血清对肾细胞癌诊断意义ppt课件

1、 MicroRNAs in Renal Cell Carcinoma: DiagnosticImplications of Serum miR-1233 Levels血清血清miR-1233对肾细胞癌诊断意义对肾细胞癌诊断意义Lena M. Wulfken1Rudolf MoritzCarsten Ohlmann, Stefan HoldenriederVolker Jung, FrankEdwin HerrmannGisela Walgenbach-Bru nagelBeckerAlexander von RueckerStefan C. Mu ller miRNA miRNA是一类长约是一

2、类长约 1924 nt 1924 nt的非编码单链小的非编码单链小RNARNA分分子子, , 在动物中在动物中, , 绝大多数绝大多数miRNAmiRNA可以经过与靶基因可以经过与靶基因 3 UTR3 UTR区互补结合区互补结合, , 抑制靶基因翻译成蛋白质抑制靶基因翻译成蛋白质, , 进进而在细胞、组织或个体程度上影响生物体的生长发而在细胞、组织或个体程度上影响生物体的生长发育育, , 并参与多种疾病过程。并参与多种疾病过程。已有研讨证明正常组织和肿瘤组织中已有研讨证明正常组织和肿瘤组织中miRNAmiRNA表达明表达明显改动显改动. miRNA. miRNA在不同肿瘤中具有特定的表达方式在

3、不同肿瘤中具有特定的表达方式. . 这些特点也使这些特点也使miRNAmiRNA有能够成为肿瘤诊断的新的生有能够成为肿瘤诊断的新的生物学标志和治疗药物作用的靶标。物学标志和治疗药物作用的靶标。 MethodsObjectives：迄今为止，还没有对肾癌：迄今为止，还没有对肾癌患者循环中微小程度进展研讨患者循环中微小程度进展研讨的报道。我们设计了用低密度芯片的报道。我们设计了用低密度芯片TaqMan Low Density Array技术技术检测并且用传统的检测并且用传统的 real-time PCR在一在一独立组中证明了最有趣的独立组中证明了最有趣的microRNAs， Participant

4、s Participants：我们搜集了肾肿瘤患者的血清，包括肾细胞癌：我们搜集了肾肿瘤患者的血清，包括肾细胞癌和良性肾肿瘤大嗜酸粒细胞瘤和良性肾肿瘤大嗜酸粒细胞瘤oncocytomaoncocytoma， 血管肌脂肪瘤血管肌脂肪瘤AngiomyolipomaAngiomyolipoma，选取了非恶性疾病的手术患者作为对照，选取了非恶性疾病的手术患者作为对照组，表，我们搜集来自、三所大学泌组，表，我们搜集来自、三所大学泌尿外科至这些患者术前的血液样本。尿外科至这些患者术前的血液样本。从血液样本中分别出血清。从血液样本中分别出血清。We also analyzed formalin-fixed,

5、 paraffin embeddedWe also analyzed formalin-fixed, paraffin embeddedtissue from six patients stored in the archival files of the Institut tissue from six patients stored in the archival files of the Institut furPathologie at thefurPathologie at theRNA isolation：提取血清中提取血清中提取病理组织切片中的提取病理组织切片中的Statisti

6、cal methods：real-time PCR得出的数据用得出的数据用SDS software v2.4分析，分析，microRNA 程度用程度用RQ Managerv1.2.1计算出计算出, 数据分析用数据分析用DataAssist v2.0，数据统计用数据统计用SPSS17.软件，软件， microRNA 程度的特异程度的特异性、灵敏性用分析，性、灵敏性用分析，ResultsPhase-1: 标志物的发现标志物的发现 载样缓冲液作用：载样缓冲液作用：1增大样品密度，以确保增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内均匀进入样品孔内为了使样品能沉入胶孔，需参与适量的蔗糖、聚蔗糖为了使样品能

7、沉入胶孔，需参与适量的蔗糖、聚蔗糖400或甘或甘油以添加比重油以添加比重2使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利3含有指示剂，在电场中能以可预知速率向阳极泳动含有指示剂，在电场中能以可预知速率向阳极泳动指示剂指示剂 电泳过程中，常运用一种有颜色的标志物以指示样品的迁电泳过程中，常运用一种有颜色的标志物以指示样品的迁移过程。核酸电泳常用的指示剂有两种：移过程。核酸电泳常用的指示剂有两种：溴酚蓝溴酚蓝(bromophenol blue Bb) 呈蓝紫色，呈蓝紫色，二甲苯青蓝二甲苯青蓝(xylene cyanol，Xc) 呈蓝色。呈蓝色。 0.5TBE做电泳液时

