蛋白质化学(正式)

1、1第一篇 生物分子的结构与功能生物分子：蛋白质、核酸、脂类、糖类人体物质组成 生物大分子水（55-67%)蛋白质（15-18%)脂（10-15%)糖（1-2%)核酸第一章蛋白质的结构和功能北京大学医学部生化与分子生物学系王海英21. 蛋白质是生命的物质基础分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。蛋白质在生命活动中的重要性2、蛋白质的重要生物学功能3、氧化供能1）生物催化剂：酶2）代谢调节作用：激素 ，受体，G蛋白，等3）防御作用：免疫球蛋白 ，等4）物质转运：血红蛋

2、白 ，等5）运动与支持：肌动蛋白，等6）营养和和存储：酪蛋白，卵清蛋白，等7）结构蛋白 ：胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白 ，等8）其他：毒蛋白，甜味剂，等1.蛋白质的分子组成 2.蛋白质的分子结构 3.蛋白质结构与功能的关系 4.蛋白质的重要理化性质 第一节 蛋白质的分子组成一、元素组成：碳 50-55氢 6-8氧 20-23氮 15-17硫 0-3其他 微 量 其中 N含量16蛋白质含量氮含量/16氮含量6.25蛋白质含量？凯氏定氮法测定蛋白质含量的理论依据1、主要元素：碳、氢、氧、氮和硫，有些蛋白质还含有少量磷和金属元素。2、特点：各种蛋白质的含氮量很接近，平均含氮量为16%。3、定氮法测定蛋

3、白质含量： 蛋白质含量6.25样品含氮量 1/16%小结二、结构单位氨基酸（amino acid）20种L-氨基酸（甘氨酸，脯氨酸除外） 蛋白质 肽 氨基酸 水解水解酸/碱/酶氢原子氨基羧基侧链基团-碳原子氨基酸的基本结构异构现象是有机化学中存在着的极为普遍的现象。其异构现象可归纳如下： 构造异构立体异构碳链异构官能团异构位置异构互变异构构型异构构象异构顺反异构对映非对映异构同分异构单键旋转异构叔胺翻转异构左右手互为镜象井冈山风景桂林风情Louis Pasteur 1848年得到的酒石酸盐晶体H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R非极性疏水性氨基酸2. 极性中性氨基酸3. 酸性氨基酸4. 碱性

4、氨基酸 脯氨酸（亚氨基酸）几种特殊氨基酸 半胱氨酸 +胱氨酸二硫键-HH蛋白质基本结构单位：L氨基酸 氨基酸：脯氨酸（亚氨基酸）除外 L氨基酸：甘氨酸（无不对称C）除外 氨基酸结构通式：RCH(NH2)COOH 常见氨基酸种类：20种。小结氨基酸分类：按其侧链的结构和理化性质分类非极性、疏水氨基酸(非极性R基氨基酸)： Val, Leu, Ile（支链）；Met（含硫）；Phe , Trp （芳香族）；Pro（亚氨基）；Ala（脂肪烃 ）极性、中性氨基酸(不带电荷的极性R基氨基酸) ： Ser, Thr（含羟基）；Tyr（芳香族）；Cys（含硫）；Gln, Asn（含酰氨） ；Gly（无旋光异

5、构） 酸性氨基酸（含有两个羧基）： Glu（含羧基）、Asp（含羧基） 碱性氨基酸（含有两个以上氨基）： Arg（胍基）、His（咪唑基）、Lys（氨基）含硫氨基酸：Met、Cys芳香族氨基酸：Phe、Tyr、Trp(zwitterion)pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性离子 阳离子阴离子三、氨基酸的理化性质1、两性解离氨基酸的等电点pH pI正电荷 两性离子 负电荷负极移动（电场中） 不移动 正极移动等电点（isoelectric point, pI）：在某一pH溶液中中，氨基酸解离成阳性离子及阴性离子的趋势相等，所带净电荷为零，在电场中不泳动。此时，氨基酸所

