CH9 核酸生物合成-改

1、核酸的生物合成核酸的生物合成张张 志志 勇勇河南科技学院生命科技学院 生理生化教研室核酸的生物合成核酸的生物合成 一、中心法则一、中心法则 二、二、DNADNA的生物合成的生物合成 三、三、RNARNA的生物合成的生物合成 教学基本要求教学基本要求 1. 1.生物体内遗传信息是如何进行传递的生物体内遗传信息是如何进行传递的? ? 2. 2.DNADNA的生物合成主要分为哪几个阶段的生物合成主要分为哪几个阶段? ?需要哪些酶需要哪些酶的参与，这些酶具有哪些重要特点？的参与，这些酶具有哪些重要特点？ 3. 3.DNADNA的生物合成具有哪些重要特点？的生物合成具有哪些重要特点？ 4. 4.什么是逆

2、转录？基本过程如何？什么是逆转录？基本过程如何？ 5. 5.什么是转录作用？转录作用分为哪几个阶段？转什么是转录作用？转录作用分为哪几个阶段？转录作用与录作用与DNADNA生物合成相比具有哪些异同点？生物合成相比具有哪些异同点？ 6. 6.什么是什么是RNARNA的合成后加工？主要包括哪些变化？的合成后加工？主要包括哪些变化？ 7. 7.什么是半保留复制、半不连续复制、转录、什么是半保留复制、半不连续复制、转录、PCRPCR、限制修饰系统？限制修饰系统？ （DNA/RNA）复制复制转录转录/反转录反转录翻译翻译生物体一生控制者生物体一生控制者-DNA？遗传物质的分子机制遗传物质的分子机制分子生

3、物学的核心分子生物学的核心Watson & Crick: 一种遗传物质，必须能行使两种功能，即自我复制和对一种遗传物质，必须能行使两种功能，即自我复制和对细胞的高度特异性的影响。细胞的高度特异性的影响。遗传物质的基本属性遗传物质的基本属性基因的自我复制基因的自我复制基因的突变基因的突变 控制性状的表达控制性状的表达DNA复制复制 亲代双链亲代双链DNADNA分子在分子在DNADNA聚合酶的作用下，分别以聚合酶的作用下，分别以 每单链每单链 DNADNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补分子为模板，聚合与自身碱基可以互补 配对的游离的配对的游离的dNTPdNTP, , 合成出两条与亲代合

4、成出两条与亲代DNADNA分子完分子完 全相同的子代全相同的子代DNADNA分子的过程。分子的过程。 复制机理的复杂性复制机理的复杂性 D.S. DNAS.S. DNA 能量的供求能量的供求构型的变化构型的变化 超螺旋超螺旋线状，开环状线状，开环状多种酶类的互作多种酶类的互作ReplisomeDNA复制起始控制机理知之甚少复制起始控制机理知之甚少复制的准确性复制的准确性 （修复，校正）（修复，校正）DNA复制速度复制速度(E.coli 105 bp/min ，高速解旋高速解旋 112 km/h ?)缺乏统一的模式缺乏统一的模式 (D.S. DNA, S.S. DNA, Linear DNA.)

5、 RNA复制：复制：在宿主细胞中在宿主细胞中RNA病毒以自己的病毒以自己的RNA为模板复为模板复制出新的病毒制出新的病毒RNA。转录：转录：以以DNA双链中某一条单链的某一个片段为模板，按双链中某一条单链的某一个片段为模板，按照碱基互补配对原则，合成出一条与模板照碱基互补配对原则，合成出一条与模板DNA链互补的链互补的RNA分子的过程。分子的过程。反转录：反转录：以以RNA 为模板，按照碱基互补配对原则，合成出为模板，按照碱基互补配对原则，合成出一条与模板一条与模板RNA链互补的链互补的DNA分子的过程。分子的过程。翻译：翻译：在在mRNA指令下，按照三个核苷酸决定一个氨基酸指令下，按照三个核

6、苷酸决定一个氨基酸的原则，把的原则，把mRNA上的遗传信息转换成蛋白质中特定的氨基上的遗传信息转换成蛋白质中特定的氨基酸序列的过程。酸序列的过程。生物体内的遗传信息最生物体内的遗传信息最初是贮存在初是贮存在DNADNA或或RNARNA分分子中的。子中的。DNADNA或或RNARNA分子分子中的遗传信息需要依次中的遗传信息需要依次经过复制、转录、翻译经过复制、转录、翻译三个阶段，才能够被表三个阶段，才能够被表达出来。达出来。中心法则中心法则DNA的生物合成的生物合成MG2G1S哺乳动物的细胞周期DNA 合成期合成期基因组基因组整套整套DNA(病毒为病毒为RNA）一套染色体中的完整一套染色体中的完

