基因重组方法全

1、会计学1基因重组方法全基因重组方法全第1页/共53页细菌的三种水平基因转移形式细菌的三种水平基因转移形式接合接合转导转导自然转化自然转化3.13.1 原核生物的基因重组原核生物的基因重组第1页/共53页第2页/共53页接合接合 (conjugation)(conjugation)：细胞与细胞的直接接触（由细胞与细胞的直接接触（由F F因子介导）因子介导）转导转导(transduction)(transduction)：由噬菌体介导由噬菌体介导自然遗传转化自然遗传转化(natural genetic transformation)(natural genetic transformation)：

2、游离游离DNADNA分子分子 + + 感受态细胞感受态细胞第2页/共53页第3页/共53页3.1.1细菌的接合作用(conjugation)通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程(1).实验证据1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验（参见 P 215）第3页/共53页第4页/共53页中间平板上长出的原养型菌落中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！和重组所致！第4页/共53页第5页/共53页证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（ Bernard D

3、avis，1950 ）第5页/共53页第6页/共53页(2) (2) 机制机制( (大肠杆菌的接合机制大肠杆菌的接合机制) )接合作用是由一种被称为接合作用是由一种被称为F F因子的质粒介导因子的质粒介导F F因子的分子量通常为因子的分子量通常为5 510107 7，上面有编码细菌产生性菌毛，上面有编码细菌产生性菌毛（sex pilisex pili）及控制接合过程进行的）及控制接合过程进行的2020多个基因。多个基因。含有含有F F因子的细胞：因子的细胞：“雄性雄性”菌株（菌株（F F+ +），其细胞表面有性菌毛），其细胞表面有性菌毛 不含不含F F因子的细胞：因子的细胞：“雌性雌性”菌株（

4、菌株（F F- -），细胞表面没有性菌毛），细胞表面没有性菌毛第6页/共53页第7页/共53页F F因子为附加体质粒因子为附加体质粒既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上第7页/共53页第8页/共53页F F因子的四种细胞形式因子的四种细胞形式a a）F F- -菌株，菌株， 不含不含F F因子，没有性菌毛，但可以通过因子，没有性菌毛，但可以通过 接合作用接收接合作用接收 F F因子而变成雄性菌株（因子而变成雄性菌株（F F+ +）；）；b b）F F+ +菌株，菌株， F F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。因子

5、独立存在，细胞表面有性菌毛。c c）HfrHfr菌株，菌株，F F因子插入到染色体因子插入到染色体DNADNA上，细胞表面有性菌毛。上，细胞表面有性菌毛。d d）FF菌株，菌株，HfrHfr菌株内的菌株内的F F因子因不正常切割而脱离染色体时，因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游离的但携带一小段染色体基因的形成游离的但携带一小段染色体基因的F F因子，特称为因子，特称为FF因因 子。子。 细胞表面同样有性菌毛。细胞表面同样有性菌毛。第8页/共53页第9页/共53页1 1） F F+ +F F- -杂交杂交杂交的结果：杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为给体细胞和受体细胞均成为F F+ +细

6、胞细胞理化因子的处理可将理化因子的处理可将F F因子消除而使因子消除而使F F+ +菌株变成菌株变成F F- -菌株菌株F F+ +菌株的菌株的F F因子向因子向F F- -细胞转移，但含细胞转移，但含F F因子的宿主细胞因子的宿主细胞的染色体的染色体DNADNA一般不被转移。一般不被转移。第9页/共53页第10页/共53页Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株高频重组菌株。2）Hfr F-杂交Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的

7、是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leading region)结合着染色体DNA向受体细胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故HfrF-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。第10页/共53页第11页/共53页染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。F因子不易转入受体细胞中，故HfrF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是F-。第11页/共53页第12页/共53页3）FF-杂交Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱

8、离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。FF-与F+F-的不同：给体的部分染色体基因随F一起转入受体细胞a）与染色体发生重组；b）继续存在于F因子上， 形成一种部分二倍体；细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导（F-duction），或F因子媒介的转导（F-mediated transduction）。第12页/共53页第13页/共53页第13页/共53页第14页/共53页3.1.2 细菌的转导（transduction）由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中能将一个细菌宿

9、主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体细菌转导的二种类型：普遍性转导局限性转导第14页/共53页第15页/共53页(1)(1)普遍性转导（普遍性转导（generalized transductiongeneralized transduction）噬菌体可以转导噬菌体可以转导给体染色体的任何部分给体染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程到受体细胞中的转导过程1) 1) 意外的发现意外的发现19511951年，年，Joshua LederbergJoshua Lederberg和和Norton ZinderNorton Zinder为了证实大肠杆菌以外为了证实大肠杆菌以外