6、处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。pI值决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。等电点计算22223RNHRCOOHNH2COOHpKpKpIpKpKpIpKpKpI+=+=+=-aaaa碱性酸性中性2、紫外吸收：Trp、Tyr和Phe在280nm波长附近具有最大吸收峰，其中Trp的最大吸收最接近280nm3、显色反应：茚三酮反应氨基酸与茚三酮水合物共热，生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰为570nm，可用于氨基酸定量分析。例外：Pro黄色；Asn棕色等电点（isoelectric point, pI）：在某一pH环境中，氨基酸解离成阳性离子及阴性离子的趋势相等，所带净电荷为零，在电场中不泳动。

7、此时，氨基酸所处环境的pH值称为该种氨基酸的等电点(pI)。等电点计算：两性离子两边的pK值的算术平均值。带电状态判定： pI-pH （正数带正电，负数带负电） PIPH0 带正电 PIPH =0 不带电 紫外吸收：Tr p、Tyr和Phe在280nm波长附近具有最大吸收峰，其中Trp的最大吸收最接近280nm小结蛋白质分子的结构基础：多肽链（一）氨基酸通过肽键连接构成多肽 1、肽键(peptide bond) ： 一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间脱水缩合形成的键称为肽键(共价键)。 所形成的化合物称为肽(peptide)肽键二肽312. 肽：氨基酸之间缩合，并以肽键相连 寡肽（氨基酸

8、残基 aa 10）肽链的两端： 氨基末端（amino terminal, N-端） 羧基末端（carboxyl terminal, C-端） 肽链方向：N端 C端肽键具部分双键性，不能自由旋转肽键中的四个原子（-CO-NH-）和与之相邻的两个碳原子（C1、 C2）位于同一刚性平面内，称为肽单元 。肽键上H与O的方向几乎总是相反，称反式肽单元（trans-peptide unit），该构型更稳定。CNHHHORRCNHHHORR3.肽键平面* 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。4、生物活性肽：谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione, GSH)GSH过

9、氧化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶NADPH+H+ NADP+ 1、连接方式：肽键肽键(peptide bond)：一个氨基酸的羧基与另一氨基酸的氨基缩水而成的酰胺键称为肽键。（CONH）肽平面(peptide unit)：由肽键中的四个原子（-CO-NH-）和与之相邻的两个碳原子共同构成的刚性平面（CCONHC）。2、生物活性肽：谷胱甘肽：Glu-Cys-Gly，Glu以羧基形成肽键 3、蛋白质的基本结构形式：多肽链多肽链 (NHCHCONHCHCO)多肽链的方向性：从N末端指向C末端。小结第三节蛋白质的分子结构一级结构(primary structure)二级结构

10、(secondary structure)三级结构(tertiary structure)四级结构(quaternary structure)纤维状蛋白质球状蛋白质一、蛋白质的一级结构 (primary structure) 多肽链中氨基酸的排列顺序。 5 10 15 20 25 30 1 A A S X D X S L V E V H X X V F I V P P X I L Q A V V S I A 31 T T R X D D X D S A A A S I P M V P G W V L K Q V X G S Q A 61 G S F L A I V M G G G D L E

11、V I L I X L A G Y Q E S S I X A 91 S R S L A A S M X T T A I P S D L W G N X A X S N A A F S S121 X E F S S X A G S V P L G F T F X E A G A K E X V I K G Q I151 T X Q A X A F S L A X L X K L I S A M X N A X F P A G D X X181 X X V A D I X D S H G I L X X V N Y T D A X I K M G I I F G211 S G V N A A Y

12、 W C D S T X I A D A A D A G X X G G A G X M X241 V C C X Q D S F R K A F P S L P Q I X Y X X T L N X X S P X271 A X K T F E K N S X A K N X G Q S L R D V L M X Y K X X G Q301 X H X X X A X D F X A A N V E N S S Y P A K I Q K L P H F D331 L R X X X D L F X G D Q G I A X K T X M K X V V R R X L F L36

13、1 I A A Y A F R L V V C X I X A I C Q K K G Y S S G H I A A X391 G S X R D Y S G F S X N S A T X N X N I Y G W P Q S A X X S421 K P I X I T P A I D G E G A A X X V I X S I A S S Q X X X A451 X X S A X X A酵母己糖激酶的一级结构N末端C末端牛核糖核酸酶二硫键一级结构是指蛋白质的多肽链中氨基酸的排列顺序一级结构体现生物信息：20n .多样一级结构是空间结构及生物活性的基础.特异一级结构的连接键：肽