7、整DNA序列序列核基因组，叶绿体基因组，线粒体基因组核基因组，叶绿体基因组，线粒体基因组复制复制（复制方式？）（复制方式？）参与大肠杆菌参与大肠杆菌DNADNA复制的酶类及有关因子复制的酶类及有关因子（负责者？）（负责者？）原核细胞原核细胞/ /真核细胞。真核细胞。DNADNA的复制的复制( (具体过程？）具体过程？）DNADNA的损伤、修复与突变的损伤、修复与突变（对异常情况的应对措施）（对异常情况的应对措施） DNA的生物合成的生物合成子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 分散式（混合式）分散式（混合式） 14.1.1.1

8、 半保留复制半保留复制半保留复制半保留复制指指DNA复制过程中，每个子代复制过程中，每个子代DNA分子的一条链来自亲分子的一条链来自亲代代DNA，而另一条链则是新合成的。，而另一条链则是新合成的。 14.1.1.1 半保留复制半保留复制CsCl 密度梯度离心密度梯度离心Meselson Stahl实验实验19581958年，首次通过实验的方法证明了年，首次通过实验的方法证明了DNADNA的半保留复制方式。的半保留复制方式。实验过程：实验过程：E.Coli1515NHNH4 4CICI培养多代培养多代1414NHNH4 4CICI培养（培养（1 1，2 2，33代）代）每代分别每代分别进行进行密

9、度梯度离心法分离密度梯度离心法分离DNADNA实验过程与结果推断（图示实验过程与结果推断（图示1）实验过程与结果推断（图示实验过程与结果推断（图示2）问题与思考问题与思考 如何证明如何证明DNA是半保留复制的？是半保留复制的？如是全保留复制，密度梯度离心实验结果？如是全保留复制，密度梯度离心实验结果？在在14N培养基只培养一代如何证明是半保留复制？培养基只培养一代如何证明是半保留复制？半保留复制的生物学意义半保留复制的生物学意义按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的即子代保留了亲代的全部遗传

10、信息，体现了遗传的保守性保守性。遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的不是绝对的。参与参与DNA复制的物质复制的物质 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP模板模板(template) : 解开成单链的解开成单链的DNA母链母链引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次聚合可以依次聚合 聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子聚合反应的特点DNA DNA 新链生成需新链生成需引物引物和和模板模板

11、DNADNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNADNA链作为模板。链作为模板。亲代亲代DNADNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。 新链的延长只可沿新链的延长只可沿5 5 3 3 方向进行方向进行: :（模板方向为（模板方向为 3 3 5 5 ，合成方向为，合成方向为5 5 3 3 。）。）1.1.DNADNA聚合酶（聚合酶（DNA PolymeraseDNA Polymerase）a 5a 533聚合酶活性聚合酶活性l按照模板按照模板DNADNA所规定的核苷酸顺序，将其通过所规定的核苷酸顺序，将其通过5 5，3

12、3磷酸二酯键彼此连接起来的酶活性。磷酸二酯键彼此连接起来的酶活性。b 3b 355外切酶活性（校正功能）外切酶活性（校正功能）c 5c 533外切酶活性（引物切除）外切酶活性（引物切除）功能：参与功能：参与DNADNA复制及复制及DNADNA的损伤修复的损伤修复14.1.1.2原核细胞中原核细胞中参与参与DNA复制的酶和蛋白因子复制的酶和蛋白因子53聚合酶活性聚合酶活性35外切酶活性外切酶活性特 性DDDPIDDDPIIDDDPIII53的聚合酶活性53的外切酶活性35的外切酶活性每个细胞中分子数酶相对活力功能+4001000复制中去除引物，补空隙+-+10050损伤修复+-+1050000复

13、制DDDPIDDDPI、DDDPIIDDDPII、DDDPIIIDDDPIII特性比较特性比较DDDP:DDDP:DNADNA Dependent DNA PolymeraseDependent DNA Polymerase枯草杆菌蛋白酶处理枯草杆菌蛋白酶处理DNADNA聚合酶聚合酶I I，获得大小两个片段，其中大，获得大小两个片段，其中大片段称片段称KlenowKlenow片段，具有片段，具有5533的聚合酶活性和的聚合酶活性和3355的的外切酶活性；小片段具有外切酶活性；小片段具有5533的外切酶活性的外切酶活性323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段

14、/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DDDPIKlenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行分子生物，进行分子生物学研究中常用的工具酶。学研究中常用的工具酶。 DNA聚合酶III异二聚体结构示意图夹子装配器夹子装配器（ 2 x ）核心酶核心酶（）滑动夹子滑动夹子聚合酶聚合酶活性活性35的外切酶活性的外切酶活性两个核心酶？两个核心酶？夹子作用？夹子作用？DNA聚合酶聚合酶 III 滑动夹子结构滑动夹子结构(a)末端俯视图 (b)侧视图真核细胞中的真核细胞中的DDDPDDDP真核细

