聚醚类抗生素盐霉素的高效毛细管电泳电导分离检测

1、聚醚类抗生素盐霉素的高效毛细管聚醚类抗生素盐霉素的高效毛细管电泳电泳电导分离检测电导分离检测答辩人：罗洁答辩人：罗洁指导老师：谢天尧指导老师：谢天尧 盐霉素（盐霉素（salinomycinsalinomycin）又名沙利霉素、球虫粉、优素，属）又名沙利霉素、球虫粉、优素，属于聚醚类抗生素。在实际应用中，常用其钠盐，即盐霉素钠，于聚醚类抗生素。在实际应用中，常用其钠盐，即盐霉素钠，分子式为分子式为C C4242H H6969O O1111Na,Na,分子量为分子量为772.99772.99。结构式比较复杂，可。结构式比较复杂，可示意为：示意为：色态：白色或浅棕色无定形粉末，无味色态：白色或浅棕色

2、无定形粉末，无味溶解性：溶解性：微溶于水，易溶于低级醇、乙醚等有机溶剂微溶于水，易溶于低级醇、乙醚等有机溶剂稳定性：在中性或碱性环境中稳定，在高温稳定性：在中性或碱性环境中稳定，在高温120120时不失活，时不失活，在酸性介质中不稳定。在酸性介质中不稳定。 应用现状：应用现状： 国内外广泛用来防治牛、羊、鸡、兔的球虫病；同时可国内外广泛用来防治牛、羊、鸡、兔的球虫病；同时可作为饲料添加剂使用，促进畜禽生长发育和提高饲料利用率。作为饲料添加剂使用，促进畜禽生长发育和提高饲料利用率。但是聚醚类抗生素使用剂量的安全范围较窄，盐霉素对肉鸡但是聚醚类抗生素使用剂量的安全范围较窄，盐霉素对肉鸡的的为毫克千

3、克体重。其在饲料中的含量稍大为毫克千克体重。其在饲料中的含量稍大即可使动物的增重减慢，饲料转化率降低。即可使动物的增重减慢，饲料转化率降低。 现有的检测方法：现有的检测方法：高效液相色谱柱后衍生化法高效液相色谱柱后衍生化法 高效液相色谱柱前衍生化法高效液相色谱柱前衍生化法分光光度法分光光度法 本实验采用毛细管电泳本实验采用毛细管电泳电导检测法（电导检测法（CECDCECD）对盐霉素）对盐霉素进行分离检测进行分离检测实验主要内容：实验主要内容： 分离条件的选择分离条件的选择 重现性、线性范围和检测限重现性、线性范围和检测限 样品测定样品测定 缓冲体系种类及其浓度缓冲体系种类及其浓度 进样方式进样

4、方式 分离电压分离电压 提取方法提取方法分离条件的选择分离条件的选择缓冲体系种类及其浓度缓冲体系种类及其浓度 缓冲体系种类的选择缓冲体系种类的选择： Tris(Tris(三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷 ) )硼酸：盐霉素得不到检测硼酸：盐霉素得不到检测 TrisTris：盐霉素得不到检测：盐霉素得不到检测 醋酸钠氨水：可检测到盐霉素醋酸钠氨水：可检测到盐霉素 TrisTrisHAcHAcCit(Cit(柠檬酸柠檬酸 ) )：可检测到盐霉素，：可检测到盐霉素， 且分离度和灵敏度最佳且分离度和灵敏度最佳 缓冲体系中各组分浓度的确定：缓冲体系中各组分浓度的确定： 经过系列试验后发现，经过系列试验后

5、发现， TrisTrisHacHacCitCit体系中三种组体系中三种组分的浓度对盐霉素测定的分离度和灵敏度都有所影响分的浓度对盐霉素测定的分离度和灵敏度都有所影响 分离条件的选择分离条件的选择缓冲体系种类及其浓度缓冲体系种类及其浓度 Tris Tris：主要用于调节缓冲容量以及主要用于调节缓冲容量以及pHpH值，但当值，但当TrisTris浓度太大时，水浓度太大时，水峰后容易形成正峰，影响对盐霉素蜂的测定（图峰后容易形成正峰，影响对盐霉素蜂的测定（图1 1）。其浓度的大小对）。其浓度的大小对灵敏度影响不大。灵敏度影响不大。 HacHac：浓度增加可避免水峰后的正峰出现，但随着浓度的继续增加，

6、浓度增加可避免水峰后的正峰出现，但随着浓度的继续增加，水峰形成拖尾，对盐霉素峰造成干扰（图水峰形成拖尾，对盐霉素峰造成干扰（图2 2）。灵敏度在）。灵敏度在HacHac浓度为浓度为1 1 mmol/Lmmol/L到到5 mmol/L5 mmol/L之间，随之间，随HacHac浓度的增加而降低。浓度的增加而降低。23t / m i n图图134t / m i n图图2 2 Cit Cit：主要用于调节：主要用于调节PHPH值，随着值，随着CitCit的加入，的加入，PHPH降低，水峰拖尾加重，降低，水峰拖尾加重，对盐霉素峰造成干扰。灵敏度在对盐霉素峰造成干扰。灵敏度在CitCit浓度为浓度为0.