14、键（主要）、二硫键小结二、二级结构（一）指多肽链中主链原子在局部空间的排列，不包括氨基酸残基侧链的构象-螺旋 (- helix) -转角(- turn)无规则卷曲（random coil）（二）蛋白质二级结构的基本形式 蛋白质二级结构的主要形式： -螺旋 -片层（-折叠） - 转角 无规则卷曲-折叠 (- pleated sheet)45（1）多肽链以肽键平面为单位,盘曲成一个右手螺旋(顺时针方向）-螺旋 （-Helix ）特点 46（2）每个螺旋有3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm。（3）肽键平面与螺旋长轴平行，两圈螺旋之间形成氢键，稳定螺旋。（4）肽链中氨基酸侧链R分布在螺旋外侧。特点

15、2、-折叠(-pleated sheet)存在于纤维状蛋白质（ -角蛋白：蚕丝、蜘蛛丝中丝心蛋白）和球蛋白中。482. -片层（ -折叠， -pleated sheets ）-片层是由若干肽段或肽链排列起来所形成的扇面状片层构象，特征：主链骨架伸展呈锯齿状49 可以由一条多肽链折返形成；也可以由两条以上多肽链顺向或反向平行排列而成N端N端C端C端肽链同向N端N端N端C端C端C端肽链反向50 借相邻主链之间的氢键维系，氢键方向与折叠长轴垂直-片层N端N端C端C端51 肽键中氨基酸侧链R伸出在片层上下RRRRRRRR523、-转角和无规卷曲-转角常发生于肽链进行180回折时的转角上，无规卷曲：指没

16、有确定性规律的肽链结构。1、-螺旋(-helix)右手螺旋：3.6个AA/圈，螺距0.54nm；氢键维系：链内氢键（AA1AA4），平行长轴；侧链伸出螺旋蛋白质的二级结构是指多肽链骨架中原子的局部空间排列，不涉及侧链的构象，也就是该肽段主链骨架原子的相对空间位置，主要有-螺旋、-折叠、-转角和无规则卷曲。维持二级结构的力量为氢键。小结2、-折叠(-pleated sheet)多肽链充分伸展，肽平面折叠成锯齿状；侧链交错位于锯齿状结构的上下方；氢键维系：氢键的方向垂直长轴；可有顺平行片层和反平行片层结构。四、超二级结构( supersecondary structure ) 蛋白质分子中，2个或

17、2个以上的具有二级结构的肽段在空间上相互接近，形成规则的二级结构组合。 三种形式： -螺旋组合（） -折叠组合（） -螺旋-折叠组合（）模体 （motif ） 由二个或多个具有二级结构的肽段，在空间相互接近形成的一个特殊空间构象，是具有特殊功能的超二级结构。 钙结合蛋白中结合钙离子的模体 锌指结构 1、基序或模序（motifs or modules）在许多蛋白质中，有两个或三个具有二级结构的肽段在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，称为模序。有的将这种规则的二级结构的聚集体称为超二级结构，它们可直接作为三级结构的“建筑块”或域结构的组成单位，是蛋白质发挥特定功能的基础。类型：、锌指结构、亮

18、氨酸拉链小结五、三级结构与域结构 指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间 位置，即一条多肽链的整体构象。次级键介导蛋白质高级结构形成疏水作用62三级结构的特点：1、进一步盘曲、折叠的多肽链分子长度大大缩短， 呈棒状、纤维状或球状；2、三级结构的稳定性主要靠次级键维持，尤其是疏水键；3、疏水基团多位于分子内部，亲水基团多位于分子表面；4、分子表面或某些部位形成了发挥生物学功能的特定区域二硫键（共价键）也参与维系三级结构2、结构域（domain，结构域）蛋白质三级结构上，1个或数个折叠紧密、并有一定功能的球状或纤维状的结构区域。蛋白质的三级结构是指在一条多肽链中所有原子的整体空间排布，包括主链和侧链