8、溴酚蓝的泳动率约与长做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长300bp的双链的双链DNA一样，二甲苯氰蓝那么与一样，二甲苯氰蓝那么与4kbp的的DNA一样。所以根一样。所以根据分别样品中据分别样品中DNA分子的大小，可以参照指示剂分子的大小，可以参照指示剂Bb和和Xc的迁的迁移情况决议能否停顿电泳移情况决议能否停顿电泳 3 3 琼脂糖琼脂糖( Agarose)( Agarose)凝胶的制备凝胶的制备 制好的凝胶程度电泳槽程度电泳槽A A 通常将溴化乙锭通常将溴化乙锭EB (0.5EB (0.5微克毫升，母液微克毫升，母液10mg/ml10mg/ml) )渗人到凝胶和电泳缓冲液中。渗人到凝胶和电泳缓冲液中

9、。B B 也可使凝胶在不加溴化乙锭时进展电泳，也可使凝胶在不加溴化乙锭时进展电泳， 电泳终了后再柒电泳终了后再柒DNADNA。在室温下将凝胶浸埋在。在室温下将凝胶浸埋在含溴化乙锭含溴化乙锭 (0.5 (0.5微克毫升微克毫升) )的电泳缓冲液或水的电泳缓冲液或水中中4545分钟。分钟。 C C 而其他系列染色剂，例如而其他系列染色剂，例如SYBR GreenSYBR Green，GelRedGelRed，虽然毒性小，但价钱昂贵。虽然毒性小，但价钱昂贵。4 4、 琼脂糖凝胶中琼脂糖凝胶中DNADNA的染色的染色 溴化乙锭溴化乙锭( Ethidium bromide, EB)( Ethidium

10、bromide, EB)染色染色 EB EB嵌入嵌入DNADNA碱基碱基对之间对之间, , 会被紫外会被紫外光激发而放出约光激发而放出约600nm600nm的荧光的荧光. . EB EB为致癌物，操作时务必戴上手套为致癌物，操作时务必戴上手套!5353SGSGSGSGSGExcitationEmission5 5、加样、加样1 1 以紫外光做为光源以紫外光做为光源. .2 2需运用红或黄色滤光片去除光源干扰需运用红或黄色滤光片去除光源干扰. .3 3操作时须小心操作时须小心EB, EB, 务必戴上手套务必戴上手套. . 估计估计DNA分子量分子量31078872603310281/271234

11、194118720123456M121.522.533.5123456distance migrated (cm)log10 nucleotide pairs21DNA粗略定量粗略定量20kb20kb12kb12kb10kb10kb6kb6kb1.2kb1.2kb0.8kb0.8kb1. 1.将准确称量的粉状琼脂糖加人已定量的电泳缓冲液中；将准确称量的粉状琼脂糖加人已定量的电泳缓冲液中；2.2.在沸水浴中或微波炉中将糊状物加热直至琼脂糖完全溶解；在沸水浴中或微波炉中将糊状物加热直至琼脂糖完全溶解；3.3.将溶液冷却至将溶液冷却至50-60 oC50-60 oC，再参与溴化乙锭，再参与溴化乙锭

12、( (取自储存在取自储存在4 oC4 oC避避光瓶中光瓶中500500毫克毫升水中的母液毫克毫升水中的母液) )至终浓度为至终浓度为0.50.5微克毫升；微克毫升；5.5.将琼脂糖溶液灌注入制胶模具中，并立刻插入梳子，使其齿在将琼脂糖溶液灌注入制胶模具中，并立刻插入梳子，使其齿在接近胶一端的位置构成加样的孔格。接近胶一端的位置构成加样的孔格。6.6.当凝胶完全凝固后当凝胶完全凝固后( (在室温下在室温下3030一一4545分钟分钟) )，小心取出梳子，将，小心取出梳子，将胶安放在电泳槽中；胶安放在电泳槽中；7.7.加恰好足量的电泳缓冲液加恰好足量的电泳缓冲液( (假设需求可加假设需求可加0.5

13、0.5微克毫升的溴化微克毫升的溴化乙锭，使胶埋在溶液中深约乙锭，使胶埋在溶液中深约l l毫米处。毫米处。 8 .8 .加样加样样品与载样缓冲液混合后，加样品到已浸埋在缓冲液中的凝胶样品与载样缓冲液混合后，加样品到已浸埋在缓冲液中的凝胶孔格中。孔格中。载样缓冲液：通常制成载样缓冲液：通常制成6 6倍的浓缩液，与样品混合后，用微量倍的浓缩液，与样品混合后，用微量移液器加样。移液器加样。 9 .9 .电泳电泳电压：电压：5v/cm5v/cm，DNADNA向正极泳动直至溴酚蓝和二甲苯青蓝在凝向正极泳动直至溴酚蓝和二甲苯青蓝在凝胶中迁移出适当的间隔。胶中迁移出适当的间隔。 10 .10 .检测检测 紫外

14、灯，凝胶成像系统。防止紫外灯，凝胶成像系统。防止EBEB污染！污染！六、聚丙烯酰胺凝胶电泳六、聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel polyacrylamide gel electrophoresis, PAGEelectrophoresis, PAGE CH2=CHCH2=CHC=OC=ONH2NH2CH2=CHCH2=CH C=O C=O NH NH CH2 CH2 NH NH C=O C=O CH2=CH CH2=CH-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O C=O C=O NH2 NH NH2 NH C