7、05mmol/L0.05mmol/L到到0.4mmol/L0.4mmol/L之之间，随间，随CitCit浓度的增加稍微降低。浓度的增加稍微降低。 分离条件的选择分离条件的选择缓冲体系种类及其浓度缓冲体系种类及其浓度 综合上述影响因素，确定综合上述影响因素，确定12 mmol /LTris+1 mmol/L12 mmol /LTris+1 mmol/L醋酸醋酸+0.2 +0.2 mmol/Lmmol/L柠檬酸柠檬酸为电泳缓冲体系。该缓冲体系，基线平稳，并且在保证该为电泳缓冲体系。该缓冲体系，基线平稳，并且在保证该检测方法的灵敏度的同时，不形成正峰，水峰对盐霉素峰的基本无干扰检测方法的灵敏度的同时

8、，不形成正峰，水峰对盐霉素峰的基本无干扰（图（图3 3）。）。 4t / m i n图图3 3分离条件的选择分离条件的选择进样方式进样方式 分别用分别用纯水纯水，1 1：4 4甲醇水溶液甲醇水溶液，1 1：1 1甲醇水溶液甲醇水溶液，无水甲无水甲醇醇制备进样样品，随着甲醇含量的增加，水峰出峰时间推迟，制备进样样品，随着甲醇含量的增加，水峰出峰时间推迟，并且与盐霉素的出峰时间差增大，分离度提高。并且与盐霉素的出峰时间差增大，分离度提高。 0.00.20.40.60.81.0100150200250300350400450500550盐霉素峰面积甲醇含量图图4 4：进样样品中甲醇含量与盐霉素峰面积

9、的关系图：进样样品中甲醇含量与盐霉素峰面积的关系图本实验采用本实验采用1 1：1 1甲醇水溶液甲醇水溶液 制备进样样品，以制备进样样品，以取得较高的灵敏度。取得较高的灵敏度。分离条件的选择分离条件的选择进样方式进样方式电动进样：电动进样：重力进样：重力进样：盐霉素峰面积增加，但峰形不对称；盐霉素峰面积增加，但峰形不对称；必须用缓冲溶液制备进样样品；必须用缓冲溶液制备进样样品；所得到的谱图往往因为水峰后存在正峰而所得到的谱图往往因为水峰后存在正峰而 难以对盐霉素峰进行测定难以对盐霉素峰进行测定 峰面积虽然减小，但峰形佳；峰面积虽然减小，但峰形佳；用用1 1：1 1甲醇水溶液甲醇水溶液制备进样样品

10、，分离效果理想；制备进样样品，分离效果理想；采用采用重力进样重力进样20 s20 s，可得到较好的重现性。，可得到较好的重现性。分离条件的选择分离条件的选择分离电压分离电压 电压电压水峰出峰时间水峰出峰时间盐霉素峰出峰时间盐霉素峰出峰时间出峰时间差出峰时间差12Kv12Kv3 3：34344 4：080834 s34 s10Kv10Kv4 4：20205 5：000040 s40 s8Kv8Kv5 5：32326 6：222250 s50 s分离电压对出峰时间以及出峰时间差的影响分离电压对出峰时间以及出峰时间差的影响 从上表可看出，随着电压的降低，水峰和盐霉素峰的从上表可看出，随着电压的降低，

11、水峰和盐霉素峰的出峰时间都推迟，并且两者的出峰时间差逐步增大。出峰时间都推迟，并且两者的出峰时间差逐步增大。 在保证水峰不干扰盐霉素峰的前提下，选择使用在保证水峰不干扰盐霉素峰的前提下，选择使用 12 Kv12 Kv作为分离电压，可实现在作为分离电压，可实现在5 5分钟之内对盐霉素进行分钟之内对盐霉素进行检测。检测。重现性、线性范围和检测限重现性、线性范围和检测限 重现性重现性：在上述选定的实验条件下，对盐霉素的标准溶液连续：在上述选定的实验条件下，对盐霉素的标准溶液连续进行进行6 6次测定，出峰时间和峰面积次测定，出峰时间和峰面积RSDRSD为为0.7%0.7%和和2.8%2.8% 0204