15、胞中的真核细胞中的DDDPDDDP共有四种，分别是共有四种，分别是DDDPDDDP 、DDDPDDDP 、 DDDPDDDP 、 DDDP DDDP 。 DDDP DDDP 链合成的引发链合成的引发 DDDPDDDP 外切核酸酶外切核酸酶 DDDPDDDP 线粒体线粒体DNADNA复制复制 DDDPDDDP 链的延长；链的延长；切除引物后填补空隙切除引物后填补空隙 2.2.引物酶和引物体引物酶和引物体复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNARNA引物的酶引物的酶为引物酶。为引物酶。本质上是一种本质上是一种依赖依赖DNADNA的的RNARNA聚合酶（聚合酶（DDRPDDRP）。）。E.coli

16、E.coli的引物酶：的引物酶：DnaG,DnaG,由一条多肽链构成，由一条多肽链构成，6060KDKD，单独存单独存在是没有作用，只有与在是没有作用，只有与DnaBDnaB、DnaCDnaC、 DnaT DnaT、PriAPriA、PriBPriB、PriCPriC等蛋白组成一个复合体时，才能催化小分子等蛋白组成一个复合体时，才能催化小分子RNARNA的合成的合成, ,这种复合体称为引物体。这种复合体称为引物体。 3.3.DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶是将一个连接酶是将一个DNADNA单链的单链的5-5-磷酸基团与另一个磷酸基团与另一个DNADNA单单链的链的3-3-OHOH端以

17、端以3 3，5-5-磷酸二酯键相连接起来的一种酶。磷酸二酯键相连接起来的一种酶。DNADNA的连接是一个耗能反应。真核细胞由的连接是一个耗能反应。真核细胞由ATPATP供能，原核细胞由供能，原核细胞由NADNAD+ +供能。供能。功能功能（1 1）参加参加DNADNA损伤修复，将断开的损伤修复，将断开的DNADNA单链重新连接起单链重新连接起来；（来；（2 2）参加）参加DNADNA复制，将新合成的复制，将新合成的DNADNA片段连接起来形成片段连接起来形成完整的完整的DNADNA单链；（单链；（3 3）线状）线状DNADNA首尾相接形成环状首尾相接形成环状DNADNA。 POO-O-OHO5

18、POO-O-O335DNA连接酶连接酶ATPADP5353 4.4.解链酶解链酶( (DNADNA解螺旋酶解螺旋酶) ) （unwinding enzyme） l解链酶是在消耗解链酶是在消耗ATPATP的条件下，将双链的条件下，将双链DNADNA解开形成单解开形成单链的酶类。链的酶类。E. coliE. coli中的解链酶有两类，一类结合在滞中的解链酶有两类，一类结合在滞后链的模板上，沿后链的模板上，沿5353方向移动，另一类结合在方向移动，另一类结合在前导链的模板链上，沿前导链的模板链上，沿3535方向移动。方向移动。5.5.单链结合蛋白（单链结合蛋白（single strand bindi

19、ng protein,single strand binding protein, SSBSSB）6.DNA6.DNA拓扑异构酶（拓扑异构酶（DNADNA旋转酶）旋转酶）DNADNA拓扑异构酶是一类负责将超螺旋拓扑异构酶是一类负责将超螺旋DNADNA变成松弛态变成松弛态DNADNA或其或其逆向变化的一类酶。该类酶同时具有逆向变化的一类酶。该类酶同时具有内切酶及连接酶内切酶及连接酶功能。功能。 DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶I I 通过将通过将一条一条DNADNA双链中的一条链切断，使双链中的一条链切断，使其绕另一条链旋转，然后重新连接起来的方式，将超螺旋其绕另一条链旋转，然后重新连接起来的方

20、式，将超螺旋解除。解除。反应反应不需不需ATP。DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶IIII：切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过切口旋链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNA分子进分子进入负超螺旋状态。入负超螺旋状态。 1010 8 8 局部解链后局部解链后解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成解链产生的结果？解链产生的结果？14.1.1.314.1.1.3原核生物原核生物DNADNA的复制过程的复制过程 DNADNA的复制过程包括起始、延长、终止三个阶段。的复制过程包括起始、延长、终止三个阶段。起始起始复制起始点（

21、复制起始点（origin)origin)：原核生物只有一个复制起始点；真核原核生物只有一个复制起始点；真核生物染色体生物染色体DNADNA有多个复制起始点，同时形成多个复制单位。有多个复制起始点，同时形成多个复制单位。复制子复制子(replicon):(replicon):两个起始点之间的两个起始点之间的DNADNA片段；基因组能独立片段；基因组能独立进行复制的单位。进行复制的单位。复制泡复制泡(bubble)(bubble)：复制时复制时DNADNA双螺旋局部解链，并开始复制时双螺旋局部解链，并开始复制时形成的泡状结构。形成的泡状结构。复制叉复制叉(fork)(fork)：复制时双链打开，分