15、H2 CH2 NH NH C=O C=O-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O C=O C=O NH2 NH2 NH2 NH2丙烯酰胺丙烯酰胺AcrAcrN,NN,N- -甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺BisBis聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺变性：凝胶在尿素等抑制核酸碱基配对的试变性：凝胶在尿素等抑制核酸碱基配对的试剂或蛋白变性剂剂或蛋白变性剂SDS如如SDS-PAGE电泳电泳)的的存在下发生聚合。用途包括单链存在下发生聚合。用途包括单链DNA的分的分别，如放射性别，如放射性DNA探针的分别、探针的分别、DNA测序测序反响产物的分析。反

16、响产物的分析。 SDS-PAGE用于蛋白质分用于蛋白质分子量的测定。子量的测定。3 3、聚丙烯酰胺凝胶较之琼脂糖凝胶有如下优点、聚丙烯酰胺凝胶较之琼脂糖凝胶有如下优点1 1在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好2 2分辨率极高，可分开长度仅相差分辨率极高，可分开长度仅相差0.10.1的的DNADNA分分子，即子，即1000bp1000bp中相差中相差1bp1bp3 3比琼脂糖凝胶的载样量大，在比琼脂糖凝胶的载样量大，在1cm 1cm 1mm 1mm的胶孔的胶孔中能上样到中能上样到10g10g的的DNADNA样品，而分辨率并无明显下样品，而分辨率并无

17、明显下降降4 4回收的回收的DNADNA样品纯度极高，可用于要求非常严样品纯度极高，可用于要求非常严厉的实验，如转基因动物实验，引物合成后的分别纯厉的实验，如转基因动物实验，引物合成后的分别纯化化5 5经常被用作分别蛋白质，且分别效果好。经常被用作分别蛋白质，且分别效果好。Acrg+BisgVmlX100%T=X100%Acrg+BisgBisgC=要制备透明而有弹性的凝胶，要制备透明而有弹性的凝胶， Acr/Bis要控制要控制在在30左右。左右。T在在25时，时， Acr/Bis 20左右；左右；T在在510时，时， Acr/Bis 40左右；左右；T在在1520时，时， Acr/Bis =

18、125200左右。左右。T在在325的范围内，凝胶易发生聚合。的范围内，凝胶易发生聚合。3 3在电场中构成不延续的电位梯在电场中构成不延续的电位梯度度8.38.38.96.78.38.38.96.72 2缓冲体系离子成分及缓冲体系离子成分及pHpH值的不延续性值的不延续性 ：低导区低导区制胶玻璃板制胶玻璃板 SDS十二万及磺酸钠)是阴离子外表活性剂，与蛋白质结合构成SDS-蛋白复合物，蛋白质分子即带大量的负电荷，并远远超越原来所带的电荷，使天然蛋白质分子之间的电荷差别降低，甚至可以忽略 同时蛋白质在SDS作用下构造变得松散，外形趋向一致，因此，排除了蛋白质的电荷和构造差别，SDS-蛋白质复合物

19、在电泳时的泳动差别就由蛋白质的分子量所决议。电荷效应SDS-PAGE 电泳过程电泳过程一试剂配置一试剂配置 1、30%丙烯酰胺混合液丙烯酰胺混合液Acr:Bis 为为29:1：称取丙烯：称取丙烯酰胺酰胺Acr29g及甲叉丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺Bis1g，用水溶，用水溶解并稀释至解并稀释至100ml，贮棕色瓶中于，贮棕色瓶中于4保管，可用一个保管，可用一个月。月。 Acr和和Bis有神经毒性！有神经毒性！ 2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：取缓冲液：取1mol/L HCL溶液溶液48ml、三羟甲基甲烷、三羟甲基甲烷Tris36.6g，加水至，加水至80ml使其溶解，调使其

20、溶解，调pH至至8.8，然后用水稀释至，然后用水稀释至100ml，置棕，置棕色瓶中，色瓶中，4储存。储存。 3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：取缓冲液：取1mol/L HCL溶液溶液48ml，Tris5.98g，加水至，加水至80ml，调，调pH6.8，用水，用水稀释至稀释至100ml，置棕色瓶中，置棕色瓶中，4储存。储存。4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液：称取甘氨酸电泳缓冲液：称取Tris 6g、甘氨酸、甘氨酸28.8g，加水，加水850ml，调，调pH至至8.3，加水到，加水到1000ml，4储存。用时可做储存。用时可做10倍稀释。倍稀释。 5、10% 过硫酸铵过硫酸铵A

21、P6、10%SDS十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠 称取称取 SDS 10g，加水，加水100ml使其溶解。戴好口罩使其溶解。戴好口罩7、四甲基乙二胺、四甲基乙二胺TEMED 8、上样缓冲液：取、上样缓冲液：取1.0mol/L pH6.8Tris-HCl缓冲液缓冲液6.25ml，蔗糖，蔗糖10g，SDS 2.3g，1g/L溴酚蓝溴酚蓝10ml，加，加蒸馏水溶解，混合至蒸馏水溶解，混合至100ml。 9、考马斯亮蓝染色试剂、考马斯亮蓝染色试剂 考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250染色液：染色液：浓度为浓度为2.5g/L，用甲醇，用甲醇 醋酸醋酸 蒸馏水蒸馏水=5 1 5的的溶液配制溶液配制V/V。 10、脱

