原子力显微术研究生物样品的弹性

1、原子力显微术研究生物样品的弹性原子力显微术研究生物样品的弹性王艳霞王艳霞2002年12月14日作为生命基本单元的细胞，是一个生物学的复合系统。测量细胞的弹性，在AFM面世之前就受到广泛的关注。迅速发展的细胞生物学表明，细胞内部的细胞骨架(cytoskeleton)是高度有组织的网状分子细丝。这种动态的网状组织是各种细胞功能的基础，这些细胞功能之中包括细胞的粘附和细胞的运动。对细胞结构的组分生化辨识和描述，是定量测量细胞骨架的物理性质的基础。细胞骨架是一个由肌动蛋白细丝（610nm）、间质细丝（711nm）和细胞的微管丝（25nm）组成的有机结构。细胞骨架的力学性质对于细胞的形状、细胞的扩展、细

2、胞的蠕变、细胞的极性和细胞的分裂等其他的功能都有相当重要的决定性作用，已逐渐成为业内的共识。与悬浮细胞不同，附着细胞的变形在很大程度上决定于细胞骨架，同时还受到细胞与周围环境特别是细胞与胞外基体（ECM）之间的力学作用及生化作用的影响。正如许多工程材料一样，有外力作用在细胞表面时，细胞也会发生形变。这种变化用细胞的力学性质描述。细胞的力学性质决定于细胞的组成、细胞的结构以及细胞与周围物质的相互作用。影响细胞的力学性质的外部因素千变万化。细胞的形变性质还受到细胞内部的某些特定结构的控制，生物细胞的力学性质会影响细胞的整体形变。与其他物质不同，外力作用的同时也会产生细胞的生理反应。许多实验发现正常

3、细胞与病态细胞的生存条件与他们周围的力学环境有关。细胞力学中的一个研究热点就是使用外力调节细胞的某些功能。 这方面的工作包括：对生物组织的细胞施加何种形式的力，能够使得细胞黏附于细胞外部的基体(cell-extra cellular matrix)；可以完成这种黏附的力的量值有多大；这些力如何在细胞内部进行转换和分布；以及它们是如何进行生物信息的传导、如何产生生理反应等等。这个方向的深入研究包括确定具体分子对机械力的转换、感知过程的途径（生理过程）、判别多个生物化学过程的层叠、确定各种分子的性质等；还可以研究细胞内部的力学调控机理，包括对细胞骨架的研究。 目前，细胞力学的实验研究方法有：移液管

4、吸入法（micropipette aspiration)、动态反射干涉对照法(flicker)、光学钳(optical tweezers)、 扫描声学显微镜(scanning acoustic microscope)、挤压刺探法(poking)等，测量生物样品的表面间相互作用和弹性的方法还有表面力仪等等。这些方法多数是相对较大面积内的平均特性，从而影响这些技术的空间分辨率。空间分辨率的限制，影响了对细胞力学性质的研究 。AFM的横向分辨率比上述方法都高。利用AFM对细胞的力学性质的研究方法类似于，使用玻璃纤维压陷细胞的某个局部，对细胞进行挤压、刺探的方法。实验方法移液管吸入法 1989年，Yo

5、ung and Evans在Biophysical Journal 56: 139149（Cortical shell-liquid core model for passive low of liquid-like spherical cells into micropipettes）对细胞的结构和变形给出了测量方法和定量分析； 1996年，J. Shao和R. M. Hochmuth等，在Biophysical Journal 71:28922901（Micropipette suction for measuring piconewton forces of adhesion and t

6、ether formation from neutrophil membranes）测量了细胞膜在皮牛顿量级的作用力； 1988年，Theret等，在the application of a homogeneous half-space model in the analysis of endothelial cell micropipette measurements，Journal of mechanical Engineering 110: 190199中对上皮细胞进行了研究; 1990年，Sato和Theret等，在Application of the micropipette tec

7、hnique to the measurement of cultured porcine aorticendothe lial cell viscoelastic properties，Journal of mechanical Engineering 112: 263268对软骨细胞进行了研究； 1999年，Jones等，在Alterations in the Youngs modulus and volumetric properties of chodrcytes isolated from normal and osteoarthritic human cartilage，Journ