10、的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验：的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验：用用“U U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！不接触的情况下，同样出现原养型细菌！第15页/共53页第16页/共53页沙门氏菌沙门氏菌LT22ALT22A是携带是携带P22P22噬菌体的溶源性细菌噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌另一株是非溶源性细菌一个表面看起来的常规研究却导致一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重

11、要例证！一个惊奇和十分重要发现的重要例证！基因的传递很可能是由可透过基因的传递很可能是由可透过“U U”型管滤板型管滤板的的P22P22噬菌体介导的噬菌体介导的（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）第16页/共53页第17页/共53页管的中间用烧结玻璃滤板管的中间用烧结玻璃滤板隔开，它只允许液体和比隔开，它只允许液体和比细菌小的颗粒通过细菌小的颗粒通过 管的右臂放溶源性细菌管的右臂放溶源性细菌LA-22LA-22（受体），左臂放（受体），左臂放敏感菌敏感菌LA-2LA-2（供体）（供体） 用泵交替抽吸，使两用泵交替抽吸，使两端的液体来回流动端的液体

12、来回流动 LA-22LA-22端出现了原养型端出现了原养型的个体（的个体（his+,try+his+,try+） 实验现象实验现象第17页/共53页第18页/共53页溶源性菌株溶源性菌株LA-22 LA-22 中少数细胞在培养中少数细胞在培养过程中自发释放出温和型噬菌体过程中自发释放出温和型噬菌体P22 P22 通过滤板感染另一端的敏感菌株通过滤板感染另一端的敏感菌株LA-2 LA-2 LA-2LA-2裂解后，产生大量的裂解后，产生大量的“可滤过因子可滤过因子”，其中极少数在成熟过程中包裹了，其中极少数在成熟过程中包裹了LA-2LA-2的的DNADNA片段片段( (含含try+try+基因基因

13、) ) 通过滤板再度感染通过滤板再度感染LA-22 LA-22 重组后得到原养型（重组后得到原养型（his+,try+his+,try+）的转导子）的转导子 第18页/共53页第19页/共53页鼠伤寒沙门氏菌的普遍性转导第19页/共53页第20页/共53页转导噬菌体为什么转导噬菌体为什么“错错”将宿主的将宿主的DNADNA包裹进去包裹进去? ?噬菌体的噬菌体的DNADNA包装酶包装酶酶也能识别染色体酶也能识别染色体DNADNA上类似上类似pacpac的位点的位点并进行切割，以并进行切割，以“headfulheadful”的包装机制包装进的包装机制包装进P22P22噬菌体外壳，噬菌体外壳，形成只

14、含宿主形成只含宿主DNADNA的转导噬菌体颗粒的转导噬菌体颗粒（假噬菌体）（假噬菌体）。因为染色体上的因为染色体上的pacpac与与P22 DNAP22 DNA的的pacpac序列不完全相同，序列不完全相同，利用效率较低，这种利用效率较低，这种“错装错装”机率一般仅约机率一般仅约1010-6-6-10-10-8-8第20页/共53页第21页/共53页形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的，但必须形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的，但必须具有能偶尔识别宿主具有能偶尔识别宿主DNADNA的包装机制并在宿主基因组完全降解的包装机制并在宿主基因组完全降解以前进行包装。以前进行包装。

15、普遍性转导的基本要求：普遍性转导的基本要求：第21页/共53页第22页/共53页普遍性转导的三种后果：进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子流产转导（abortive transduction）转导DNA不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。特点：在选择培养基平板上形成微小菌落外源DNA被降解，转导失败。DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。第22页/共53页第23页/共53页(2)(2)局限性转导（局限性转导（specialized transductionspecialized transdu

16、ction）温和噬菌体感染温和噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体割而连在噬菌体DNADNA上上部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中第23页/共53页第24页/共53页温和噬菌体裂解时的不正常切割：包含gal或bio基因（几率一般仅有10-6）缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的DNA分子一样进行

17、复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。第24页/共53页第25页/共53页局限性转导与普遍性转导的主要区别：局限性转导与普遍性转导的主要区别：a a）被转导的基因共价地与噬菌体）被转导的基因共价地与噬菌体DNADNA连接，与噬菌体连接，与噬菌体DNADNA一起一起 进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的 可能全部是宿主菌的基因。可能全部是宿主菌的基因。b b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因）局限性

