 5-20mmol/L , 储存液-4! 在加入buffer中24h内,二巯基乙醇被氧化.其后可加速蛋白的失活.二硫苏糖醇(DTT) 储存液- -20 0.5-1.0mmol/LTCEP sulfhydryl reductant

10、 tris(2-carboxyethyl)phosphineTCEP is significantly more stable than DTT without metal chelates such as EGTA in the buffer, whereas DTT is more stable if metal chelates are present. Thus TCEP has advantages over DTT蛋白酶抑制剂（Protease inhibitors）蛋白酶在动物组织及微生物中很普遍。分离蛋白在较低的温度条件下（如4 ）抑制剂的选择取决于何种蛋白酶的存在， PMSF

11、(苯甲基磺酰氟)，leupeptin, aprotinin -对抗丝氨酸蛋白酶 EDTA -对抗金属蛋白酶; pepstatin -对抗胃蛋白酶, 巯基蛋白酶用较高浓度的还原剂来封阻.温度(Temperature)蛋白质在低温（0oC）时最稳定。提升温度 升高10oC, 酶反应速度会增加一倍.超过30-40oC, 蛋白质极不稳定,大多数蛋白质易失活.一般地，蛋白在20-40oC较之于低的温度有更高的溶解性。破碎细胞上清 沉淀 (丢弃)离心细胞裂解细胞裂解物,蛋白,核酸及小分子多步纯化不需要的分子纯蛋白从组织细胞中进行蛋白分离流程图组织破碎(Tissue disruption)除去不要的组织搅碎

12、匀浆（homogenization）研磨(vessel for extraction)细胞破碎(Cell Disruption)化学破碎: 碱, 有机溶剂,去污剂酶学手段: 溶菌酶, 葡聚糖酶,几丁质酶(常适用于含细胞壁的细菌及植物细胞)物理方法: 渗透压震荡, 冻溶机械方法: 超声,匀浆,湿磨,压力化学破碎（Chemical Disruption）去污剂,如: Trition X-100 或 NP40能因溶解细胞膜而使蛋白透过细胞.去污剂能使蛋白变性而且在细胞破碎以后必需除去. 压力破碎（French Press）细胞放在不锈钢的容器中.压力破碎器配有一合适的活塞,其在高压下迫使细胞挤破后通

13、过底部的小孔. 匀浆(Homogenization)细胞被置于一密闭的容器中 (常为玻璃).匀浆器配有一非常合适的插头,通过其上下及左右的往复运动来破碎细胞.超声(Sonication)超声波发生器可直接浸入到细胞悬浮物中,超声波发生器会经振动发出高频率的声波而使细胞破碎.-3.2 初步纯化热 变 性 不同的蛋白有不同的热稳定性,且有些蛋白可以在热变性以后再复性.0 温度 () 100天然结构(%)一般蛋白钙调蛋白钙调蛋白是能通过热变性而获得纯化的一个很好例子一般的, 较小的, 荷电较高的蛋白比较大的, 疏水性越高的蛋白在较高的温度下更稳定. 盐溶、盐析(Salting in / Saltin

14、g out)盐溶在低浓度时, 由于盐能屏蔽蛋白之间的电荷-电荷相互作用,添加盐通常会增加荷电分子的溶解性 低盐防止蛋白的沉淀,聚集.盐析在高浓度时, 由于盐与H2O竞争结合蛋白,添加盐常降低蛋白的溶解性 高盐会除去球形蛋白的溶剂分子从而造成盐析(蛋白沉淀).硫酸铵沉淀（Ammonium sulfate precipitation）利用盐破坏离子相互作用,且促进蛋白表面的疏水相互作用盐溶、盐析(Salting in / Salting out)每个蛋白与盐浓度的相关溶解性曲线不尽相同 : Log S(mg/ml) = - Ks(ionic strength/2), where Ks and 、

15、are constants. 盐溶、盐析（Salting In and Salting Out）不同的盐对于蛋白的溶解性会有不同 (NH4)2SO4是蛋白盐析时最常用的试剂.理论上, 盐析时需要的盐的量直接与蛋白表面的电荷及非离子的极性氨基酸相关.沉淀想要的蛋白,必需的(NH4)2SO4的浓度源于实验的经验值.一般的, 蛋白越大, 需要沉淀蛋白的盐浓度越低. 有机溶剂沉淀(Precipitation With Organic Solvents)极性的有机溶剂,如:脂肪族的 醇类及酮类, 降低蛋白的溶解性. 最常用的有:甲醇, 乙醇, 丙酮及聚乙二醇. 1. 减少蛋白表面的水化层和增加疏水性的表