12、06080100010002000300040005000600070008000峰面积浓度（m g / L）校正曲线上图，检测校正曲线上图，检测线性范围线性范围为：为：5 mg/L100 mg/L，峰面积，峰面积S与浓度与浓度C（mg/L）的回归方程为：）的回归方程为：S=75.5C-162，R=0.9996 检出限检出限（S/N=3S/N=3）为）为1mg/L。 样品测定样品测定四种提取方法四种提取方法方法一方法一：准确称取准确称取0.15 g盐霉素饲料添加剂，倒入样品瓶中，加入盐霉素饲料添加剂，倒入样品瓶中，加入5.00 ml 1：1甲醇水溶液甲醇水溶液，密封，超声，密封，超声10分钟后

13、，取上层清液于分钟后，取上层清液于4000 r/min离心机离心机离心离心10分钟，移取分钟，移取0.300ml上层清液到进样瓶中进上层清液到进样瓶中进行进样。行进样。方法二方法二：称取约称取约2 g盐霉素饲料添加剂盐霉素饲料添加剂研磨研磨10分钟，准确称取研磨分钟，准确称取研磨后的添加剂后的添加剂0.15 g，倒入样品瓶中，加入，倒入样品瓶中，加入5.00 ml 乙醚乙醚，密封，超，密封，超声声10分钟后，移取分钟后，移取0.300 ml上层清液到进样瓶中，在上层清液到进样瓶中，在60水浴中将水浴中将乙醚全部挥发乙醚全部挥发，再加入，再加入0.300ml 1：1甲醇水溶液，超声甲醇水溶液，超

14、声5分钟后进分钟后进样。样。样品测定样品测定四种提取方法四种提取方法方法三方法三：准确称取上述研磨后的添加剂：准确称取上述研磨后的添加剂0.15 g，倒入样品瓶中，加，倒入样品瓶中，加入入5.00 ml 乙醚，密封，超声乙醚，密封，超声10分钟并分钟并放置放置24小时小时后，移取后，移取0.300 ml上层清液到进样瓶中，在上层清液到进样瓶中，在60水浴中将乙醚全部挥发，再加入水浴中将乙醚全部挥发，再加入0.300ml 1：1甲醇水溶液，超声甲醇水溶液，超声5分钟后进样。分钟后进样。方法四方法四：称取约：称取约2 g盐霉素饲料添加剂盐霉素饲料添加剂研磨研磨20分钟分钟，准确称取研磨，准确称取研

15、磨后的添加剂后的添加剂0.15 g，倒入样品瓶中，加入，倒入样品瓶中，加入2.50 ml 乙醚乙醚，密封，超声，密封，超声10分钟后，移取分钟后，移取0.150 ml上层清液到进样瓶中，剩余的乙醚全部移上层清液到进样瓶中，剩余的乙醚全部移出，再加入出，再加入2.50 ml 乙醚乙醚，密封，超声，密封，超声10分钟，再次移取分钟，再次移取0.150 ml上上层清液到进样瓶中，在层清液到进样瓶中，在60水浴中将乙醚全部挥发后，加入水浴中将乙醚全部挥发后，加入0.300ml 1：1甲醇水溶液，超声甲醇水溶液，超声5分钟后进样。分钟后进样。四种提取方法的回收率及优缺点比较四种提取方法的回收率及优缺点比

16、较 样品测定样品测定方法方法回收率回收率优缺点优缺点一一大量同存组分被萃取出来，严重影响盐大量同存组分被萃取出来，严重影响盐霉素的测定。霉素的测定。 二二55.458.9 操作简便，省时，但回收率低。操作简便，省时，但回收率低。 三三88.389.3 操作简便，回收率较方法二有所提高，操作简便，回收率较方法二有所提高，但较为耗时。但较为耗时。 四四93100.1 操作简便，省时，回收率高操作简便，省时，回收率高 。样品测定样品测定 采用采用第四种提取方法第四种提取方法，在，在上述的分离条件上述的分离条件下对盐霉素饲料添下对盐霉素饲料添加剂进行测定，加剂进行测定，测得其含量为标示值的测得其含量为标示值的95.295.2，回收率为，回收率为93.093.0100.1100.1。盐霉素标准溶液（盐霉素标准溶液（a a）及盐霉素饲料添加剂（）及盐霉素饲料添加剂（b b）的）的对照对照CE-CDCE-CD谱图谱图1 1：盐霉素：盐霉素; 2; 2：水：水2345621at /min23456b21t/min 本文采用本文采用高效毛细管电泳高效毛细管电泳/电导检测法电导检测法建立了盐霉建立了盐霉素的快