8、al of mechanics 32: 119127中讨论了固体弹性模型（上皮细胞和软骨细胞）和固体粘弹性模型（软骨细胞）微移液管测量变形的弹性模量是几百帕，粘性系数是几千泊。利用闪烁或者动态反射干涉对照谱研究1987年，Zilker等人Journal of Physics 48:21392151，Dynamic reflection interference contract (RIC) microscopy: a new method to study surface excitations of cells and to measure membrane bending elastic

9、moduli；1990年，Zeman等的文章Bending undulations and elasticity of the erythrocyte membrane: effect of cell shape and membrane organization (European Biophysics Journal 18: 203219)。利用光学钳（红外激光阱）的方法 1989年，Ashkin and Dziedzic等, Internal cell maniplulation using infrared laser traps, Proceedings of the Nationa

10、l Academy of Science, 86: 79147918； 1992年，Svoboda et al., Conformation and elasticity of the isolated red blood cell membrane skeleton, Physics Journal 63: 784793； 1995年，J, Sheetz M.P.等，Mechanical properties of neuronal growth cone membranes studied by tether formation with laser optical tweezers. B

11、iophysical Journal 68:98896。扫描声学显微镜研究分布在细胞表面的力 1991年，Luers, H., K. Hillmann, J. Litniewski, and J. Berciter. Acoustic microscopy of cultured cells: distribution of forces and cytoskeletal elements. Cell Biophys. 18:279 293； 1995年，Bereiter-Hahn, J., K. Ilonka, H. Luers, and M. Voth. Mechanical basis

12、of cell shape: investigations with the scanning acoustic microscope. Biochem. Cell Biol. 73:337348。磁分析装置和剪切流量测量技术 磁分析装置中磁粒子被限制于细胞外部的接收器或被引入完整的活细胞内以及各种磁分析装置。 1987年，Valberg and Feldman等； 1994年，Wang and Ingber等； 1997年，Maniotis等， 1993年，Wang N, Bulter JP, Ingber PE. Science，260:11247。 剪切流量测量技术 1993年，Kuo

13、SC, Lauffenburger DA等， Biophysical Journal;65:2191200。表面力仪 表面力仪SFA（surface force apparatus）可以测量分子尺度的表面之间的相互作用力、两表面之间的几何形状和绝对间距。两片相同厚度的背部镀银的透明云母片粘附在柱形弯曲的硅板上构成基底。不断提高灵敏度的四步机构控制两表面之间的间距在5mm范围内，该四步机构具有1埃的分辨率。利用光正常通过两表面时多光干涉条纹的移动，可测到两表面的间距达1埃。当测到强吸引力(strongly attractive forces)，同时出现机构的不稳定导致表面从一个稳定的位置跳跃到另

14、一个稳定的位置。只要力的变化量超过弹性强度(the spring stiffness)时，就会出现不稳定。对细胞进行挤压、刺探的方法早在1982，年Peterson等人，在Proceedings of the national Academy of science(Vol.79 pp53275331)中发表文章题为Dependence locally measured cellular deformability on position on the cell, temperature and cytochalasin；1990年，Zahalak等人，在Journal of Biomechan

15、ical Engineering 112:283294 中发表题为Determination of cellular mechanical properities by cell poking, with an application to leukocytes。这种方法刺探细胞的工具是尖锐的玻璃纤维。利用玻璃纤维的平端面压陷细胞，研究细胞基于阻抗的变形。在细胞刺探实验中，精密的玻璃针尖将细胞压陷一定量值后，迅速撤开玻璃探针，在明场模式记录逐渐释放的压陷。不同的细胞被压陷的面积明显不同，说明细胞对机械力的阻碍不同。玻璃纤维的直径为2m。利用AFM或者称为纳米压陷器，对细胞施加一定的作用力，从而

