饲料中脂溶维生素检测技术及研究进展

1、中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 饲料中脂溶维生素检测技术及研究进展饲料中脂溶维生素检测技术及研究进展国家饲料质量监督检验中心国家饲料质量监督检验中心 （北京）（北京） 赵小阳赵小阳中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 报告内容报告内容 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展） 维生素质控案例分析及解决方案维生素质控案例分析及解决方案 维生素检测风险规避维生素检测风险规避中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展） 饲料和饲料添加剂管理条例饲料和饲料添加剂管理条例201220

2、12年年5 5月月1 1日起实行。日起实行。 目前饲料和饲料添加剂生产企业及用户最为关注的。目前饲料和饲料添加剂生产企业及用户最为关注的。 第三章第十四条第三项中规定：饲料和饲料添加剂生产企业必须第三章第十四条第三项中规定：饲料和饲料添加剂生产企业必须具备有必要的产品质量检验机构、人员、设施和质量管理制度。具备有必要的产品质量检验机构、人员、设施和质量管理制度。 相关配套法规：相关配套法规： 饲料添加剂（混合剂）生产企业许可条件饲料添加剂（混合剂）生产企业许可条件 饲料生产企业许可条件饲料生产企业许可条件 中规定：中规定： 固、液态维生素预混合饲料生产企业配备高效液相色谱仪（配备固、液态维生素

3、预混合饲料生产企业配备高效液相色谱仪（配备紫外检测器），要求能够检测维生素。紫外检测器），要求能够检测维生素。中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展）一一. .已颁布实施的已颁布实施的1313项饲料和饲料添加剂维生素项饲料和饲料添加剂维生素A A、D D3 3、E E、K K3 3的国家标准：的国家标准：GB/T7292-1999GB/T7292-1999 饲料添加剂饲料添加剂 维生素维生素A A乙酸酯微粒乙酸酯微粒GB/TGB/T23386-200923386-2009 饲料添加剂饲料添加剂 维生素维生素A A棕榈酸

4、酯棕榈酸酯GB/T9840-2006 GB/T9840-2006 饲料添加剂饲料添加剂 维生素维生素D3D3微粒微粒NY/T1246-2006 NY/T1246-2006 饲料添加剂饲料添加剂 维生素维生素D3D3（胆钙化醇）油（胆钙化醇）油GB/T7293-2006 GB/T7293-2006 饲料添加剂饲料添加剂 维生素维生素E E粉粉GB/T9454-2008 GB/T9454-2008 饲料添加剂饲料添加剂 维生素维生素E EGB/T9455-2009 GB/T9455-2009 饲料添加剂饲料添加剂 维生素维生素AD3AD3微粒微粒GB/T7294-2009 GB/T7294-200

5、9 饲料添加剂饲料添加剂 亚硫酸氢钠甲钠醌（维生素亚硫酸氢钠甲钠醌（维生素K3K3）GB/TGB/T26442-2010 26442-2010 饲料添加剂饲料添加剂 亚硫酸氢烟酰胺甲钠醌亚硫酸氢烟酰胺甲钠醌GB/T17817-2010 GB/T17817-2010 饲料中维生素饲料中维生素A A的测定的测定 高效液相色谱法高效液相色谱法GB/T17818-2010 GB/T17818-2010 饲料中维生素饲料中维生素D3D3的测定的测定 高效液相色谱法高效液相色谱法GB/T17812-2008 GB/T17812-2008 饲料中维生素饲料中维生素E E的测定的测定 高效液相色谱法高效液相色

6、谱法GB/T18872-2002 GB/T18872-2002 饲料中维生素饲料中维生素K K3 3的测定的测定 高效液相色谱法高效液相色谱法中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展） 项目项目 标准号标准号12241224号公告号公告产品规格产品规格 样品制备样品制备 检测方法检测方法技术指标技术指标维生素维生素A A乙酸乙酸酯微粒酯微粒GB/T7292-1999GB/T7292-1999粉剂粉剂5050万万IU/gIU/g油剂油剂250250万万IU/gIU/g5050万万IU/gIU/g0.1%0.1%氨水酶解，乙