22、开成两股，新链沿着张开复制时双链打开，分开成两股，新链沿着张开的模板生成，复制中形成的这种的模板生成，复制中形成的这种Y Y字形的结构称为复制叉。字形的结构称为复制叉。起点起点泡泡叉叉双向复制双向复制 -bidirectional replication原核生物的复制是从一个起始点开原核生物的复制是从一个起始点开始，同时向两个方向进行，称为双始，同时向两个方向进行，称为双向复制。形成两个复制叉。复制中向复制。形成两个复制叉。复制中的的DNA成为成为 状。状。单向复制单向复制向起点的一侧进行复制，形成一个向起点的一侧进行复制，形成一个复制叉。复制叉。复制方向的实验证据复制方向的实验证据14.1.

23、1.314.1.1.3原核生物原核生物DNADNA的复制过程的复制过程 起始位点的结构起始位点的结构 大肠杆菌大肠杆菌DNA复制的起点称为复制的起点称为ori C，由由245个碱基构成，个碱基构成，关键是两组短的重复序列，这些序列在细菌中高度保守。关键是两组短的重复序列，这些序列在细菌中高度保守。DNA复制的复制的起始就是要解开双链和生成引物起始就是要解开双链和生成引物。DNA解成单链解成单链由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶解开双链，由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶解开双链，SSB结合到单结合到单链上使其稳定，链上使其稳定，提供模板。提供模板。引物合成引物合成引发体引导引物酶到达适当的位置合成

24、引物，引发体引导引物酶到达适当的位置合成引物，提供提供3 -OH末端末端b.b.前引发复合物前引发复合物DNADNA复制开始时，大约复制开始时，大约20-4020-40个个Dna ADna A蛋白各自携带一个蛋白各自携带一个ATPATP结合在起始位点处，并聚集在一起，结合在起始位点处，并聚集在一起，DNADNA缠绕其上形成起始缠绕其上形成起始复合物。复合物。HUHU是细胞类组蛋白，可与是细胞类组蛋白，可与DNADNA链结合，促使双链链结合，促使双链DNADNA弯曲，受其影响，邻近三组富含弯曲，受其影响，邻近三组富含ATAT的序列变性，形成开的序列变性，形成开链复合物，随后链复合物，随后Dna

25、BDna B六聚体在六聚体在Dna CDna C蛋白的帮助下，结合蛋白的帮助下，结合于解链区，并沿于解链区，并沿DNADNA链的链的5-35-3方向移动，形成方向移动，形成前引发复前引发复合物合物。引发复合物形成过程引发复合物形成过程形成单链形成单链形成引物形成引物延长延长延长概念延长概念l指在指在DNADNA聚合酶催化下，聚合酶催化下，dNTPdNTP以以dNMPdNMP的方式逐个加入引的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。生成。延长过程参与酶延长过程参与酶lDNADNA复制中与延长有关的酶主要有三种：复制中与延

26、长有关的酶主要有三种： DNADNA拓朴异构拓朴异构酶使超螺旋变成双螺旋，酶使超螺旋变成双螺旋，DNADNA解螺旋酶（解链酶）双链解螺旋酶（解链酶）双链DNADNA解链形成局部单链，解链形成局部单链，SSBSSB蛋白稳定解开的蛋白稳定解开的DNADNA单链。单链。 53355解链方向33553领头链领头链 ( (leading leading strand)strand)！顺着解链方向生成的子链，其复制是连续进行的，得到一顺着解链方向生成的子链，其复制是连续进行的，得到一条连续的子链。条连续的子链。随从链随从链 (lagging strand) (lagging strand) ！复制方向与解

27、链方向相反，须等解开足够长度的模板链才复制方向与解链方向相反，须等解开足够长度的模板链才能继续复制，得到的子链由不连续的片段所组成。能继续复制，得到的子链由不连续的片段所组成。半不连续复制半不连续复制DNA复制的延长复制的延长:后随链与前导链合成后随链与前导链合成DNA复制的延长复制的延长:后随链与前导链合成后随链与前导链合成a.a. DNADNA前导链的合成前导链的合成开始于由引物酶合成的一段开始于由引物酶合成的一段RNARNA小片段，小片段，在在DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII的催化下，按照从的催化下，按照从5353的方向，将的方向，将与模板与模板DNADNA对应的脱氧核苷酸不断加到引

28、物对应的脱氧核苷酸不断加到引物RNARNA或前面合或前面合成的成的DNADNA片段的片段的3-3-OHOH上，直到合成结束。上，直到合成结束。b.b. 随后链的合成随后链的合成是以合成是以合成冈崎片段冈崎片段的方式完成的，首先合的方式完成的，首先合成成RNARNA引物，随后在引物，随后在DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII的催化下，将脱氧核的催化下，将脱氧核苷酸依次以苷酸依次以3 3，5-5-磷酸二酯键的形式连接到磷酸二酯键的形式连接到RNARNA引物或前引物或前面合成的面合成的DNADNA片段的片段的3-3-OHOH，使其不断延长。使其不断延长。c. 先导链连续复制而随后链不连续复制，先导链