19、。三级结构的形成使得在序列中相隔较远的氨基酸侧链相互靠近。 长度缩短：球形、椭球形、杆状等多数同时含有-螺旋和-折叠氨基酸位置由侧链极性决定：非极性（内）、极性（表面，少数内部）、带电（表面）次级键维系：疏水键、盐键、氢键、范德华力、二硫键功能区：表面或特定部位小结结构域（domain）：是在较大的蛋白质分子中所形成的两个或多个在空间上可明显区别的局部区域。结构域具有独特的空间构象，与分子整体以共价键相连，并承担特定的生物学功能。结构域与分子整体以共价键相连具有相对独立的空间构象和生物学功能同一蛋白质中的结构域可以相同或不同，不同蛋白质中的结构域也可能相同或不同六、四级结构二个或二个以上具有独

20、立的三级结构的多肽链，彼此借次级键相连，成为一定的空间结构，称为四级结构。具有独立三级结构的多肽链单位，称为亚基或亚单位，亚基可以相同，亦可以不同。单独亚基，无生物学功能，二个以上亚基聚合成为有完整四级结构的蛋白质， 才有生物学功能。血红蛋白四聚体血红蛋白结构与亚基间连接亚基(subunit)：寡聚蛋白中的单条独立的多肽链，具有独立的一、二、三级结构，单独存在时一般无生物学活性。亚基之间以非共价键联系，亚基可以相同或不同。亚基之间以非共价键联系，包括疏水键（主要）、盐键、氢键、范德华力亚基可以相同或不同小结六、蛋白组学 proteomics (1995 M.Wilkins)定义：以细胞内全部蛋

21、白质的存在及其活动方式为研究对象技术平台： 双向电泳 蛋白质点的定位、切取 蛋白质点的质谱分析研究意义第四节蛋白质结构与功能的关系蛋白质一级结构是空间结构和生物功能的基础，一级结构决定空间结构；但一级结构并非决定空间结构的唯一因素。空间结构是生物活性的直接体现。一、蛋白质一级结构是空间结构和功能的基础（一）一级结构是空间结构的基础（二）一级结构是蛋白质功能的基础人 V E T S I S L Y Q N F V N Q S H E A Y G E R T P K T 马 - - - G - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A猪 - - - - -

22、 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A牛 - - A - V - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - T羊 - - A G V - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A天竺鼠 - D A G T * R H - S - - S R - N - T S Q D D I - - D鲸 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A鸡 - - H N T - - - - - A A - - - - - - - - - - S

23、- - A3 4 8 9 10 12 13 14 15 18 1 2 3 4 9 10 13 14 16 20 21 22 27 28 29 30 A 链 B 链 741、相似结构表现相似功能胰岛素：不同种属动物的胰岛素一级结构相似 （表12）75抗利尿激素H2N半胱酪苯丙谷天冬半胱脯精甘催产素H2N半胱酪异亮谷天冬半胱脯亮甘抗利尿激素促进血管平滑肌收缩催产素促进子宫平滑肌收缩2、不同结构具有不同功能76镰刀型红细胞贫血：1944年首先被发现并被称为分子病。正常的红细胞异常的红细胞3.一级结构改变，功能改变-分子病。77 正常：N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys

24、- （谷氨酸） CAT 病人：N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys- （缬氨酸）Hb 链镰刀型红细胞贫血病因：CTTPolymerization of HbS正常红细胞镰形红细胞一级结构是生物功能的基础：结构冗余，丧失功能一级结构不变，功能可能改变 天然状态，有催化活性 尿素、 -巯基乙醇 去除尿素、-巯基乙醇非折叠状态，无活性一级结构适当的溶液环境分子伴侣（chaperone）酶：蛋白质二硫键异构酶，肽基脯氨酸顺-反异构酶影响多肽链折叠的因素图解：助人为乐的分子伴侣太太很快出现在需要她尽力而为的场所（新生肽链的折叠，越膜，应激反应等情况），她主动去发现她应该帮助

25、的正在成长的新生肽姑娘（识别折叠中间物），热情地伸出友谊之手（相互作用和结合），并发出警戒之言“不！不！别往哪儿走！”，防止她们误入歧途掉进不可自拔的死亡深渊（防止错误的相互作用导致的无效折叠和不可逆聚集），从而帮助她们沿着朝向正确目标的光明大道前进（有利于有效折叠成功能蛋白的正确折叠途径）。新生肽姑娘健康地成长（正确折叠）。折叠好的蛋白质小姐愉快地，昂首阔步地准备去做自己的贡献（折叠成特定的空间构象并获得生物活性的功能蛋白 )分子伴侣帮助新生肽链正确折叠 生物名称 不同氨基酸数 生物名称 不同氨基酸数黑猩猩 0 恒河猴 1猪、牛、羊 10 马 12鸡 13 海龟 15金枪鱼 21 小蝇 25