7、醇提取氨水酶解，乙醇提取液相色谱液相色谱含量为标示量含量为标示量的的90-120%90-120%维生素维生素E E粉粉GB/T7293-2006GB/T7293-2006 50.0%50.0% 50.0%50.0%1.1mol/L1.1mol/L盐酸超声提取，加乙盐酸超声提取，加乙醇、内标醇、内标2.2.甲醇超声提取甲醇超声提取30min30min1.1.气相色谱气相色谱( (仲裁法仲裁法) )2.2.液相色谱液相色谱 50.0%50.0%维生素维生素K K3 3GB/T7294-2006GB/T7294-2006 96.0%96.0% 98.0%98.0% 50.0%50.0% 51.0%

8、51.0%水溶解水溶解, ,三氯甲烷和碳酸钠溶液三氯甲烷和碳酸钠溶液萃取萃取1.1.紫外分光光度法紫外分光光度法2.2.液相色谱液相色谱( (仲裁法仲裁法) ) 50.0%50.0% 51.0% 51.0%维生素维生素E EGB/T9454-2008GB/T9454-2008 油剂油剂92.0%92.0%92.0%92.0%1.1.内标溶液内标溶液( (正三十二烷正三十二烷) )溶解溶解2.2.甲醇超声溶解甲醇超声溶解10min.10min.1.1.气相色谱气相色谱( (仲裁法仲裁法) )2.2.液相色谱液相色谱92.0%92.0%维生素维生素D D3 3微粒微粒GB/T9840-2006GB

9、/T9840-2006 5050万万IU/gIU/g5050万万IU/gIU/g1.1.皂化乙醚萃取皂化乙醚萃取2.2.正己烷萃取正己烷萃取1.1.正、反相色谱正、反相色谱2.2.正相色谱正相色谱含量为标示量含量为标示量的的90-120%90-120%维生素维生素D D3 3油油NY/T1246-2006NY/T1246-2006 100100万万IU/gIU/gVD3VD3油剂油剂正己烷萃取正己烷萃取正相色谱正相色谱含量为标示量含量为标示量的的90-110%90-110%中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展）二二.

10、 .在研标准：在研标准： GB/T7292-1999 GB/T7292-1999 饲料添加剂饲料添加剂 维生素维生素A A乙酸酯微粒乙酸酯微粒 标准名称改为标准名称改为饲料添加剂饲料添加剂 维生素维生素A A乙酸酯（微粒乙酸酯（微粒/ /油）油）； 增加适用范围：包括：增加适用范围：包括：5050万万IU/gIU/g、6565万万IU/gIU/g、100100万万IU/gIU/g，或根据合同要，或根据合同要求确定。求确定。 鉴别实验补充高效液相色谱法鉴别。鉴别实验补充高效液相色谱法鉴别。 根据不同企业合成工艺，对提取方法进行改进，由超声提取根据不同企业合成工艺，对提取方法进行改进，由超声提取1

11、0min10min改为改为30min30min； 规定重复性：同一分析者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对规定重复性：同一分析者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差不大于偏差不大于5%5%。 补充卫生指标及检验方法。补充卫生指标及检验方法。 补充了维生素补充了维生素A A油剂的检验标准。油剂的检验标准。 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展） 维生素维生素A A乙酸酯标准溶液色谱图乙酸酯标准溶液色谱图AU0.000.100.200.300.400.500.600.70Minutes2.004.006.0

12、08.0010.0012.0014.0016.0018.0020.00trans Vit A acetate - 13.920中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展） 维生素维生素A A乙酸酯样品溶液色谱图乙酸酯样品溶液色谱图AU0.000.100.200.300.400.500.600.700.80Minutes2.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.00cis Vit A acetate - 12.866trans Vit A acetate - 13.78715.4

