第六章免疫标记技术

1、免疫标记技术经典免疫学技术 沉淀反应 凝集反应 补体参与的抗原抗体反应 中和反应沉淀反应凝集反应补体参与的抗原抗体反应中和反应经典免疫学技术的不足 灵敏度 周期长 可重复性 无法定量 无法定位 特异性差关键问题免疫标记技术（immunolabelling technique） 用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。免疫标记技术分类：免疫酶技术(ng)、放射免疫技术(pg)、免疫荧光技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术、发光免疫测定。特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位第八章 免疫标记技术第一节 放射免疫技术第二节 免疫荧光技术第三

2、节 酶免疫技术第四节 其他免疫标记技术第八章 免疫标记技术第一节 放射免疫技术第二节 免疫荧光技术第三节 酶免疫技术第四节 其他免疫标记技术一、放射免疫技术 二、免疫放射技术 第一节放射免疫技术 一、放射免疫技术 二、免疫放射技术 第一节放射免疫技术 （一）放射免疫技术的原理 （二）放射免疫技术的基本条件 （三）放射免疫技术的基本类型一、放射免疫技术（一）放射免疫技术的原理 （二）放射免疫技术的基本条件 （三）放射免疫技术的基本类型一、放射免疫技术放射免疫技术（radioimmunoassay，RIA）（1977年获诺贝尔生理和医学奖）放射免疫技术的原理 RIA是以放射性同位素标记抗原的一种竞

3、争性免疫抑制试验（一）放射免疫技术的原理 （二）放射免疫技术的基本条件 （三）放射免疫技术的基本类型一、放射免疫技术（二）放射免疫技术的基本条件 1抗原标准品与待测抗原 2放射性同位素 3特异性抗体 4常用的同位素标记方法5B与F的分离技术1抗原标准品与待测抗原 标准品是放免技术的定量依据 标准品：与待测样品的化学结构完全相同 替代品：与待测样品的结构相似，但要与抗体的亲和力相近，应列出与真标准品的换算系数。2. 放射性同位素3. 特异性抗体 放射免疫技术的抗体应具备：特异性高、亲和力高（平衡常数K值大）、效价高（即抗血清高度稀释时仍能迅速与抗原结合，极少解离，保证检测的灵敏度） 4. 常用的

4、同位素标记方法 氯胺T氧化标记法 乳过氧化物酶标记法 半抗原标记法5. B与F的分离技术（1）双抗体沉淀分离法（2）化学试剂分段沉淀分离法（3）固相法（4）吸附法 结合态标记抗原B与游离态标记抗原F能否有效地分离是放射免疫技术的一个重要环节。分离剂的要求 能使B和F完全分离 不受外界因素的干扰 与游离抗原的非特异性作用尽可能小 操作简便、分离迅速、重复性好 来源广，经济，便于使用（1）双抗体沉淀分离法 优点： 本法操作简便、稳定缺点： 易受免疫反应液中其他蛋白质或盐的干扰，使非特异性吸附有较大变异，且第二抗体消耗量大。 加入第二抗体使微量抗原抗体复合物的分子加大，从而使原来不能用普通离心法沉淀

5、的抗原抗体复合物易于沉淀而分离。 （2）化学试剂分段沉淀分离法利用盐类或有机化合物使反应液中的-球蛋白在等电点沉淀，从而达到分离的目的。如：聚乙二醇（PEG）、硫酸铵等优点： 试剂来源广泛、 价格便宜缺点： 影响因素多（温度、pH值、浓度等）（3）固相法 将测定用的第一抗体（或第二抗体）牢固地结合于固相载体表面，相应抗原（或第一抗体）经温育被吸附，只要将固相表面洗涤即将B和F分离。 优点：操作简便、快速 新的固相分离方法： 纤维固相抗体竞争法 可磁化颗粒固相抗体竞争法 试管固相法（4）吸附法 本法多用于小分子半抗原的放射免疫分析。 如：活性炭、硅镁吸附剂、滑石粉等性质：对蛋白质、多肽、药物等具

6、有非特异性 吸附的能力应用：在其表面包被一层白蛋白或右旋糖苷等 物质时，将会限制大分子物质的吸附。 沉 淀 中：吸附有游离的抗原或半抗原 上清液中：抗原抗体复合物优点：操作简便、分离迅速缺点：专一性不强 （一）放射免疫技术的原理 （二）放射免疫技术的基本条件 （三）放射免疫技术的基本类型一、放射免疫技术（三）放射免疫技术的基本类型1液相法（1）平衡法（又称一步法）（2）顺序加样法2固相法（1）竞争法 Ag+Ag*+Ab-（2）改良法 Ag+Ag*+Ab+AntiAb-一、放射免疫技术 二、免疫放射技术 第一节放射免疫技术 （一）免疫放射技术的原理 （二）免疫放射技术的基本条件 （三）免疫放射技