18、转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因 导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基 因具有随机性。因具有随机性。第25页/共53页第26页/共53页 溶源转变（溶源转变（lysogenic conversionlysogenic conversion）：）：一个与转导相似又不同的现象一个与转导相似又不同的现象温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。溶源转变与转导的不同？溶

19、源转变与转导的不同？a a）不携带任何供体菌的基因；）不携带任何供体菌的基因；b b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；第26页/共53页第27页/共53页3.1.33.1.3细菌的遗传转化（细菌的遗传转化（genetic transformationgenetic transformation）定义：定义：同源或异源的游离同源或异源的游离DNADNA分子分子( (质粒和染色体质粒和染色体DNA)DNA)被自然被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程自然遗传转化（自然遗传转化（na

20、tural genetic natural genetic transformationtransformation）人工转化（人工转化（artificial transformationartificial transformation）感受态细胞：感受态细胞：具有摄取外源具有摄取外源DNADNA能力的细胞能力的细胞（competent cellcompetent cell）第27页/共53页第28页/共53页自然感受态与人工感受态的不同？自然感受态与人工感受态的不同？自然感受态自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，的出现是细胞一定生长阶段的生理特性， 受细菌自身的基因控制；受细菌自

21、身的基因控制；人工感受态人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有则是通过人为诱导的方法，使细胞具有 摄取摄取DNADNA的能力，或人为地将的能力，或人为地将DNADNA导入细胞内。导入细胞内。 （该过程与细菌自身的遗传控制无关！）（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）第28页/共53页第29页/共53页(1)自然遗传转化（简称自然转化）1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae） 的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力进行自然转化，需要二方面必要的条件：建立了感受态的受体细胞感受态的受体细胞外源游离外源游离DNADNA分子分子

22、第29页/共53页第30页/共53页枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）分泌感受态因子分泌感受态因子与细胞表面受与细胞表面受体体M M相互作用相互作用 诱导特异蛋白质如自溶素表达诱导特异蛋白质如自溶素表达 使细胞表面的使细胞表面的DNADNA结合蛋白及结合蛋白及核酸酶裸露出来核酸酶裸露出来，使其具有与，使其具有与DNADNA结合的活性结合的活性 双链双链DNADNA与感受态细胞表面的特定位与感受态细胞表面的特定位点吸附，点吸附，DNADNA的一条单链被降解，另的一条单链被降解，另一条单链进入受体细胞，并与受体一条单链进入受体细

23、胞，并与受体细胞染色体细胞染色体DNADNA的同源部分配对，接的同源部分配对，接着受体染色体上相应单链片段被切着受体染色体上相应单链片段被切除，并被外来的单链除，并被外来的单链DNADNA交换、整合交换、整合和取代，形成杂种和取代，形成杂种DNADNA， 第30页/共53页第31页/共53页自然转化过程的特点：自然转化过程的特点：a a）对核酸酶敏感；）对核酸酶敏感；c c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNADNA） 给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；d d）通常情况下质粒的自然转化效率要低

24、得多；）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；提高质粒的自然转化效率的二种方法：提高质粒的自然转化效率的二种方法：1 1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有 活性的质粒的几率大大提高；活性的质粒的几率大大提高；2 2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌-重组获救重组获救b b）不需要活的）不需要活的DNADNA给体细胞；给体细胞；第31页/共53页第32页/共53页噬菌体噬菌体DNADNA被感受态

25、细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒转染转染(transfection)(transfection)：现在把现在把DNADNA转移至动物细胞的过程也称转染转移至动物细胞的过程也称转染提纯的噬菌体提纯的噬菌体DNADNA以转化的（而非感染）途径进入细胞以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。并表达后产生完整的病毒颗粒。特点：特点：第32页/共53页第33页/共53页接合接合 (conjugation)(conjugation)：细胞与细胞的直接接触（由细胞与细胞的直接接触（由F F因子介导）因子介导）转导转导(transduction)(tra

26、nsduction)：由噬菌体介导由噬菌体介导自然遗传转化自然遗传转化(natural genetic transformation)(natural genetic transformation)：游离游离DNADNA分子分子 + + 感受态细胞感受态细胞“接合接合” “转导转导” 及“自然转化自然转化”这三种在自然界中存在的细菌遗传重组过程各自的特点：a）外源DNA的来源及进入途径有差异；b）决定因素也各有不同；第33页/共53页第34页/共53页(2)(2)人工转化人工转化用用CaClCaCl2 2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。在自然转化