29、连续复制而随后链不连续复制，称为半不连续复称为半不连续复制或复制的半不连续性。制或复制的半不连续性。 ！ 半不连续复制半不连续复制冈崎片段：冈崎片段：l1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，因而将这复制中出现一些不连续的片段，因而将这些不连续的片段称为冈崎片段。些不连续的片段称为冈崎片段。l原核生物的冈崎片段为一至二千个核苷酸，真核生物原核生物的冈崎片段为一至二千个核苷酸，真核生物约为数百个核苷酸。约为数百个核苷酸。问题与思考问题与思考后随链的合成过程？不同冈崎片段结合时需要那两种酶？后随链的合

30、成过程？不同冈崎片段结合时需要那两种酶？两种酶各自的活性与作用？两种酶各自的活性与作用？随后链的合成方向在空间上与复制叉移动方向相反！随后链的合成方向在空间上与复制叉移动方向相反！一个酶如何实现两条链协同复制？一个酶如何实现两条链协同复制？随后链的合成方向在随后链的合成方向在空间上与复制叉移动空间上与复制叉移动方向相反！方向相反！一个酶如何实现两条一个酶如何实现两条链协同复制？链协同复制？DNA复制的终止过程！复制的终止过程！DDDPIDDDPI引物切除。引物切除。DDDPIDDDPI聚合酶活性聚合酶活性填补缺口。填补缺口。DNADNA连接酶连接酶将将DNADNA片片段连接起来，形成完段连接起

31、来，形成完整的整的DNADNA分子。分子。DDDPI的外切酶活性方向？的外切酶活性方向？原核生物复制的终止原核生物复制的终止原核生物环状原核生物环状DNA为双向复制，复制片段在复制的终止点为双向复制，复制片段在复制的终止点汇合。每个方向的领头链和相反方向的随从链的连接与不汇合。每个方向的领头链和相反方向的随从链的连接与不连续片段的连接相同。连续片段的连接相同。真核生物复制的终止真核生物复制的终止染色体染色体DNA呈线性，复制在末端停止。呈线性，复制在末端停止。问题与思考问题与思考线性线性DNA每复制一次，长度是否会变短？每复制一次，长度是否会变短？复制过程简图复制过程简图（4 4）复制保真性的

32、机制复制保真性的机制复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。代的基本原理。复制保真性的酶学机制：复制保真性的酶学机制：DNA聚合酶聚合酶对底物的选择性对底物的选择性DNA聚合酶聚合酶核酸外切酶活性和及时校读（错配时）核酸外切酶活性和及时校读（错配时） 染色质复制染色质复制真核生物的真核生物的DNADNA复制过程与原核生物基本相同，但由于真核生复制过程与原核生物基本相同，但由于真核生物的物的DNADNA均以染色质的形式存在，且分子量比原核生物大得多，均以染色质的形式存在，且分子量比原核生物大得多，因此也有一些明显不同特点。因此也有一些

33、明显不同特点。lDNADNA复制酶不同复制酶不同。l真核生物有真核生物有DNADNA复制采取的是复制采取的是多点复制多点复制。 lRNARNA引物引物比原核生物短得多，一般只有比原核生物短得多，一般只有1010bpbp。l真核生物真核生物DNADNA单点复制的单点复制的速度慢速度慢为为500-5000500-5000bpbp，原核原核生物生物10105 5bpbp。14.1.1.4 真核细胞真核细胞DNA复制复制Replicating DNA of Drosophila melanogaster多点复制实验证据多点复制实验证据The End Replication Problem:Telome

34、res shorten with each S phaseOriDNA replication is bidirectional ;Polymerases move 5 to 3Requires a labile primer353555335Each round of DNA replication leaves 50-200 bp DNA unreplicated at the 3 end端粒端粒(telomere)真核生物染色体线性真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。分子末端的结构。结构特点结构特点1. 由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成序列和蛋白质构成2. 末端末端DNA序

35、列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列碱基的短序列功能功能1. 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性2. 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性端粒复制端粒复制5353Telomerict loopNUCLEARMATRIXTelomeres: ends of linear chromosomesCentromereTelomereTelomere端粒酶端粒酶(telomerase)特点：特点：1.由由RNA和蛋白质和蛋白质构成的复合物构成的复合物2.为特殊的逆转录酶，能以为特殊的逆转录酶，能以自身的自身的RNA为模板逆转录合成端为模板逆转录合成端粒粒DNA功能：功能：合成端