7、术的基本类型二、免疫放射技术（一）免疫放射技术的原理 （二）免疫放射技术的基本条件 （三）免疫放射技术的基本类型二、免疫放射技术 1986年Miles和Hales建立免疫放射分析技术（immunoradiometric assay，IRMA） 标记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，待测物（或标准品）和同位素标记抗体全量反应。优点： 灵敏度高（可提高6-10倍）、准确度高、重复性好、检样量少缺点： 干扰因素较多、检测仪器贵、有放射性污染免疫放射技术（immunoradiometric assay，IRMA）（一）免疫放射技术的原理 （二）免疫放射技术的基本条件 （三）免疫放射技术的基本类

8、型二、免疫放射技术（二）免疫放射技术的基本条件 1标记抗体的制备 2固相抗原免疫吸附剂（一）免疫放射技术的原理 （二）免疫放射技术的基本条件 （三）免疫放射技术的基本类型二、免疫放射技术（三）放射免疫技术的基本类型1. 经典IRMA法2. 双抗体夹心法3. 二抗标记法4. 双标记抗体法1. 经典IRMA法2. 双抗体夹心法标记3. 二抗标记法4. 双标记抗体法 双标记抗体是将两种针对不同表位的抗体（Ab2、Ab3）标记上不同的同位素，可以用不同的检测仪进行测定。放射分析技术方法学考核指标第八章 免疫标记技术第一节 放射免疫技术第二节 免疫荧光技术第三节 酶免疫技术第四节 其他免疫标记技术一、免

9、疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术第二节免疫荧光技术 一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术第二节免疫荧光技术 Albert Hewett Coons（19121978） 20世纪40年代Coons等首先用荧光素FITC标记抗体，成功地检测了小鼠肺脏组织内存在的肺炎双球菌多糖抗原，从而创建免疫荧光技术（ immuno-fluorescence technique ）。 一、免疫荧光技术的原理 三结合： 抗原抗体反应的高度特异性 荧光的敏感可测性 显微技术的高度精确性 优点： 特异性强、敏感性高

10、、速度快，结果直观，可以检测和定位微量抗原 缺点： 荧光易发生淬灭，荧光染色标本保存困难、易出现非特异性染色问题，镜检结果判定客观性不足一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术第二节免疫荧光技术 1. 荧光素 2. 荧光标记物的制备 3. 荧光检测仪二、免疫荧光技术的基本条件1. 荧光素 2. 荧光标记物的制备 3. 荧光检测仪二、免疫荧光技术的基本条件1荧光素 荧光素：可以产生明亮荧光的染色物质荧光素的性质 吸收光后电子跃迁 保持固有的荧光特性 荧 光 的 波 长 总 是 大 于 激 发 光 波 长（STOKES 法则） 荧光强度小于激发光的

11、强度荧光效率=发射光量子数/吸收光量子数100%荧光强度=吸收光量子数荧光效率荧光的种类自发荧光二次荧光非特异性荧光： 自发荧光 诱发荧光 酶诱发荧光荧光素选择条件 荧光强度高且稳定 能轻易与蛋白质分子形成稳定共价键 荧光素与蛋白质结合的方法应简便、快速 产生的荧光颜色应与自发荧光对比鲜明 结合物在一般贮存条件下性能稳定，可保存较长时间荧光素1. 荧光素 2. 荧光标记物的制备 3. 荧光检测仪二、免疫荧光技术的基本条件荧光标记抗体的制备（1）搅拌标记法（Marshall法）（2）半透膜透析标记法（Clark法）荧光标记抗体的纯化（1）去除游离荧光素（2）去除未标记和过度标记的抗体荧光标记抗体

12、的鉴定（1）抗体与荧光的活性鉴定（2）荧光素与蛋白质的摩尔比值（F/P） 采用紫外分光比色法测定FITC（F）OD值和 蛋白质（P）OD值以后，用以下公式计算F/P比值： F/P比值=（2.87OD495）/（OD2800.35OD495）（3）荧光抗体浓度的测定（4）荧光抗体特异性的鉴定：特异性吸收试验， 竞争抑制试验1. 荧光素 2. 荧光标记物的制备 3. 荧光检测仪二、免疫荧光技术的基本条件3. 荧光检测仪（1） 荧光显微镜 （2） 荧光分光光度计（1）荧光显微镜透射式落射式透射荧光显微镜原理低倍镜较明亮，高倍镜较暗，在油浸和调中时，较难操作，尤以低倍的照明范围难于确定，但能得到很暗的