26、小麦 35 酵母 44不同生物和人的细胞色素c 中氨基酸组成的差异一级结构改变，功能可能不变 狗人猴 马骡 鲸 兔猪袋鼠企鹅鸡 鸭响尾蛇龟苍蝇 蛾脉孢菌属念珠菌属面包酵母菌小麦牛 蛙金枪鱼动 物爬行动物两栖动物鱼哺乳动物鸟昆 虫植 物脊椎动物从细胞色素C的一级结构看生物进化人 V E T S I S L Y Q N F V N Q S H E A Y G E R T P K T 马 - - - G - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A猪 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A牛 - -

27、 A - V - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - T羊 - - A G V - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A天竺鼠 - D A G T * R H - S - - S R - N - T S Q D D I - - D鲸 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A鸡 - - H N T - - - - - A A - - - - - - - - - - S - - A3 4 8 9 10 12 13 14 15 18 1 2 3 4 9 10 1

28、3 14 16 20 21 22 27 28 29 30 A 链 B 链 某些脊椎动物胰岛素一级结构部分氨基酸残基差异 “-” 为与人相同；* 为芳香族氨基酸；未列出的为相同序列 1、一级结构中的保守序列决定空间结构（1）不同蛋白质之间的比较：相似结构相似功能、不同结构不同功能（2）同一蛋白质不同状态的比较：一级结构决定空间结构【经典举例】酶原激活、分子病、蛋白变性与复性（3）保守序列、保守氨基酸改变，功能改变；保守氨基酸不变，功能不变【经典举例】分子病小结2、一级结构并非影响空间结构的唯一因素分子伴娘(molecular chaperons，分子伴侣)：在蛋白质加工、折叠形成特定空间构象及穿

29、膜进入细胞器的转位过程中起关键作用的一类特殊分子。与未折叠的肽段（疏水部分）进行可逆的结合，辅助二硫键的正确形成；引导肽链的正确折叠并集合多条肽链成为较大的结构；可以解聚错误聚合的肽段，防止错误发生。肌红蛋白与血红蛋白的结构 二、空间结构与功能的关系空间结构体现生物活性：结构相似，功能相似肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。空间结构体现生物活性：结构改变，功能改变O2血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。一个寡聚体

30、蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应(cooperativity) 。 正协同效应(positive cooperativity)：促进作用负协同效应(negative cooperativity)：抑制作用别构效应（变位效应，allosteric effect）：蛋白质分子的特定部位与小分子化合物结合后，引起空间构象改变，从而促使生物学活性变化的现象。疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下

31、可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。PrPc-螺旋PrPsc-折叠正常疯牛病朊病毒致病过程中的构象变化示意图1、空间结构体现生物特异性2、空间结构体现生物活性3、空间结构的灵活性，体现了生物活性的可调节特性空间结构中的特定区域体现生物活性小结别构效应（别位效应、变位效应，allosteric effect）：蛋白质分子的特定部位（调节部位）与小分子化合物（效应物）结合后，引起空间构象发生改变，从而促使生物学活性变化的现象称为变构效应。包括正协同、负协同效应【经典举例】血红蛋白（Hb）：由22四聚体组成，每个亚基含有1个血红素辅基；Hb的氧解离曲线呈“S”型。多种空间构象，多种活性状态4、

32、空间构象并非生物活性的唯一影响因素【举例】低温下酶活性低，但并不影响构象；盐析时沉淀的酶无活性，但构象不变。 5、蛋白构象疾病：错误构象相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病。老年痴呆疯牛病亨汀顿舞蹈病1、蛋白质的变性与复性去除部分变性剂温和复性温和复性天然蛋白（具有正确的一级结构和高级结构，因此具有生物活性）变性蛋白（具有正确的一级结构但无高级结构，无生物活性）变性环境非天然蛋白（具有正确的一级结构和错误的高级结构，无生物活性）【经典举例】Rnase小结2、前体蛋白与活性蛋白的转变 （切除冗余及其它变化）前体蛋白（一级结构冗余，高级结构错误，因此无生物活性）活性蛋白（具有