22、色液：取冰醋酸、脱色液：取冰醋酸7.5ml、甲醇、甲醇5ml，加蒸馏水，加蒸馏水至至100ml。 11、样品、样品二灌胶二灌胶 1、先将胶板、先将胶板590mm封好，将配制好的分别胶液按封好，将配制好的分别胶液按配方灌注入胶板内，约配方灌注入胶板内，约70mm高度掌握分别胶的高高度掌握分别胶的高度，在凝胶外表悄然加一层正丁醇液约度，在凝胶外表悄然加一层正丁醇液约34mm。用于隔绝空气，使胶面平整。室温下静置约用于隔绝空气，使胶面平整。室温下静置约3060min。察看胶和正丁醇之间的界面，判别胶能否凝固。要在确察看胶和正丁醇之间的界面，判别胶能否凝固。要在确认分别胶彻底凝固后才开场配制浓缩胶。认

23、分别胶彻底凝固后才开场配制浓缩胶。 2、分别胶凝固好后，倒掉覆盖在分别胶外表的正、分别胶凝固好后，倒掉覆盖在分别胶外表的正丁醇，并用去离子水冲洗一次，倒置吸净残留的丁醇，并用去离子水冲洗一次，倒置吸净残留的水。将配制好的浓缩胶液灌注入胶板内约水。将配制好的浓缩胶液灌注入胶板内约15mm，插入适宜的梳齿，室温下静置约，插入适宜的梳齿，室温下静置约3060min。察看胶界面，判别胶能否凝固，预备加样。察看胶界面，判别胶能否凝固，预备加样。三样品预处置和加样三样品预处置和加样 1 1、取蛋白如血清、取蛋白如血清0.1ml0.1ml、适量上样缓冲液，混、适量上样缓冲液，混匀，在沸水中煮沸匀，在沸水中煮

24、沸5min5min。 2 2、将胶板放入垂直电泳槽中，夹紧，将、将胶板放入垂直电泳槽中，夹紧，将Tris-Tris-甘氨酸甘氨酸电泳缓冲液参与上、下槽中，电泳缓冲液要盖过胶电泳缓冲液参与上、下槽中，电泳缓冲液要盖过胶板口，然后用微量加样器或注射器将适量样品板口，然后用微量加样器或注射器将适量样品加到加样孔内。加到加样孔内。 四电泳四电泳 上槽接负极，下槽接正极，先调电流为上槽接负极，下槽接正极，先调电流为18mA/浓缩胶，开场电泳，当指示染料进入分别胶后，浓缩胶，开场电泳，当指示染料进入分别胶后，将电压调至将电压调至20mA/分别胶，继续电泳直至染料抵达距分别胶，继续电泳直至染料抵达距分别胶下

25、端约分别胶下端约1cm处，停顿电泳，断开电源。电泳时处，停顿电泳，断开电源。电泳时间约间约1.01.5h。 五考马斯亮蓝染色：电泳终了后，取出电泳胶五考马斯亮蓝染色：电泳终了后，取出电泳胶板。用剥胶器悄然撬起薄板的一头，一边用水轻冲，板。用剥胶器悄然撬起薄板的一头，一边用水轻冲，一边拿掉薄板，用细小水流推胶至至大培育皿中。一边拿掉薄板，用细小水流推胶至至大培育皿中。然后将凝胶板浸入考马斯亮蓝染色液中然后将凝胶板浸入考马斯亮蓝染色液中0.5-1h，再用，再用脱色液脱色脱色液脱色12天，至背景无色为止。区带可作定性天，至背景无色为止。区带可作定性或定量分析。或定量分析。 六分子量测定：准确量取并记

26、录染色后、各标志六分子量测定：准确量取并记录染色后、各标志蛋白质和各待测蛋白质区带的迁移率。蛋白质和各待测蛋白质区带的迁移率。经过作图求出目的蛋白分子量。经过作图求出目的蛋白分子量。考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250三苯基甲烷三苯基甲烷 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250二甲花青亮蓝二甲花青亮蓝染色方法染色方法 ：1 1、在、在90ml90ml甲醇：水甲醇：水1:11:1，v/v)v/v)和和10ml10ml冰乙酸的混合冰乙酸的混合液中溶解液中溶解0.25g0.25g考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250R250，用滤纸过滤染液以，用滤纸过滤染液以除去颗粒状物质。除去颗粒状物质。2 2、用至少、用至少5 5倍体积的