16、确定表面的局域性质。这些性质包括细胞膜的厚度、硬度、细胞的粘附以及表面力、摩擦力和能量分布的范围等等。同时，弹性变形正在被逐渐地重视。可以利用AFM分析力随探针移动的曲线，绘制基底的局域弹性图。对AFM成像的每点处的力进行测量、分析。在对探针样品系统施加负载的过程中，用赫兹模型描述细胞的弹性形变，用力学理论对样品的变形进行模拟。已有报道，在单独的点位置测量力随探针的纵向移动，通过分析力曲线绘制局域弹性图。原子力显微术研究活细胞的性质AFM不仅被用作分子、原子尺度的表面成像的工具，还可以用来测量探针与表面间的相互作用。对于生物材料，AFM除能够对生物样品成像外，还可以被用作测量和施加微小的作用力

17、。使用力调制模式可以定性的对任何样品成像，九十年代初期就有研究活细胞报道。利用AFM研究细胞的动态变化过程，这方面的研究包括追踪细胞内部的输运材料或者细胞骨架变化、追踪细胞的活化过程等等；对于细胞的静态性质包括细胞的形貌，细胞的内部组分及细胞与细胞内部组分的性质研究。被研究的细胞包括血细胞、骨和软骨细胞、肝细胞、肺细胞等等。也有正常细胞和基因突变细胞、纽带缺乏细胞、胚胎癌细胞等等。 如图是AFM追踪人体血小板活化过程的示意图。血小板是血液中主要成分之一，对血液凝结起重要作用。在封闭伤口的过程中，血小板要经历由圆饼状眠态到扁平状的激活态。这种形状的变化伴随着一系列生物化学变化。图中追踪到活化过程

18、的关键阶段。由图a和图b可以看到，被称为丝羽状外围突起；在随后的阶段，这些突起之间被细胞膜充满，这些细胞膜在图a到图c中被红色、蓝色箭头标出。从中心的高位置向周边输运的载体也都可见（图a中绿色箭头和图e、图f中的蓝色箭头）。对软样品的研究工作的是从对橡胶、软骨组织和活细胞等逐步开展的。如图是浸入水，或者丙醇，或者两种液体的混合液中的云母表面覆盖的明胶薄膜。在力曲线中，随着探针移向样品，直至最后接触的过程中，随时记录悬臂梁的偏移量值。然后反向移动探针，直至探针不再与样品表面接触。硬样品（100丙醇中的明胶）的力曲线有两个区域，一是偏移量值为常量的平坦区域（未接触），此时探针没有接触样品的表面；另

19、一个是探针触及样品表面的接触区域，悬臂梁的偏移量正比于样品的移动（图中第一条曲线的左侧倾斜部分）。如果是软样品，样品会受到探针的作用而变形，出现弹性凹陷。观察到的悬臂梁的反射量会比硬样品的小一些。力曲线相对较平坦。浸入水中的部分增多，明胶膨胀变得越来越软，曲线越来越平坦。 如神经细胞、纤维原细胞和上皮细胞等真核状态的细胞，细胞的形貌和细胞的移动源自于细胞膜、细胞骨架、与细胞有关的蛋白质、细胞外基体等，还与它们之间的复杂相互作用有关。细胞的结构和运动是在分子层面最难解释的现象之一。我们希望细胞力学性质的时间和空间分布可以更为深入地研究这些现象。 真核细胞的状态受到机械力平衡的控制，各种因素产生的

20、作用力达到平衡。这些作用力包括作用在细胞骨架上面的力、对邻近细胞的作用力，以及对底层的作用力等 (Ingber等 1994)。这个平衡一旦改变，细胞的形式、骨架结构及核形结构都会发生改变，从而影响细胞的生长、生命周期、基因表达等细胞行为，机械力的平衡与细胞骨架、细胞外部基体的力学性质、核结构等相关联(Ingber，1993)。细胞的力学性质与空间和时间的关系，与重大的生理过程紧密相关，如胚胎发育过程 (Fung, 1988; Ingber和Folkman, 1989; Ingber和Jamieson，1985)等，神经细胞对机械张力的反应也要经历生长和发育的变化（Zheng等，1991）。对活