27、的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。是基因工程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源种可以摄取外源DNADNA的的“人工感受态人工感受态”。质粒的转化效率高；质粒的转化效率高；第34页/共53页第35页/共53页在自然环境中，真核微生物就存在有性生殖和准性生殖等基因重组的形式。 酵母菌有性杂交 霉菌的准性杂交 3.2 真核生物的基因重组第35页/共53页第36页/共

28、53页3.2.1 3.2.1 酵母菌的有性杂交酵母菌的有性杂交 酵母菌的生活史既包括二倍体、单倍酵母菌的生活史既包括二倍体、单倍体世代，又包括有性和无性世代。体世代，又包括有性和无性世代。 二倍体二倍体单倍体单倍体减数分裂形成子囊孢子减数分裂形成子囊孢子 每个子囊中含每个子囊中含有四个单倍体有四个单倍体的子囊孢子的子囊孢子 第36页/共53页第37页/共53页酿酒酵母的双倍体和单倍体细胞比较酿酒酵母的双倍体和单倍体细胞比较 第37页/共53页第38页/共53页酿酒酵母酿酒酵母 两种接合型两种接合型和和a a （单倍体）（单倍体） 融合融合二倍体细胞二倍体细胞(/a)(/a)酿酒酵母接合型是由自

29、身的遗传特性决定的酿酒酵母接合型是由自身的遗传特性决定的 受受MATMAT活性区调控，由活性区调控，由MATMAT启动子控制启动子控制第38页/共53页第39页/共53页基因基因插入该座插入该座位，那么细胞就位，那么细胞就是接合型是接合型 a a基因插入则是基因插入则是a a型型 和和a a基因是不表达的沉默基因，只在发生接合型基因是不表达的沉默基因，只在发生接合型（单倍体）转变时用作（单倍体）转变时用作或或a a基因插入的来源基因插入的来源 第39页/共53页第40页/共53页3.2.23.2.2霉菌的生殖霉菌的生殖 霉菌的基因重组一般也可以通过有性生殖或准性生霉菌的基因重组一般也可以通过有

30、性生殖或准性生殖过程完成殖过程完成准性生殖是指不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程准性生殖是指不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程异核体的形成、二倍体的形成以及体细胞交换和单倍体化异核体的形成、二倍体的形成以及体细胞交换和单倍体化 第40页/共53页第41页/共53页霉菌的有性生殖有性孢子繁殖两个性细胞结合产生新个体的过程a）质配：两个性细胞结合，细胞质融合，成为双核细胞 ，每个核均含单倍染色体（n+n）。b）核配：两个核融合，成为二倍体接合子核，此时核的 染色体数是二倍（2n）。c）减数分裂：具有双倍体的细胞核经过减数分裂，核中的 染色体数目又恢复到单倍体状态。第41页/共53页第4

31、2页/共53页接合孢子接合孢子孢囊孢子孢囊孢子第42页/共53页第43页/共53页 霉菌的准性生殖霉菌的准性生殖菌丝联结菌丝联结 形态上无区别、形态上无区别、遗传特性有差别遗传特性有差别的体细胞之间的体细胞之间 细胞核由一根菌细胞核由一根菌丝进入另一根菌丝进入另一根菌丝形成含两种或丝形成含两种或两种以上基因型两种以上基因型的异核菌丝的异核菌丝 异核体异核体 核融合核融合 杂合双倍体杂合双倍体 有丝分裂过有丝分裂过程中染色体程中染色体之间的交换之间的交换 体细胞交换体细胞交换及单倍体化及单倍体化 第43页/共53页第44页/共53页 准性生殖与有性生殖的比较准性生殖与有性生殖的比较 第44页/共

32、53页第45页/共53页细菌的三种水平基因转移形式细菌的三种水平基因转移形式接合接合转导转导自然转化自然转化3.13.1 原核生物的基因重组原核生物的基因重组第45页/共53页第46页/共53页接合接合 (conjugation)(conjugation)：细胞与细胞的直接接触（由细胞与细胞的直接接触（由F F因子介导）因子介导）转导转导(transduction)(transduction)：由噬菌体介导由噬菌体介导自然遗传转化自然遗传转化(natural genetic transformation)(natural genetic transformation)：游离游离DNADNA分子分子 + + 感