27、染液浸泡凝胶，放在平缓摇动的倍体积的染液浸泡凝胶，放在平缓摇动的平台上于室温染色平台上于室温染色1h1h以上。以上。3 3、回收染液，将凝胶浸泡于不加染料的甲醇、回收染液，将凝胶浸泡于不加染料的甲醇- -乙酸溶乙酸溶液中，平缓摇动液中，平缓摇动4-8h4-8h进展脱色，改换脱色液三四次。进展脱色，改换脱色液三四次。留意：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基留意：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此酸的含量不同，因此G250用于不同蛋白质测定用于不同蛋白质测定时有较大的偏向，在制造规范曲线时通常选用时有较大的偏向，在制造规范曲线时通常选用r-球蛋白质为规范蛋白质，以减少这方面的

28、偏向。球蛋白质为规范蛋白质，以减少这方面的偏向。1 1、搪瓷盘中倒入、搪瓷盘中倒入2000ml2000ml左右左右70%70%乙醇，把胶做好标志卸入乙乙醇，把胶做好标志卸入乙醇中，摇床上固定醇中，摇床上固定15min15min。3 3、190ml190ml蒸馏水中参与蒸馏水中参与3.6%3.6%的的NaOH4.2mlNaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml20%AgNO33.6ml、氨水、氨水2ml2ml混匀配成染色液。倒入染色液，染混匀配成染色液。倒入染色液，染色色30min30min。2、回收乙醇可反复用、回收乙醇可反复用3-5次，蒸馏水洗次，蒸馏水洗2遍，每遍遍，每遍2-3min，

29、尽能够把水倒净。尽能够把水倒净。4、倒掉染色液，蒸馏水洗、倒掉染色液，蒸馏水洗3遍，每遍遍，每遍2-3min，尽能够把水倒净。，尽能够把水倒净。5 5、200ml200ml蒸馏水中参与蒸馏水中参与1%1%柠檬酸钠柠檬酸钠1ml1ml，甲醛，甲醛100ul100ul混匀配成混匀配成显色液。倒入显色液显色至明晰。显色液。倒入显色液显色至明晰。6、倒掉显色液，加蒸馏水停显，并洗、倒掉显色液，加蒸馏水停显，并洗2-3遍。遍。分子杂交分子杂交molecular hybridizationmolecular hybridization( (一一) ) 种类种类 1. 1. 按其分子种类划分按其分子种类划分

30、 1 1 DNA DNA杂交杂交探针为探针为DNADNA或或RNA RNA 2 2 RNA RNA杂交杂交探针为探针为DNADNA或或cDNAcDNA 3 3 蛋白质免疫分析蛋白质免疫分析探针为抗体探针为抗体核酸分子杂交技术：具有一定同源性的两条互补的核核酸分子杂交技术：具有一定同源性的两条互补的核酸单链在一定的条件下酸单链在一定的条件下( (适宜的温度及离子强度等适宜的温度及离子强度等) )可可按碱基互补原那么退火构成双链，具有高度特异性按碱基互补原那么退火构成双链，具有高度特异性 。RNA DNA DNA RNA 待测核酸序列及探针待测核酸序列及探针1 1待测核酸序列：基因片段，基因组待测

31、核酸序列：基因片段，基因组DNADNA和细胞总和细胞总RNARNA。2 2探针：用于检测的知核酸片段称之为探针探针：用于检测的知核酸片段称之为探针(probe)(probe)探针：探针： 为了便于示踪，探针必需用一定的手段加以标为了便于示踪，探针必需用一定的手段加以标志，以利于随后的检测。常用的标志物是放射性同位志，以利于随后的检测。常用的标志物是放射性同位素，近年来也开展了一些非放射性标志物如地高辛、素，近年来也开展了一些非放射性标志物如地高辛、生物素等。检测这些标志物的方法都是极其灵敏的。生物素等。检测这些标志物的方法都是极其灵敏的。 地高辛地高辛(Digoxigenin,DIG)一种从洋

32、地黄类植物毛地黄一种从洋地黄类植物毛地黄和毛花毛地黄中提取的类固醇和毛花毛地黄中提取的类固醇Steroid物质物质 ，由于，由于洋地黄植物的花和叶片在自然界中的独一来源，因此抗洋地黄植物的花和叶片在自然界中的独一来源，因此抗DIG的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标志的需求异性标志的需求 生物素生物素-亲合素系统亲合素系统 (biotin-avidin system，BAS) 生物素可以与亲和素、链霉亲和素结合非常严密生物素可以与亲和素、链霉亲和素结合非常严密,比抗原抗体之间亲和力高几百万倍。比抗原抗体之间亲和力高几百万倍。所以，生

33、物素标志蛋白，可以用链霉亲和素标志的所以，生物素标志蛋白，可以用链霉亲和素标志的荧光或者二抗检测。荧光或者二抗检测。 蛋 白 质蛋白质免疫分析蛋白质免疫分析探针为抗体探针为抗体2. 2. 按样品制备过程划分按样品制备过程划分 1 1 原位杂交原位杂交(in situ hybridization) (in situ hybridization) i. i. 原位菌落杂交：原位菌落杂交：DNADNA探针与菌落探针与菌落DNADNA的杂交。的杂交。 ii. ii. 原位噬菌斑杂交：原位噬菌斑杂交： DNADNA探针与噬菌斑探针与噬菌斑DNADNA的杂的杂交。交。 iii. iii. 原位细胞杂交：原