36、粒合成端粒DNA，维持端粒的长度，维持端粒的长度端粒复制的爬行模型： 端粒及端粒酶的意义：端粒的长短及端粒酶活性变化与细胞水平的老化(aging)及肿瘤的发生有一定关系。19711971年年TeminTemin和和BaltamoreBaltamore两个实验室同时报道某些肉瘤病毒可两个实验室同时报道某些肉瘤病毒可以在专一性酶的催化下，以在专一性酶的催化下，以以RNARNA为模板进行为模板进行DNADNA的生物合成的生物合成的发的发现，由于与通常人们所知的转录作用相反，因此称为现，由于与通常人们所知的转录作用相反，因此称为逆转录！。逆转录！。催化逆转录的酶称为逆转录酶。逆转录酶是一个多功能酶，同

37、催化逆转录的酶称为逆转录酶。逆转录酶是一个多功能酶，同时具有时具有RDDPRDDP活性、活性、DDDPDDDP活性、核糖核酸酶活性、核糖核酸酶H H等活性。等活性。RNase HRNase H酶酶: :水解水解RNADNARNADNA杂合分子中的杂合分子中的RNARNA，可沿，可沿3 355和和5 533两个方向起外切酶作用。两个方向起外切酶作用。病毒侵入 宿主细胞 RDDP核酸酶H DDDP 整合 RNA RNA-DNA DNA DNA-DNA 逆转录过程示意图逆转录过程示意图 14.1.2 逆转录逆转录逆转录详细过程逆转录详细过程（略）（略）引物引物1.A retrovirus-speci

38、fic cellular tRNA hybridizes with a complementary region called the primer-binding site (PBS). 2.A DNA segment is extended from tRNA based on the sequence of the retroviral genomic RNA. 3.The viral R and U5 sequences are removed by RNase H. 4.First jump: DNA hybridizes with the remaining R sequence

39、at the 3 end. 5.A DNA strand is extended from the 3 end. 逆转录详细过程逆转录详细过程（略）（略）6.Most viral RNA is removed by RNase H. 7.A second DNA strand is extended from the viral RNA. 8.Both tRNA and the remaining viral RNA are removed by RNase H. 9.Second jump: The PBS region of the second strand hybridizes wit

40、h the PBS region of the first strand. 10.Extension on both DNA strands. LTR stands for long terminal repeat. 逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNA法。法。 cDNA complementary DNA 以以mRNA为模板，经逆转录合成为模板，

41、经逆转录合成的与的与mRNA碱基序列互补的碱基序列互补的DNA链。链。 逆转录的应用：逆转录的应用：试管内合成试管内合成cDNA（补充）（补充）（二二）逆转录研究的意义逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样同样兼有遗传信息传代与表达功能。兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意世纪初已注意到的到的病毒致癌理论病毒致癌理论。 病毒致癌理论病毒致癌理论被整合到宿主细胞中的病毒被整合到宿

42、主细胞中的病毒DNADNA称为称为前病毒前病毒，当条件合适时，当条件合适时，它可以利用宿主细胞的转录系统合成病毒它可以利用宿主细胞的转录系统合成病毒RNARNA，利用蛋白质利用蛋白质合成系统合成逆转录酶、病毒被膜蛋白合成系统合成逆转录酶、病毒被膜蛋白( (envelopeenvelope) )及衣壳及衣壳蛋白蛋白( (casid)casid)，组装成新的病毒颗粒去侵染其它细胞，引发组装成新的病毒颗粒去侵染其它细胞，引发肿瘤，这种学说称为致癌理论中的前病毒学说。肿瘤，这种学说称为致癌理论中的前病毒学说。3 -OH5 -P5 5 5 3 3 3 3 5滚环复制滚环复制5 5 3 3 5 滚环复制滚

43、环复制(rolling circle replication) （补充）（补充） 是某些低等生物的复制形式，如是某些低等生物的复制形式，如 X X174174和和M13M13噬菌体等。噬菌体等。dNTPDNA-pol D环复制环复制(D-loop replication)（补充）（补充） 是线粒体是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。的复制形式。由于受紫外线辐射、电离辐射等物理因素及由于受紫外线辐射、电离辐射等物理因素及亚硝酸亚硝酸、羟胺羟胺、烷化剂烷化剂等化学因素的影响，等化学因素的影响，DNADNA分子的核苷酸组成或结构发生分子的核苷酸组成或结构发生

44、改变，这种现象称为改变，这种现象称为DNADNA的损伤。如紫外线照射导致形成嘧啶的损伤。如紫外线照射导致形成嘧啶二聚体，常见为二聚体，常见为胸腺嘧啶二聚体胸腺嘧啶二聚体。14.1.3 DNA损伤、修复与突变损伤、修复与突变 UVDNADNA损伤的修复方式：损伤的修复方式：光裂合酶修复（光修复）、切除修复、重组修复及光裂合酶修复（光修复）、切除修复、重组修复及SOSSOS修复。修复。1.1.光修复光修复( (直接修复直接修复) )光复活修复系统是生物体内专一性修复紫外线造成的嘧啶二光复活修复系统是生物体内专一性修复紫外线造成的嘧啶二聚体损伤的一种修复机制。光复活酶可以自发地寻找到损伤聚体损伤的一