13、视野背景。透射式不适用于非透明的被检物体。落射式荧光显微镜激发滤光板 位于聚光镜和光源之间，可滤过由荧光灯源发射出的其他光，只允许波长为275480nm的紫外光（MG）和蓝紫光（BG）通过，以激发荧光结合物发射荧光。汞灯光源:提供激发光(U、V、B、G) 激发滤色镜: 波长选择分色镜:反射激发光,透过荧光 吸收滤色镜:透过荧光,阻挡杂光落射荧光显微镜原理对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用，不仅便于操作，而且从低倍到高倍，可以实现整个视场的均匀照明。（2）荧光分光光度计 用于扫描荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光

14、寿命、荧光偏振等许多物理参数，从各个角度反映了分子的成键和结构情况。一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术第二节免疫荧光技术 1. 直接荧光抗体染色法 2. 间接荧光抗体染色法 3. 补体荧光染色法4. 特殊染色法三、经典荧光抗体染色法1. 直接荧光抗体染色法 2. 间接荧光抗体染色法 3. 补体荧光染色法4. 特殊染色法三、经典荧光抗体染色法1. 直接荧光抗体染色法优点： 简单、快速、特异性高缺点： 检测每种抗原需制备相应抗体、敏感性差将荧光素标记在特异性抗体上，直接检测抗原1. 直接荧光抗体染色法 2. 间接荧光抗体染色法 3. 补体荧光

15、染色法4. 特殊染色法三、经典荧光抗体染色法2. 间接荧光抗体染色法优点： 敏感性高、一种二抗可检测多种抗原抗体系统缺点： 干扰因素多、操作流程长将荧光素标记在第二抗体（抗抗体）上或标记在SPA上，检测与抗原结合的特异性抗体肿瘤组织中M2型巨噬细胞1. 直接荧光抗体染色法 2. 间接荧光抗体染色法 3. 补体荧光染色法4. 特殊染色法三、经典荧光抗体染色法3. 补体荧光染色法优点： 可检测所有抗原抗体系统，具有通用性；敏感性高缺点： 操作过程较复杂，干扰因素多，易出现非特异性染色，补体易失活将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3抗体），检测抗原抗体复合物。1. 直接荧光抗体染色法 2. 间接荧光抗

16、体染色法 3. 补体荧光染色法4. 特殊染色法三、经典荧光抗体染色法4特殊染色法 （1 1）双标记免疫荧光技术（2 2）双色免疫荧光技术（3 3）反衬染色法 （1）双标记免疫荧光技术在同一标本中，可用两种不同颜色的荧光标记抗体进行染色，同时显示两种不同的细胞或同一细胞上不同的抗原。如：FITC（黄绿色荧光）标记Ab1 RB200或TRITC9（桔红色荧光）标记Ab2细胞内双标记荧光染色（2）双色免疫荧光技术 如FITC标记抗体和细胞核染色剂PI（红色）DAPI（蓝色） （3）反衬染色法 是用一种非特异染色来反衬一种免疫荧光试剂的特异性染色。如：用RB200标记BSA作为非特异性反衬标记，用FI

17、TC标记特异性抗体。一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术第二节免疫荧光技术 1. 流式细胞术 2. 荧光偏振免疫分析技术 3. 时间分辨荧光免疫测定四、现代免疫荧光技术1. 流式细胞术 2. 荧光偏振免疫分析技术 3. 时间分辨荧光免疫测定四、现代免疫荧光技术1. 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）又称荧光激活细胞分类器 （fluorescing activating cell sorter，FACS）流式细胞仪原理物理参数分析FSCSSC细胞分类单参数数据分析细胞凋亡的检测细胞表面标志鉴定三参数数据分析1. 流式细胞术 2

18、. 荧光偏振免疫分析技术 3. 时间分辨荧光免疫测定四、现代免疫荧光技术2. 荧光偏振免疫分析技术（fluorescence polarization immunoassay，FPIA） 利用荧光素经单一波长的偏振光照射后，吸收光能并发射出相应的偏振荧光，其强弱程度与荧光分子的颗粒大小呈正相关。 反应系统中同时加入待测药物、一定量的荧光素标记的相应药物（小分子）和抗药物抗体，使待测药物和荧光素标记药物与有限量的特异性抗体（大分子）进行竞争结合。荧光偏振光分析仪Transcreener UDP2 FP AssayFPIA技术特点优点：标本可直接用于测定样品用量少测定时间短精密度高缺点：仪器价格昂