34、位细胞杂交：cDNAcDNA与细胞中的与细胞中的RNARNA杂交杂交 iv. iv. 原位组织块杂交：原位组织块杂交：DNADNA探针与染色体探针与染色体DNADNA杂交。杂交。 以上都是原位裂解细胞，不需求分别以上都是原位裂解细胞，不需求分别DNADNA，RNARNA或蛋白质样品，可同时处置大量样品，常用于目的基或蛋白质样品，可同时处置大量样品，常用于目的基因的挑选或检测某类细胞或组织中能否存在某一特定因的挑选或检测某类细胞或组织中能否存在某一特定的的DNADNA、RNARNA或蛋白质序列。或蛋白质序列。2 2斑点杂交斑点杂交(dot hybridization)(dot hybridiza

35、tion) 先分别先分别DNADNA，RNARNA或蛋白质，然后将样品液直接或蛋白质，然后将样品液直接点在固体基质上进展杂交，不能测定分子量大小。点在固体基质上进展杂交，不能测定分子量大小。 3转移杂交或印迹杂交转移杂交或印迹杂交(blotting hybridization) 膜上印迹杂交是指将待测核酸序列片段结合到一定的膜上印迹杂交是指将待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标志的探针进展杂交固相支持物上，然后与存在于液相中标志的探针进展杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。最常用的几种固相支持物最常用的几种固相支

36、持物 硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulose filter, NCF)(Nitrocellulose filter, NCF)可与三类大分子结合，但是不能结合小分子可与三类大分子结合，但是不能结合小分子DNADNA，RNARNA和蛋白质和蛋白质20,00020,000 尼龙膜尼龙膜尼龙膜是目前较理想的一种核酸固相支持物它有尼龙膜是目前较理想的一种核酸固相支持物它有多种类型，除网眼大小不一样外，有的尼龙膜未经多种类型，除网眼大小不一样外，有的尼龙膜未经特殊处置，有些那么是经过了正电荷基团的修饰，特殊处置，有些那么是经过了正电荷基团的修饰，这种修饰的尼龙膜结合核酸的才干更强。这

37、种修饰的尼龙膜结合核酸的才干更强。( (三三) )分子杂交的普通程序分子杂交的普通程序 1) DNA 1) DNA和和RNARNA的杂交的杂交 制备制备DNADNA或或RNARNA样品样品与固定基质结合与固定基质结合8080真真空固定空固定预杂交预杂交参与标志探针杂交参与标志探针杂交洗涤洗涤放射自显放射自显影或显色反响。影或显色反响。 2 2蛋白质的免疫分析蛋白质的免疫分析 制备蛋白质样品制备蛋白质样品与固定基质结合与固定基质结合常温空气中固常温空气中固定定封锁剂封锁封锁剂封锁 一抗反响一抗反响洗涤洗涤二抗二抗- -酶偶联物反酶偶联物反响响洗涤洗涤显色反响显色反响EIAEIA 或或 一抗放射标

38、志物一抗放射标志物洗涤洗涤放射自显影放射自显影RIARIA2)Western blotting2)Western blotting杂交杂交杂交对象是蛋白质，是经过抗原抗体的免疫反响，从杂交对象是蛋白质，是经过抗原抗体的免疫反响，从混合样品中检测出特异的目的蛋白。混合样品中检测出特异的目的蛋白。 先将蛋白质混合物进展聚丙烯酰胺凝胶电泳展开，先将蛋白质混合物进展聚丙烯酰胺凝胶电泳展开， 然后将凝胶中的蛋白质条带转移到固相膜上。然后将凝胶中的蛋白质条带转移到固相膜上。 2 2 用待测目的蛋白的抗体一抗与固相膜上的蛋用待测目的蛋白的抗体一抗与固相膜上的蛋白质相互作用。白质相互作用。 3 3 经辣根过氧

39、化物酶或碱性磷酸酶标志的第二抗与经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标志的第二抗与第一抗反响后的固相膜作用，假设一抗能与目的蛋第一抗反响后的固相膜作用，假设一抗能与目的蛋白结合，那么二抗可以和第一抗结合，那么二抗衔白结合，那么二抗可以和第一抗结合，那么二抗衔接的标志酶与显色底物反响呈现颜色，从而可以确接的标志酶与显色底物反响呈现颜色，从而可以确定固相膜上目的蛋白的位置及分子质量大小。定固相膜上目的蛋白的位置及分子质量大小。l转膜转膜l封锁封锁l一抗杂交一抗杂交l二抗杂交二抗杂交l底物显色底物显色转膜转膜一抗、二抗孵育辣根过氧化物酶法辣根过氧化物酶法HRPHRP碱性磷酸酶法碱性磷酸酶法APAP化学发光法