16、面促进聚集.2.降低水的介电常数 降低蛋白的溶解性.方式主要的不足之处-常导致蛋白的变性 聚乙二醇的运用可以克服这一不足. 丙酮,乙醇及甲醇也是非常好的脂溶性的溶剂而被经常用在脱脂处理, 这些脱脂处理常常先于蛋白的纯化. 聚乙二醇6000PEG 终浓度达30%, Pr达到最大量沉淀等电点及pH沉淀(Isoelectric Point and pH Precipitation). 蛋白在与其pI相同的pH环境中有最低的溶解性等电点沉淀能富集特定pI值的蛋白相同pI值的分子可以聚集反应由两个因素引发疏水相互作用偶极子相互作用通过透析从而到达溶质交换-除去沉淀剂有各种不同截留分子量的透析膜 -(50

17、-100 kDa cut off). 商业上也有到达脱盐及浓缩的离心透析装置离心(Centrifugation)当一个水溶性的混合物在受到离心力时,较大的及密度较重的成份沉淀得较快低速离心常用于分离完整的细胞 高速离心能用于分离亚细胞成份冷冻高速离心机常用于分离蛋白成份.离心机(尤其是可控低温离心机)价格昂贵,且运行时有一定的危险性,请小心使用!固定角度离心机(Fixed-Angle Centrifugation)水平离心机(Swinging-Arm Centrifugation)差速离心(Differential Centrifugation)For example:Sedimentatio

18、n velocity沉积速度is an analytical ultracentrifugation (AUC) method that measures the rate at which molecules move in response to centrifugal force generated in a centrifuge. This sedimentation rate provides information about both the molecular mass and the shape of molecules. Alliance Protein Laborator

19、ies is the only contract lab in the U.S. offering sedimentation velocity measurements analytical ultracentrifuge - spun at very high speed: 40-60 K rpm 过滤和超滤(Filtration and ultrafiltration)3.2 蛋白质(粗)分离:(II)表达蛋白用生物信息学方法选定目标蛋白及相应的DNA文库或cDNA文库回收PCR产物并将基因克隆至表达载体将表达载体转化至表达菌株设计,合成PCR引物并从相应文库中进行PCR诱导表达目的蛋白

20、提取表达载体进行酶切鉴定是否含目的基因YNHarvest CellsCell DisruptionTotal ProteinsPure ProteinAnalytical Tests培养介质细胞碎片非目的蛋白CentrifugationFiltrationEnzymaticChemicalPhysicalPurification Steps重组基因的表达特点(a) 可获得大量的蛋白(b) 可进行突变 - structure/activity studies(c) 可引入具有光谱特性的物质(d) 可引入稳定的同位素 15N, 2H, 13C (especially for NMR) (e) 蛋白

21、融合体 便于纯化及免疫学研究表达体系 (i) E. coli(a) 遗传上易操作(b) 试剂及表达载体易于获得(c) 易产生大量的蛋白 (usually)(d) 很强的适应性(e) 能在少量及限定的介质中表达 (ii) eukaryotic 正确的翻译后加工e.g. yeast or baculovirus, 真核细胞株SHSHHSSHSHSHSHSHS-SS-SS-SS-SS-SS-SS-S(ii)(iii)(i)S-S表达蛋白中的若干问题1-包涵体过量表达的蛋白与细胞中其它物质形成的不溶性聚集体(i)破碎 E. coli 超声破碎沉淀不溶性的包涵体(ii) 溶解及变性 盐酸胍,DTT (i

22、f His-tagged, 能用Ni-柱纯化)(iii) 复性 在稀释后缓慢地透析变性物加添加物 (加二硫键异构酶; 分子伴侣) 复性率 20%表达蛋白中的若干问题2-蛋白降解重组蛋白在纯化过程中经常会不稳定及降解.可添加蛋白酶抑制剂, EDTA 难题!表达蛋白中的若干问题3-蛋白不表达重组蛋白在表达过程中会有不表达及表达量极低的现象.原因多种及不明:稀有密码子, 对表达细胞的毒性,核糖体结合位点不合适可尝试换表达体系,低温诱导等方法.表达蛋白中的若干问题4-蛋白沉淀重组蛋白在纯化过程中经常会导致沉淀.可能原因为折叠不均一及不合适的溶解缓冲液.可尝试在纯化过程中添加一些保护蛋白或增加蛋白溶解度

23、的试剂,如:低浓度(15%(w/v)的甘油, 低浓度(0.1M)的咪唑(尤其对含His-tags的融合蛋白)及低浓度的盐浓度(0.1M NaCl)等.重要提示（IMPORTANT）在确定你不再需要你的某种蛋白之前不要扔掉你的蛋白清楚地贴上样品标签,并在实验记录本上记录备案扔掉来源不清晰的蛋白必需的技巧对于所有获得的蛋白定出蛋白的总量(A280 or BCA)及活力.每毫克蛋白的活力=比活 (specific activity)你必需努力获得单位蛋白的最大活力.4. 蛋白质的纯化色谱(液相)（Chromatography） 1903年，俄国科学家M. C. 首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素