13、76中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展）二二. .在研标准：在研标准： GB/T9840-2006 GB/T9840-2006 饲料添加剂饲料添加剂 维生素维生素D D3 3微粒微粒 参与的修订工作：建议补充反相色谱检验方法。参与的修订工作：建议补充反相色谱检验方法。 NY/T1246-2006 NY/T1246-2006 饲料添加剂饲料添加剂 维生素维生素D D3 3（胆钙化醇）油（胆钙化醇）油（制定强制性国家标准）（制定强制性国家标准） 进一步完善标准的适用范围，增加了反相色谱检验方进一步完善标准的适用范围，增

14、加了反相色谱检验方法，增加了强制执行的卫生指标法，增加了强制执行的卫生指标, ,技术关键点：预技术关键点：预D D3 3与与D D3 3的的转换系数的测定。转换系数的测定。中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展） 维生素维生素D D3 3标准溶液反相色谱图标准溶液反相色谱图min02468101214Norm.-505101520 DAD1 A, Sig=254,4 Ref=360,100 (20130828VD300004.D) 11.980 Area: 644.762 13.329中国农业科学院农业质量标准与检测技

15、术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展） 维生素维生素D D3 3标准溶液标准溶液9090加热加热30min30min后后反相色谱图反相色谱图min02468101214Norm.-50510152025 DAD1 A, Sig=254,4 Ref=360,100 (20130828VD300003.D) 12.146 13.533中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展） 维生素维生素D D3 3油剂样品反相色谱图油剂样品反相色谱图min0246810121416Norm.02

16、0406080100120140 DAD1 A, Sig=254,4 Ref=360,100 (20130828.1VD300005.D) 11.889 13.221 14.386 15.248中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展）二二. .在研标准：在研标准： GB/T18872-2002 GB/T18872-2002 饲料中维生素饲料中维生素K K3 3的测定的测定 高效液相色谱法高效液相色谱法 1224 1224号公告在配合饲料或全混合日粮中的推荐添加量：号公告在配合饲料或全混合日粮中的推荐添加量： 猪：猪：0

17、.5mg/kg0.5mg/kg；鸡：；鸡：0.40.40.60.6mg/kgmg/kg；鸭：；鸭：0.5mg/kg0.5mg/kg；水产动物：；水产动物：2 21616mg/kgmg/kg。 最高限量：最高限量： 猪：猪：10mg/kg10mg/kg；鸡：；鸡：5mg/kg5mg/kg。 定量限改为定量限改为0.4mg/kg0.4mg/kg，补充，补充MNBMNB、MPBMPB的检验方法，氨水水解改为碳酸钠水解。的检验方法，氨水水解改为碳酸钠水解。 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展）三三. .饲料中维生素饲料中维

18、生素A A、D3D3、E E的检验方法标准：的检验方法标准：ISOISO方法：方法： ISO 6867-2000 ISO 6867-2000 动物饲料动物饲料 维生素维生素E E含量的测定含量的测定 高效液相色谱法高效液相色谱法 ISO 14565-2002 ISO 14565-2002 动物饲料动物饲料 维生素维生素A A含量的测定含量的测定 高效液相色谱法高效液相色谱法AOAC (AOAC (美国官方分析化学家协会美国官方分析化学家协会) )方法：方法： AOAC Official Method 2001.13 AOAC Official Method 2001.13 Determinat

19、ion of VitaminDetermination of Vitamin A(Retinol) in A(Retinol) in Foods Liquid Chromatography (First Action 2001)Foods Liquid Chromatography (First Action 2001) AOAC Official Method 999.15 AOAC Official Method 999.15 Vitamin K in Milk and Infant Formulas Liquid Vitamin K in Milk and Infant Formulas