40、化学发光法ECL)ECL) ECL ECL是指酶催化底物发荧光，荧光可使是指酶催化底物发荧光，荧光可使X X光片曝光片曝光光, , 检测的下限可到达检测的下限可到达pgpg程度程度 ) )三、三、DNADNA核苷酸序列的测序核苷酸序列的测序1 Sanger1 Sanger的双脱氧终止法的双脱氧终止法2 Maxam-Gilbert 2 Maxam-Gilbert 化学修饰法化学修饰法 3 DNA序列的自动化分析序列的自动化分析测序技术的建立测序技术的建立 DNA DNA测序即核酸测序即核酸DNADNA分子一级构造的测分子一级构造的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。定，是现代分子生物学一项重要

41、的技术。 1963 1963年，年，SangerSanger第一次完成胰岛素第一次完成胰岛素5151个氨个氨基酸的序列测定基酸的序列测定 70 70年代后期，年代后期，SangerSanger和和Maxam-GilbertMaxam-Gilbert等人又建立了核酸序列测定的方法，等人又建立了核酸序列测定的方法，SangerSanger双双脱氧链终止法和脱氧链终止法和Maxam-GilbertMaxam-Gilbert化学裂解法化学裂解法将核酸序列测定技术推进到将核酸序列测定技术推进到“直读阶段，使直读阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这

42、样人们可以经过核酸序列和遗传定容易，这样人们可以经过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。密码推导出蛋白质氨基酸的序列。O碱基碱基CPOHH12345O碱基碱基CPOHH12345OH脱氧核苷酸的衔接脱氧核苷酸的衔接1 1、 SangerSanger的双脱氧终止法的双脱氧终止法O碱基碱基CPOH12345O碱基碱基CPOHH12345H2O脱氧核苷酸的衔接脱氧核苷酸的衔接O碱基碱基CPHH12345O碱基碱基CPOHH12345OHX双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸?ATGCGGTACCAT53测序模板5四套反响体系四套反响体系1-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddATP2

43、-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddCTP3-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddGTP4-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddTTP TA5TACGCCA5TACGCCATGGTATACTACGCTACGCC第一套反响第二套反响ACGTATGGTACCGCATTACCATGGCGTA模板互模板互补序列补序列待测序列待测序列Sanger法测序产物的平法测序产物的平均链长取决于均链长取决于ddNTP与与dNTP的比例，比例高的比例，比例高时，得到较短的产物时，得到较短的产物直读碱基序列直读碱基序列手工测序结果手工测序结果 化学裂解法是

44、化学裂解法是Maxam和和Gilbert等人等人1977年创建的，用年创建的，用来测定来测定DNA序列。化学法是用化学试剂在序列。化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特处特定地裂解定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE胶电泳后，可以直接读出胶电泳后，可以直接读出DNA的顺序。的顺序。 荧光检测探头荧光检测探头电泳，看谁跑得快除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。四四 聚合酶链式反响聚合酶链式反响Polymerase Chain Polymerase Chain Reaction R

45、eaction ，PCRPCR 1 1、根本原理：基于、根本原理：基于DNADNA的半保管复制，两条链的半保管复制，两条链都可以作为模板。在体内，都可以作为模板。在体内，DNADNA复制是周期性复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；的，所以基因扩增的数量有限；PCRPCR技术在体技术在体外利用人工合成的引物，再加上外利用人工合成的引物，再加上DNADNA聚合酶和聚合酶和一些适宜的底物和因子，经过对温度的控制，一些适宜的底物和因子，经过对温度的控制，使使DNADNA不断位于变性、复性和合成的循环中，不断位于变性、复性和合成的循环中，到达扩增到达扩增DNADNA的目的。的目的。thermus a

46、quaticusTaq DNATaq DNA多聚酶的发现多聚酶的发现19881988年年Saiki Saiki 等从温泉等从温泉中分别的一株水生嗜中分别的一株水生嗜热杆菌热杆菌(thermus (thermus aquaticus) aquaticus) 中提取到一中提取到一种耐热种耐热DNADNA聚合酶。聚合酶。热稳定的聚合酶对简热稳定的聚合酶对简化化PCRPCR过程非常重要。过程非常重要。反复进展三步骤的循环过程：热变性反复进展三步骤的循环过程：热变性退火退火引引物延伸物延伸1热变性：基因组热变性：基因组DNA在在95度下加热度下加热5分，双螺旋构分，双螺旋构造被热变性解链为两股单链。造被

47、热变性解链为两股单链。2退火：将反响混合物降温至退火：将反响混合物降温至55摄氏度，引物与上述摄氏度，引物与上述单链单链DNA上互补的序列杂交在一同，即退火，构成模上互补的序列杂交在一同，即退火，构成模板板引物复合物。引物复合物。3 3引物延伸：在引物延伸：在DNADNA聚合酶作用下，以聚合酶作用下，以dNTPdNTP为原料，为原料，从引物从引物3 3端开场，沿着端开场，沿着5 533的方向，按照模板链的序的方向，按照模板链的序列，合成一条新列，合成一条新DNADNA链，其序列与模板序列互补。链，其序列与模板序列互补。 经上述变性经上述变性-退火退火-引物延伸这一循环，双链引物延伸这一循环，双