19、贵药品试剂盒专用性强不易普及应用1. 流式细胞术 2. 荧光偏振免疫分析技术 3. 时间分辨荧光免疫测定四、现代免疫荧光技术3. 时间分辨荧光免疫测定（TrFIA） 是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点（强度高、衰变时间长），用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。实验原理类线光谱： 有利于降低本底荧光强度，提高分辨率较大的Stokes位移： 有利于排除非特异荧光的干扰，增强测量的特异性螯合物： 荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧光物质对检测结果的影响 分析速

20、度快、标记物制备较简便、标记物有效使用期长、无放射性污染、应用范围广等优点第八章 免疫标记技术第一节 放射免疫技术第二节 免疫荧光技术第三节 酶免疫技术第四节 其他免疫标记技术一、酶免疫技术的原理二、酶免疫技术的基本条件三、酶免疫技术的基本类型四、ELISA方法的发展第三节酶免疫技术 一、酶免疫技术的原理二、酶免疫技术的基本条件三、酶免疫技术的基本类型四、ELISA方法的发展第三节酶免疫技术 酶催化反应原理酶催化反应的两种基本形式： E+S（ES） E+P E+S（ES） + D1 E + P + D2E：酶 S：酶作用的底物P：底物分解后的产物（有色化合物）D1：供氢体 D2：为D1的氧化型

21、（有色化合物）酶免疫技术（enzyme immunoassay，EIA）优点：灵敏度高，特异性强，操作简便，易掌握和推广；试剂易制备，且稳定保存期长；结果可肉眼观察，也可用仪器定量检测，且仪器价格较低廉。缺点：检测可溶性样品，灵敏度和重复性不及放免疫测定法；免疫组化中，易受细胞内源性酶的干扰，直观性比荧光免疫染色法差。一、酶免疫技术的原理二、酶免疫技术的基本条件三、酶免疫技术的基本类型四、ELISA方法的发展第三节酶免疫技术 二、酶免疫技术的基本条件1标记酶2酶标记物的制备3酶底物的选择4 . 固相载体的选择5 . 酶标检测仪二、酶免疫技术的基本条件1标记酶2酶标记物的制备3酶底物的选择4 .

22、 固相载体的选择5 . 酶标检测仪1. 标记酶 辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRP）碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AP）葡萄糖氧化酶 （glucooxidase，Glu）-D-半乳糖苷酶 （-D-galactosidase，-D-Gal）二、酶免疫技术的基本条件1标记酶2酶标记物的制备3酶底物的选择4 . 固相载体的选择5 . 酶标检测仪酶标记物的制备 免疫酶结合物： 酶标记抗原的制备酶标记抗体的制备戊二醛交联法即将标记酶通过具有双功能或多功能化学基团的交联剂连接到抗原或抗体分子上。过碘酸氧化交联法 将酶分子氧化产生活性基团，再与抗

23、原或抗体分子结合，使之成为与相应靶分子具有特异性结合活性的酶标抗原或抗体。 二、酶免疫技术的基本条件1标记酶2酶标记物的制备3酶底物的选择4 . 固相载体的选择5 . 酶标检测仪3. 酶底物的选择二、酶免疫技术的基本条件1标记酶2酶标记物的制备3酶底物的选择4 . 固相载体的选择5 . 酶标检测仪4. 固相载体的选择 ELISA法最常用的固相载体： 要求：蛋白质吸附性能强、吸附后不影响抗原抗体的活性、价格低廉、形状可塑 聚苯乙烯吸附性能好、透明度好 聚氯乙烯质软板薄，容易剪割，价廉，吸附性能高于聚苯乙烯，但光洁度稍差、空白值也略高 硝酸纤维素膜及微孔滤膜用于快速斑点免疫结合试验酶标板种类 高结

24、合力酶标板（表面处理）400-500ng IgG/cm2 MW10kD 中结合力酶标板（疏水键结合）200-300ng IgG/cm2 MW20kD 氨基化酶标板（表面正电荷氨基）100ng/cm2 小分子蛋白蛋白的包被（coating） pH9.6的碳酸盐缓冲液 4度 过夜 1%-5% BSA blocking 低温保存二、酶免疫技术的基本条件1标记酶2酶标记物的制备3酶底物的选择4 . 固相载体的选择5 . 酶标检测仪一、酶免疫技术的原理二、酶免疫技术的基本条件三、酶免疫技术的基本类型四、ELISA方法的发展第三节酶免疫技术 三、免疫酶技术的类型酶联免疫吸附试验（enzyme linked