20、 Liquid Chromatographic Method (First Action 1999)Chromatographic Method (First Action 1999) AOAC Official Method 995.05 AOAC Official Method 995.05 Vitamin D Infant Formulas and Enteral Vitamin D Infant Formulas and Enteral Products Liquid Chromatographic Method (First Action 1995)Products Liquid C

21、hromatographic Method (First Action 1995)中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展）F国家标准与国际方法比较：国家标准与国际方法比较：FISOISO、AOACAOAC方法：样品预处理也是皂化法，石油醚萃取，方法：样品预处理也是皂化法，石油醚萃取，HPLCHPLC测定。测定。F国家标准：对于维生素预混料的检测补充了快速提取法，国家标准：对于维生素预混料的检测补充了快速提取法，可针对不同样品用不同提取方法，提高了工作效率，方法可针对不同样品用不同提取方法，提高了工作效率，方法更加科学完

22、善。更加科学完善。中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展）国标仲裁法国标仲裁法原理原理维生素维生素A A 以碱水解，将酯转化为醇，乙醚提取维生素以碱水解，将酯转化为醇，乙醚提取维生素A A，去除水，去除水溶性物质溶性物质, ,经色谱柱分离经色谱柱分离,HPLC,HPLC带紫外可调波长检测器带紫外可调波长检测器( (或二或二极管矩阵检测器极管矩阵检测器) )检测含量。检测含量。维生素维生素D D3 3 以碱溶液皂化试样，去除脂肪，乙醚提取维生素以碱溶液皂化试样，去除脂肪，乙醚提取维生素D D3 3， HPLCHPLC测定

23、，外标法计算含量。测定，外标法计算含量。维生素维生素E E 以碱溶液皂化试样，使试样中生育酚释放出来，添加以碱溶液皂化试样，使试样中生育酚释放出来，添加的生育酚乙酸酯转化为游离的生育酚，乙醚提取，的生育酚乙酸酯转化为游离的生育酚，乙醚提取，HPLCHPLC测测定，外标法计算含量。定，外标法计算含量。中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展）F第一法：皂化提取法（仲裁法）第一法：皂化提取法（仲裁法）: : 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展）F

24、第二法：直接提取法第二法：直接提取法: : 适用范围：适用范围：适用维生素预混料，第二法样品预处理简单、快速、适用维生素预混料，第二法样品预处理简单、快速、准确，提高了实验室工作效率。准确，提高了实验室工作效率。 原理：原理：用甲醇提取维生素预混料中的维生素用甲醇提取维生素预混料中的维生素A A、D D3 3、E E，经色谱柱，经色谱柱分离，紫外检测器（或二极管矩阵检测器）测定，外标法计算含量。分离，紫外检测器（或二极管矩阵检测器）测定，外标法计算含量。 关键点：关键点：VA在甲醇中不稳定，样品处理之后，马上上在甲醇中不稳定，样品处理之后，马上上HPLC检测。检测。中国农业科学院农业质量标准与

25、检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展） 维生素预混料中维生素维生素预混料中维生素A A的色谱图：的色谱图：min02.557.51012.51517.5mAU0100200300400500 DAD1 B, Sig=326,16 Ref=360,100 (080812ADE00007.D) Area: 3514 4.027中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展） 维生素预混料中维生素维生素预混料中维生素D D3 3的色谱图：的色谱图：min024681012141618

26、mAU-2000200400600800 DAD1 A, Sig=264,4 Ref=360,100 (081029ADE00016.D) Area: 342.254 7.701中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素检测依据（现行标准及在研进展）维生素检测依据（现行标准及在研进展） 维生素预混料中维生素维生素预混料中维生素E E的色谱图：的色谱图：min024681012141618Norm.0200400600 DAD1 A, Sig=285,4 Ref=360,100 (080812ADE00007.D) 13.102中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素质控案例分