45、种修复机制。光复活酶可以自发地寻找到损伤部位，并与之结合，随后利用光的能量，将嘧啶二聚体损伤部位，并与之结合，随后利用光的能量，将嘧啶二聚体损伤部位修复。部位修复。 光复活修复广泛存在于除灵长类动物之外的所有生物细胞内。光复活修复广泛存在于除灵长类动物之外的所有生物细胞内。 14.1.3 DNA损伤、修复与突变损伤、修复与突变1、光修复、光修复(直接修复直接修复)1 1、切断、切断特异性内切酶特异性内切酶2 2、修复、修复3 3、切除、切除4 4、连接、连接DNADNA聚合酶聚合酶5 5- -核酸外切酶核酸外切酶DNADNA连接酶连接酶 2、切除修复、切除修复（暗修复） 切除修复是利用切除修复

46、是利用DNA内切酶等一系列酶将内切酶等一系列酶将DNA损伤部位切损伤部位切除，随后用正常的除，随后用正常的DNA片断取而代之的一种修复机制。片断取而代之的一种修复机制。3 3、重组修复重组修复老链老链新链新链新链新链复制复制DNADNA复制复制DNADNA重组重组填补缺口填补缺口3 3、重组修复重组修复SOSSOS修复是细胞内的一种应急修复系统，当细胞修复是细胞内的一种应急修复系统，当细胞DNADNA受到大受到大范围损伤时，细胞中范围损伤时，细胞中DNADNA不能正常复制，此时细胞会受诱导不能正常复制，此时细胞会受诱导产生一种不具校正功能的酶，此酶可以催化产生一种不具校正功能的酶，此酶可以催化

47、DNADNA的复制，虽的复制，虽错误较多，但可以避免死亡，故名。错误较多，但可以避免死亡，故名。 4、SOS修复修复14.1.3.2 14.1.3.2 突变的分子改变类型突变的分子改变类型错配错配 (mismatch)缺失缺失 (deletion)插入插入 (insertion)重排重排 (rearrangement)框移框移(frame-shift) DNA分子上的碱基错配称分子上的碱基错配称点突变点突变(point mutation)。转换转换: :发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。代替另一嘧啶。颠换颠换: :发生在异

48、型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。1 1、错配错配N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因N-val his leu thr pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因镰刀红细胞贫血症！镰刀红细胞贫血症！mRNA: GAGGUG2 2、缺失缺失、插入插入和框移和框移缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。大分子上消失。插入：插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。大分子中间。缺

49、失或插入都可导致缺失或插入都可导致框移突变框移突变 。框移突变框移突变:指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨 基酸排列顺序发生改变。（基酸排列顺序发生改变。（原因见蛋白质合成原因见蛋白质合成）3、重排：、重排：DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。分子内较大片段的交换，称为重组或重排。生物体内生物体内RNARNA的生物合成根据模板及具体合成方式的不同的生物合成根据模板及具体合成方式的不同分为分为转录和复制转录和复制两种方式。两种方式。DNADNA指导的指导的RNARNA合成（转录！合成（转录！）转录是指在转录是指在RNARNA聚合酶催化下，按照

50、碱基互补配对原则，聚合酶催化下，按照碱基互补配对原则，以四种以四种NTPNTP为底物，以为底物，以DNADNA单链为模板合成单链为模板合成RNARNA的化学过程。的化学过程。除极少数生物细胞之外，生物体的除极少数生物细胞之外，生物体的mRNAmRNA、tRNAtRNA、rRNArRNA都都是通过转录作用形成的。催化转录作用的酶称为是通过转录作用形成的。催化转录作用的酶称为RNARNA聚合聚合酶。酶。RNARNA指导的指导的RNARNA合成（复制合成（复制！ ）此种方式常见于病毒。此种方式常见于病毒。14.2 RNA的生物合成的生物合成l基因表达的第一步基因表达的第一步l以以D. S. DNA中

51、的中的DNA片段转录时，双链片段转录时，双链DNA中只有一条中只有一条链作为转录的模板，这种转录方式称作链作为转录的模板，这种转录方式称作不对称转录不对称转录 ！。！。l在在依赖依赖DNA的的RNA聚合酶聚合酶的作用下的作用下l按按A U，T A，C G 配对的原则，合成配对的原则，合成RNA分子。分子。DNA3-TACTCAT-5RNA 5-AUGAGUA-35-ATGAGTA-3Non-template (sense strand)template (antisense strand)转录相关转录相关基本概念基本概念 l 模板链及反意义链：模板链及反意义链：指导指导RNA合成的合成的DNA