25、 immunosorbent，ELISA）酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）1. 直接法2. 间接法3. 夹心法4. 竞争法5. 抗酶抗体法ELISA的检测类型1. 直接法2. 间接法3. 夹心法Additional Materials RequiredTypical Standard Curve4. 竞争法5. 抗酶抗体法ELISA实验条件优化 蛋白的包被：载体、蛋白浓度、温度、时间 封阻：BSA、血清、脱脂奶粉 洗涤：生理盐水、PBS、Tris-HCl 酶结合物的浓度：标准为OD值1.0 标本的选择 结果判断一、酶免疫技术的原

26、理二、酶免疫技术的基本条件三、酶免疫技术的基本类型四、ELISA方法的发展第三节酶免疫技术 1. 酶联免疫荧光测定法 2. IgM型抗体捕捉酶联免疫吸附试验 3. 斑点ELISA4. 酶联免疫斑点法四、ELISAELISA方法的发展1. 酶联免疫荧光测定法（enzyme linked fluorescence immunoassay，ELFIA） 荧光底物使ELISA的检测极限提高了几十倍，达到渺克（ag=10-18g）水平2. IgM型抗体捕捉酶联免疫吸附试验3. 斑点ELISA（dot-ELISA） 采用硝酸纤维素膜（NC膜）作为固相载体，将抗原点加于膜上，干燥后以BSA-PBS封闭，然后

27、滴加待检血清和酶标抗体，反应后，滴加底物溶液，当膜上呈现肉眼可见的着色斑点即为阳性反应，本法常作为定性检测。4. 酶联免疫斑点法（enzyme linked immunospot，ELISPOT）第八章 免疫标记技术第一节 放射免疫技术第二节 免疫荧光技术第三节 酶免疫技术第四节 其他免疫标记技术一、生物素-亲和素放大系统二、免疫分析技术中的通用系统 SPA通用系统三、免疫金溶胶技术第四节其他免疫标记技术 一、生物素-亲和素放大系统二、免疫分析技术中的通用系统 SPA通用系统三、免疫金溶胶技术第四节其他免疫标记技术 生物素-亲合素系统（Biotin-avidin system，BAS） 198

28、0年，Hsu首先用生物素亲合素化酶进行组织化学研究 1983年，Yolken和Kendall首次用BAS与ELISA相结合检测特异性抗原和抗体，并获得成功 BSA与酶、同位素、荧光素等标记技术有机结合，可使各种示踪免疫分析的灵敏度进一步提高，可用于微量蛋白分子的定量检测。生物素（biotin，B）生物素分子式为C10H16O3N2S，分子量为244.31，pI为3.5。可从含量较高的卵黄（型）和肝组织（型）中提取，也可合成。亲合素（avidin，A） A是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白 pI 1010.5 MW68,000 由4个亚单位组成Ka = 1015mol/L1个A与4个B结合又称卵白

29、蛋白、抗生物素链霉亲和素（streptavidin，SA） 在结构上因不含有任何糖基，因此在测定中的非特异性远低于亲合素。 SA是由Streptomyces avidin菌分泌的一种略偏酸性蛋白质 MW 65,000 pI 6.0 SA不含任何糖基Ka = 1015mol/L1个A与4个B结合生物素-亲合素标记技术 生物素的活化 生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯（BNHS）羧基与蛋白质赖氨酸上的氨基以酰胺键偶联、常用于标记抗体及中性偏碱的抗原长臂活化生物素（BCNHS）更易与抗体、酶等生物大分子结合而发挥效应生物素酰肼（BHZ）主要用于标记偏酸性糖蛋白 生物素标记物 活化生物素可偶联抗体、酶、蛋白

30、质、多肽、激素、凝集素、糖类及DNA、RNA等生物素-亲合素系统的应用直接法间接法亲和素-生物素-过氧化物酶复合体法一、生物素-亲和素放大系统二、免疫分析技术中的通用系统 SPA通用系统三、免疫金溶胶技术第四节其他免疫标记技术 SPA的发现 1940年Verwey发现金黄色葡萄球菌的某些菌株，可与人正常血清在双相免疫扩散试验中出现沉淀线1958年Jensen用离子交换树脂分析证明，该成分是一种细菌胞壁上不含糖的蛋白质，命名为金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A，SPA)Forsgren等证明SPA与IgG分子的Fc段结合，为假免疫反应生产SPA的国际标准菌株:Cow