27、析及解决方案维生素质控案例分析及解决方案一一. .标准的适用范围：标准的适用范围： 例如：例如：本标准方法适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混料和维生本标准方法适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混料和维生素预混料。素预混料。 案例一：案例一：送检的样品：液体多维（送检的样品：液体多维（VAVA）、稚蟹粉（）、稚蟹粉（VD3VD3）、竹叶提）、竹叶提取物饲料添加剂预混料（取物饲料添加剂预混料（A A、D3D3、E E、K3K3）、棕榈颗粒（）、棕榈颗粒（A A、D3D3、E E、K3K3）酵母粉（酵母粉（VAVA）等，如果不在标准适用范围内，可以检测，但不接受检测）等，如果不在标准适用范围内，可以检

28、测，但不接受检测结果的复议。结果的复议。 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素质控案例分析及解决方案维生素质控案例分析及解决方案 二二. .适用范围符合适用范围符合, ,但是没有达到定量限但是没有达到定量限 案例二案例二: :生产企业自检：生产企业自检：鱼用多维中维生素鱼用多维中维生素D D3 3含量含量100100万万IU/kgIU/kg（定量限（定量限500500万万IU/kgIU/kg），用直接提取法检测含量不够，使用客户投诉生产企业。，用直接提取法检测含量不够，使用客户投诉生产企业。 原因：原因：使用检测方法不对，虽然是维生素预混料，但是含量没有达到方法使用检测方法不对，

29、虽然是维生素预混料，但是含量没有达到方法规定的定量限，色谱峰基线没有回到原点，基线倾斜，积分误差大，结果偏规定的定量限，色谱峰基线没有回到原点，基线倾斜，积分误差大，结果偏低，必须用皂化方法处理样品，才能得到准确结果。由于皂化法很烦琐，处低，必须用皂化方法处理样品，才能得到准确结果。由于皂化法很烦琐，处理两三个样品需要一整天的时间，多数维生素生产企业不愿意使用皂化方法。理两三个样品需要一整天的时间，多数维生素生产企业不愿意使用皂化方法。 案例三案例三: :复合预混料中叶酸添加复合预混料中叶酸添加200mg/kg200mg/kg，未检出，标准方法中规定的定，未检出，标准方法中规定的定量限量限50

30、0mg/kg500mg/kg，生产企业可以跟使用企业协商用企标检验。，生产企业可以跟使用企业协商用企标检验。 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 新标准对企业的影响新标准对企业的影响- -维生素质控案例分析及解决方案维生素质控案例分析及解决方案定量限定量限第一法第一法第二法第二法维生素A1000IU/kg106IU/kg维生素D3500IU/kg5106IU/kg维生素E1mg/kg20mg/kg维生素K3(测量范围) 2.0mg/kg中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 维生素质控案例分析及解决方案维生素质控案例分析及解决方案 三三. .标准中的仲裁检验方法：标准中的仲裁检验方

31、法： 如果使用标准中的非仲裁方法（快速、简便）检测结果不符，一般要再用如果使用标准中的非仲裁方法（快速、简便）检测结果不符，一般要再用仲裁法检测。仲裁法检测。 案例四：案例四：送检维生素预混和饲料中的维生素送检维生素预混和饲料中的维生素D3,D3,检测结果只有添加量的检测结果只有添加量的60%60%，为了查找原因又送来同一批六个维生素为了查找原因又送来同一批六个维生素D3D3原料检测，用非皂化方法检测含量原料检测，用非皂化方法检测含量只有只有38-4038-40万万IU/g,IU/g,用仲裁法检测，检测结果为用仲裁法检测，检测结果为5454万万IU/gIU/g。原因：维生素。原因：维生素D3D3的的剂型不同，水弥散型的剂型样品预处理必须皂化，直接用有机溶剂提取不完剂型不同，水弥散型的剂型样品预处理必须皂化，直接用有机溶剂提取不完全，后来得知客户所用的该产品的生产企业确实生产水溶维生素全，后来得知客户所用的该产品的生产企业确实生产水溶维生素D3D3。 由于客户没有提供详细的样品信息，同时生产企业与使用企业之间对标准由于客户没有提供