33、正确的一级结构和高级结构，因此具有生物活性）适合环境【经典举例】酶原激活：胃蛋白酶原切除N端42个氨基酸后形成活性中心及其他空间构象，转变为具水解蛋白质活性的胃蛋白酶；胰蛋白酶原切除N端6个氨基酸后形成活性中心及其他正确构象，转变为具有水解活性的胰蛋白酶。3、分子病（molecular disease）：由于基因结构改变，蛋白质一级结构中的关键氨基酸发生改变，从而导致蛋白质功能障碍，出现相应的临床症状，这类遗传性疾病称为分子病。【经典举例】镰形细胞贫血症：编码珠蛋白链的结构基因第六个密码子由CTTCAT，相应的多肽序列中N端的第六个氨基酸由GluVla；其空间结构发生相应改变，在表面形成互补区

34、，使蛋白质分子之间彼此聚合，促使红细胞在低氧压下变形成镰形，丧失运输氧的生物活性。4、蛋白构象疾病：疯牛病，由于朊病毒蛋白（PrP）构象改变导致蛋白质聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀。（二级结构及其它变化）正常动物PrPc （二级结构多为螺旋、对蛋白酶敏感、水溶性）致病蛋白PrPsc（一级结构相同，但二级结构全为折叠，抗蛋白酶、水溶性差、蛋白聚集成淀粉样沉淀）未知蛋白第五节蛋白质的理化性质及分离纯化 1、蛋白质的两性电离 一、理化性质 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 * 蛋白质的等电点( isoel

35、ectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。2、蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。3、蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。 * 蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗

36、粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉4、变性（Denaturation）、结絮和凝固概念：在某些理化因素作用下，蛋白质的空间构象破坏，导致若干理化性质和生物学性质的改变。变性因素：1）物理因素：高温、高压、射线等2）化学因素：强酸、强碱、重金属盐等 变性后的表现：1）生物学活性消失2）理化性质改变变性的意义：高温、高压、紫外线杀菌；防止酶制剂失活，等5、蛋白质的呈色反应（1）茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质水解后产生的氨基酸可发生茚三酮反应。（2）双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或

37、红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。1、两性解离与等电点：同“氨基酸两性解离”2、紫外吸收：最大吸收波长280nm 3、胶体性质：不能透过半透膜4、沉淀、凝固蛋白质在溶液中维持稳定的因素： 表面电荷、水化层（溶剂化层）变性蛋白不一定沉淀，沉淀蛋白也不一定变性（1）沉淀：不稳定蛋白质从溶液中析出（2）结絮：变性蛋白质的絮状沉淀，沉淀可溶于强酸、强碱（3）凝固：沉淀结块，凝块不溶于强酸、强碱小结（1）变性：在某些理化因素作用下，蛋白质的空间结构被破坏，从而导致其理化性质改变、生物活性丧失的现象称为变性。变性不涉及一级结构的变化。理化性质的变化：紫外吸收、化学活性及粘度上

38、升，易被蛋白酶水解；溶解度下降、结晶能力丧失。5、变性(denaturation)、复性(renaturation)（2）复性（3）应用利用变性：酒精消毒，高压灭菌，血虑液制备防止变性：低温保存生物制品取代变性：乳品解毒(用于急救重金属中毒)6、呈色反应：双缩尿反应，等双缩尿反应可检测蛋白质的水解程度二、蛋白质的分离纯化1、透析及超滤法* 透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。* 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。2、盐析、有机溶剂沉淀及免疫沉淀 *丙酮、乙醇等有机溶剂，可破坏蛋白质的水化层，在04低

39、温下，使蛋白质沉淀。环境温度高等不良因素影响下，有机溶剂可促使蛋白质变性。*盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 * 免疫沉淀法：利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。 3、电泳蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。根据支撑物不同，分为薄膜电泳、凝胶电泳等几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。4、层析(chromatography)或色谱法待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据待分离蛋白质的颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而分离蛋白质。凝胶过滤（分子筛，gel filtration；排阻色谱）：利用各蛋白质分子大小不同分离。离子交换：蛋白质的电荷量及性质不同。阳离子交换剂：CM-纤维素阴离子交换剂：DEAE-纤维素亲和层析：抗原-抗体，配体