24、成分的方法，命名为色谱法（chromatography), 由于翻译和习惯的原因，又常称为层析法。20世纪80多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50年代开始，相继出现了气相层析、液相层析、高效液相层析、薄层层析、通透层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析、金属螯和层析等。几乎每一种层析法都已发展为一门独立的生化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。-摘自生物化学实验原理和方法，李建武等，1994，北京大学出版社。4.1 离子交换色谱色谱简介用于蛋白质分离纯化的色谱主要为液相色谱液相色谱的基本理论涉及流动相、固定相，保留时间，理论塔板数，分辨率，容量因子，柱效等概念用于蛋白质液相色谱的基本原

25、理是利用了蛋白质的一些理化特性（解离、等电点、大小及蛋白质的疏水特性）通常的液相色谱包括离子交换色谱分子筛色谱亲和色谱反相层析疏水相互作用色谱固定离子的亲和色谱其它4.1 离子交换色谱Ion exchange chromatography (IEX)-separates molecules according to net charge.离子交换廉价的支持介质，高通用性非常有效，常为第一步浓缩和纯化的方法原理简单，基于蛋白荷电区域与其相反电性的介质之间可交换的结合。阴、阳离子交换介质可从商业途径获得。静止相及流动相两相:静止相 = 柱介质固体支持物固定化的功能基团荷电离子流动相 = 缓冲液+样

26、品（buffer/sample） 蛋白样品在特定的条件下可结合于静止相之中,变化的条件可使蛋白从静止相进入流动相,造成在静止相与流动相之间的分配.蛋白的静电特性决定了离子交换介质的类型， 原则上:假如溶液pH pI，蛋白将荷负电; 其将可与荷正电荷的介质结合， 交换负电荷介质-称为阴离子交换介质.4.1.1 离子交换色谱 基本原理+-pHpI溶液pH值对pr静电荷的影响Net charge阳离子交换介质阴离子交换介质pH pIChromatography Resins（色谱介质或层析胶）固体支持物交换基团抗衡离子(盐)+ or -纤维素葡聚糖琼脂糖+ 二乙基氨基乙基 (DEAE) or 二乙基

27、（二羧丙基）氨基乙基(QAE) 羧甲基 (CM) or 磺丙基 (SP)NaCl凝胶是一种具有立体网状结构的物质（如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等）吸收大量液体（水或洗脱液）溶胀而成。60年代初，瑞典科学家Flodin首先试制成功交联葡聚糖（Sephadex），作为凝胶层析法的支持介质。这以后，又相继发展了Sepharose、Bio-Gel-P以及具有特殊用途的凝胶的衍生物. 层析用凝胶必须具备下列条件：凝胶介质必须是惰性的，以保证其不与待分离物质发生化学反应；凝胶的化学性质必须是稳定的；尽可能低的电荷，避免离子交换效应的发生，保证正常的层析特性；具有足够的机械强度，保证凝胶颗粒在一定的操作压下

28、不形变，从而保证正常的流速。选择介质的考虑因素规模样品的纯度分辨率分离速度样品的稳定性Ion exchange (IEX) ligands be negatively charged adsorb cations “+” cation exchangers (CIEX) be positively charged adsorb anions “-” anion exchangers (AIEX) One protein , PI= 6.9 If in the buffer, pH=5.9One protein , PI= 6.9 If in the buffer, pH=7.9anion ex

29、changerscation exchangers交换剂的选择?分离物质为两性离子,应根据其在稳定的pH范围内所带电荷来选择交换剂.Depending on the pKa value of the charged ligand,the ion exchangers are further divided into strong ion exchangers - its functional group shows no loss or gain of charge with varying pH -normally applicable to proteins and peptides we

30、ak ion exchangers- its functional groups ion exchange capacity can vary with pHNote: strong or weak in this sense- to the IEX ligand as a strong or weak acid or base -not refer to the binding strength provided strong ion exchangers 适用的pH范围很广,常用来制备无离子水,分离在极端pH溶液中解离且较稳定的物质weak ion exchangers- 适用的pH范围窄

31、,但在pH为中性的溶液中交换容量也高,用与分离生命大分子物质,活性保持常用的离子交换剂类型Type of ion exchangersweak strong strong weak梯度洗脱的实验装置层析柱：为普通玻璃管或有机玻璃管，两端带接头，要求粗细均匀，表面光洁。恒流泵：控制系统的流速。部分收集器：定量分部收集洗脱流出液。核酸蛋白检测仪：连续测定洗脱流出液的光密度值。记录仪：以图谱的形式实时记录实验过程和结果。离子交换柱的操作Step 1, 装柱量化 估计需要结合的样品量用 5X的量去装柱查看技术参数单浸洗,调节pH值. Step 2, 平衡Initial buffer: 其pH值和离子强度等能使样品中有效成分与离子交换剂结合anion exchangers -pH比有效成分的pI高一个单位cation exchangers pH比有效成分的pI低一个单位离子强度=0.1Step3, 加样及平衡 Charged sample molecules adsorb to ion exchanger