52、链为模板链，又链为模板链，又称反意义链称反意义链 ！l 编码链及有意义链：编码链及有意义链：不作为转录的另一条不作为转录的另一条DNA链为编码链，链为编码链，又称有意义链又称有意义链 ！l 由于基因分布于不同由于基因分布于不同的的DNA单链中，即单链中，即某条某条DNA单链对某单链对某个基因是模板链，而对另一个基因则是编码链。个基因是模板链，而对另一个基因则是编码链。l 模板单链模板单链 DNA的极性方向为的极性方向为3 5, 而非模板单链而非模板单链DNA的的极性方向与极性方向与RNA链相同，均为链相同，均为5 3.l 书写书写DNA序列时，仅写非模板序列，可不注明极性方向序列时，仅写非模板

53、序列，可不注明极性方向转录相关转录相关基本概念基本概念When referring to DNA transcription (protein biosynthesis), the coding strand is the DNA strand which has the same base sequence as the RNA transcript produced (although with thymine replaced by uracil). Wherever a gene exists on a DNA molecule, one strand is the coding st

54、rand (or sense strand or non-template strand), and the other is the noncoding strand (also called the antisense strand antisense is a general term for a sequence of DNA or RNA that is complementary to mRNA, anticoding strand, or template strand).转录所对应的两条转录所对应的两条DNA链的定义：链的定义：转录相关转录相关基本概念基本概念Messenger

55、 RNA (mRNA) is single-stranded. Its sequence of nucleotides is called sense because it results in a gene product (protein). RNA can form duplexes just as DNA does. All that is needed is a second strand of RNA whose sequence of bases is complementary to the first strand; e.g., 5 C A U G 3 mRNA3 G U A

56、 C 5 Antisense RNA The second strand is called the antisense strand because its sequence of nucleotides is the complement of message sense. When mRNA forms a duplex with a complementary antisense RNA sequence, translation is blocked. 转录相关转录相关基本概念基本概念转录所对应的两条转录所对应的两条DNA链的定义：链的定义：l RNA的转录包括的转录包括promot

57、ion, elongation, termination 三过程三过程 l从启动子（从启动子（promoter）到终止子（）到终止子（terminator）称为转录单）称为转录单位位 （transcriptional unit）l原核生物中的转录单位多为原核生物中的转录单位多为 polycistron in operon！l真核生物中的转录单位多为真核生物中的转录单位多为monocistron, No operon！l转录原点记为转录原点记为+1，其上游记为，其上游记为负值负值，下游记为，下游记为正值正值+1 -10 +10upstreamstart pointdownstream转录相关转录

58、相关基本概念基本概念E.coliE.coli的的E E，M.W 480000-500000M.W 480000-500000，在在6 6M M的脲中可以解离成的脲中可以解离成 、 、 、 及及 五五种亚基。全酶由两个种亚基。全酶由两个 亚基、一个亚基、一个 亚基、亚基、一个一个 亚基、一个亚基、一个 亚基及一个亚基及一个 因子构成，其中除因子构成，其中除 因子外，因子外，其它五个亚基结合紧密称为核心酶。其它五个亚基结合紧密称为核心酶。 2.RNA聚合酶聚合酶核心酶核心酶核心酶：核心酶：能与能与DNADNA链结合并启动转录，但没有特异性，转录出来链结合并启动转录，但没有特异性，转录出来的可能不是

59、一个完整的基因序列。的可能不是一个完整的基因序列。亚基分子量每分子酶中所含数目功能365122决定基因转录的特异性1506181与转录全过程有关1556131结合DNA模板！702631辨认起始位点！原核原核RNARNA聚合酶各个亚基的作用聚合酶各个亚基的作用1 1. .聚合速率慢，聚合速率慢，30-85NTP/30-85NTP/秒秒2.2.缺乏外切酶活性缺乏外切酶活性, ,无校对功能，错误率无校对功能，错误率1010-6-63.3.不同的不同的因子识别不同的启动子因子识别不同的启动子 4.4.可被药物抑制（利福平）可被药物抑制（利福平） 人的人的RNARNA聚合酶对利福平不敏感。利用此特点可

60、研制杀菌药物聚合酶对利福平不敏感。利用此特点可研制杀菌药物 原核原核RNARNA聚合酶特点聚合酶特点因子：因子：重复使用重复使用(Re-usable) 使使 Holo-enzyme识别识别Sextama Box（-35区）区）, 与模板链结合与模板链结合修饰修饰 RNApol 构型构型降低全酶与降低全酶与DNA的非专一性结合力的非专一性结合力增强全酶与增强全酶与R（recognition，-35区）区）, B （binding，-10区区) site的专一性结合力的专一性结合力导致导致RNA链的延伸缓慢链的延伸缓慢真核生物真核生物RNA聚合酶聚合酶真核生物体内真核生物体内RNARNA聚合酶有三种，分别