48、链DNADNA拷贝数添加一倍。进展拷贝数添加一倍。进展n n次循环，拷贝数将添加次循环，拷贝数将添加2 2的的n n次次方倍，如进展方倍，如进展25302530个循环，拷贝数即扩增上百万倍。个循环，拷贝数即扩增上百万倍。 Mg2+ Mg2+： DNA DNA聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂PCRPCR根本要素根本要素 25-35 25-35个循环个循环 长度：至少长度：至少 16bp 16bp ，通常为，通常为 18-30bp 18-30bp。 更短的引物普通会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。更短的引物普通会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。 引物的解链温度：两个引物之间的引物的解链

49、温度：两个引物之间的 Tm Tm 值差别最好在值差别最好在 2-5 2-5 。 对于小于对于小于 20 20 个碱基的引物其个碱基的引物其 Tm Tm 值可用简易公式计算，即值可用简易公式计算，即 Tm=4 Tm=4G+CG+C+2+2A+TA+T。 对于对于 20-70 20-70 个核苷酸的引物可用个核苷酸的引物可用 以下公式计算。以下公式计算。 Tm=81.5+16.6 Tm=81.5+16.61gK+1gK+0.41+0.41G+CG+C%-%-675/N675/N N N 表示引物的核苷酸数目，表示引物的核苷酸数目， K+ K+ 表示单价离子即钾离子的浓度表示单价离子即钾离子的浓度

50、防止引物内部或引物之间构成引物二聚体特别是引物的防止引物内部或引物之间构成引物二聚体特别是引物的 3 3端。端。 G+C G+C 含量：尽量控制在含量：尽量控制在 40% 40% 至至 60% 60% 之间，之间， 4 4 种碱基的分布应种碱基的分布应 尽能够均匀。尽量防止嘌呤或嘧啶的延续陈列，以及尽能够均匀。尽量防止嘌呤或嘧啶的延续陈列，以及 T T 在在 3 3 末末 端的反复陈列。端的反复陈列。 引物的引物的 3 3 末端最好是末端最好是 G G 或或 C C ，但不要，但不要 GC GC 连排。连排。6 6 限制性酶切位点之前加维护碱基限制性酶切位点之前加维护碱基E HE H55A33

51、A2 2T-T-载体载体pMD18-TVector是一种高效克隆是一种高效克隆PCR产物的公用载产物的公用载体。本载体由体。本载体由pUC18载体改建而成，在载体改建而成，在pUC18载体载体的多克隆位点处的的多克隆位点处的XbaI和和SalI识别位点之间插入了识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用识别位点，用EcoRV进展酶切反响后，再进展酶切反响后，再在两侧的在两侧的3端添加端添加“T而成。载体特点：将普通而成。载体特点：将普通的克隆载体切成线状，并使之的克隆载体切成线状，并使之3末端含有一个突出末端含有一个突出碱基碱基T.可以大大提高可以大大提高PCR产物的衔接、克隆效率。产物的衔接、

52、克隆效率。 RT-PCRreverse transcriptase-PCR,RT-PCR):又称反又称反转录转录PCR, 是以反转录的是以反转录的cDNA作模板所进展的作模板所进展的PCR，可对基，可对基因的表达和序列多态性分析。因的表达和序列多态性分析。聚合酶聚合酶cDNAPCR扩增AAAnAAAAnA逆转录酶逆转录酶反转录反转录 T T TnTcDNA第一链第一链mRNA常规常规PCRPCR技术：技术：对对PCRPCR扩增反响的终产物进展定量及定性分析扩增反响的终产物进展定量及定性分析定量定量PCRPCR技术：技术：对对PCRPCR扩增反响中每一个循环的产物进展定量及定性扩增反响中每一个循

53、环的产物进展定量及定性分析分析原理：原理：实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术，是指在技术，是指在PCRPCR反响体反响体系中参与荧光基团，利用荧光信号积累实系中参与荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个时监测整个PCRPCR进程，最后经过规范曲线进程，最后经过规范曲线对未知模板进展定量分析的方法。对未知模板进展定量分析的方法。 定量曲线定量曲线 荧光定量PCR扩增曲线可以分成三个阶段：1荧光背景信号阶段基线期在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判别产物量的变化。2荧光信号指数扩增阶段对数期只需在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进展定量分析。3平台期扩增产物已不再呈指数级的添加。域值域值threshold：将荧光信号由本底进入指数：将荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的荧光强度设定为域值。增长阶段的拐点所对应的荧光强度设定为域值。普通荧光域值的设置是普通荧光域值的设置是 基线背景荧光信号的基线背景荧光信号的规范偏向的规范偏向的 10 倍。倍。Ct值值Cycle threshold：荧光信号到达