21、细胞的粘弹性的空间分布和变化的测量可以深刻理解这些过程。 细胞弹性的测量细胞骨架是一网状结构。真核细胞的肌动蛋白网相当丰富。对肌动蛋白胶质的实时观测，可以深入研究细胞的力学性质。细胞骨架决定细胞的形状，细胞形状的变化和细胞的运动。上图是利用AFM测量细胞局域硬度的示意图。AFM的探针在细胞表面的一点压入细胞，较硬的细胞骨架对探针有阻碍作用，这个阻碍作用确定探针的压陷深度。 可以使用接触力学中的赫兹模型描述这种相互作用。宏观物体的弹性形变用虎克定律描述。虎克定律表明压力与张力（形变）的比值是一与材料形变性质有关的常数。该常数就是弹性模量。弹性模量是材料被拉长或者压缩时，产生的力学阻碍。杨氏模量（

22、又称为弹性模量）是单位表面积上的作用力。当压力和形变之间满足线性关系时，产生弹性形变；不再施加外力时，材料恢复原来的形状。材料的塑性表现在对力曲线的线性的偏离，去掉外加力后，材料不再恢复初始形状。再加大形变会使材料断裂。利用AFM测量样品的弹性时，将探针推向被研究的样品的表面，得到力距离曲线。测到的形变结果是探针的形变与被研究的样品的形变的总和。虽然AFM测量的是微观尺度，但探针压陷样品表面的原子数量很大（超过100个原子），经典理论仍然使用。 赫兹理论描述的是，在平坦的刚性基底表面，由于外加力F的作用，弹性物体的形变情况。对于弹性球体的形变量满足下式：（1）R是探针的曲率半径，Etip和ti

23、p分别是探针的杨氏模量和泊松比。 REFtiptip2222316)1(9利用AFM测量细胞的性质，模型可以看作是在平坦的刚性基底表面的弹性物体。在压陷过程中应该精确确定接触面积。一种方法是把悬臂梁的球形针尖认为是球体，作为对称的球形压头。如下图所示，b图中是这种探头的倒转AFM图像。探头的半径可以不同，从而压力也在一定范围变化。还可以利用球形探头研究同等作用力下，对应低压强、大接触面积的情况。低压强也对应小的压陷量。对于较薄的样品，在较大压陷量的情况比较复杂。在测力和建立样品的模型的过程中，不能忽略基底的作用。232134ERF 在球形和抛物面探头压陷样品时，可以利用赫兹模型近似描述无限大样

24、品的杨氏模量与力之间的关系，赫兹模型同时反映探针形貌的压陷。用实验的方法，通过在样品的某一点上得到的力曲线确定力和压陷，在探针逼近样品时测量悬臂梁的反应，得到力曲线。（2）锥形探针半锥角为，外加力F产生的压陷由下式得到：（3）E*是相对杨氏模量：（4）当EsampleEtip时，1/E*可以化简为（5）Esample是被研究材料的杨氏模量，sample是样品的泊松比。 抛物形探针在顶点处曲率半径为R的抛物形探针，对样品的压陷z与力F之间满足：（6）对于半径为R的球形探针，当接触半径rR时，也满足上述方程。 上述是平坦的刚性基底上弹性物体产生的变形。下列原因对测量杨氏模量影响相当大：塑性变形，表

25、面能，粗糙表面的局部形状。 2*)()(2)(tgEFsamplesampletiptipEEE22*111samplesampleEE2*115 . 1*)(34)(REF 如上所述，赫兹模型可以描述软样品的弹性反应。前述方程给出了锥形探针在平坦的软表面上施加负载F与产生的弹性压陷之间的关系。弹性压陷会增加探针与样品表面之间的接触面积，即使在最好的条件下，也会影响分辨率。下图是使用赫兹模型时样品的杨氏模量为E时，在负载力F的作用下，探针随软样品之间的接触面积的变化情况。方程（7），（8）是杨氏模量E、负载力F、泊松比和接触面积的直径、锥形张角、压入平坦表面的接触半径R之间的关系： （7）（8）FEtgd2