第9章：发酵剂制备

1、 第第9章：发酵剂制备章：发酵剂制备 9.1 基本概念基本概念一一.生产种子生产种子 用于发酵生产接种的纯培养物用于发酵生产接种的纯培养物二二.种子扩大培养种子扩大培养 将沙土管（或冷冻安瓿瓶）中的将沙土管（或冷冻安瓿瓶）中的“休眠态菌种休眠态菌种”接入斜面活化，经扁瓶、摇瓶及种子罐接入斜面活化，经扁瓶、摇瓶及种子罐“逐级扩大逐级扩大”培养，获得一定数量、质量纯培养的过程。培养，获得一定数量、质量纯培养的过程。三三.优质种子的性质优质种子的性质1.细胞活力强：细胞活力强： 接入发酵罐后生长迅速，延滞期短。接入发酵罐后生长迅速，延滞期短。2.生理性状稳定：生理性状稳定： 菌体生长过程稳定。菌体生

2、长过程稳定。3.生产能力稳定：生产能力稳定： 终产物合成量持续、稳定，高产。终产物合成量持续、稳定，高产。4.菌体细胞浓度高：菌体细胞浓度高：5.无杂菌污染：无杂菌污染：四四.制备优质种子必备的条件制备优质种子必备的条件 1.有一种良好的活化有一种良好的活化Medium：能使沙土管等长期保存菌种的复活率（休眠态细胞能使沙土管等长期保存菌种的复活率（休眠态细胞转化为活化细胞的比率）达到最高程度，能最大限度转化为活化细胞的比率）达到最高程度，能最大限度的使有活力的微生物从的使有活力的微生物从“休眠状态休眠状态”复苏、活化。复苏、活化。 2.接种环境：无菌接种环境：无菌 3.具有定量判断种子具有定量

3、判断种子“质量质量”的标准：的标准： 4.具有定量测定菌种多种具有定量测定菌种多种“生理生化性状的生理生化性状的”方方法：法：能最大限度地将种子培养到适合最终生产规模的能最大限度地将种子培养到适合最终生产规模的“生理状态生理状态”；能测定反映微生物的活性的各种指标；能测定反映微生物的活性的各种指标 5.培养培养“容器与环境容器与环境” 能满足种子扩大培养的要能满足种子扩大培养的要求：求： 能最大限度获得与接入菌株基因型相同的能最大限度获得与接入菌株基因型相同的“拷贝拷贝”。9.2 种子扩大培养的工艺流程种子扩大培养的工艺流程一一.工艺流程工艺流程1 1沙土（冷冻）管沙土（冷冻）管22母斜面母斜

4、面33子斜面子斜面44扁瓶（固扁瓶（固态）或摇瓶（液态，菌丝）态）或摇瓶（液态，菌丝）55种子罐种子罐66发酵罐。发酵罐。1 14 4：实验室阶段：实验室阶段：5 56 6：生产车间；：生产车间；实验室种子制备：实验室种子制备：孢子制备孢子制备+ +摇瓶液体种子制备（制备工艺、注意事摇瓶液体种子制备（制备工艺、注意事项、影响因素、控制方法。）项、影响因素、控制方法。）二二. .实验室扩大培养实验室扩大培养（一）（一）孢子制备孢子制备重要起点，影响整个发酵过程。重要起点，影响整个发酵过程。不同菌种孢子制备工艺不同不同菌种孢子制备工艺不同1.1.制备工艺制备工艺放线菌：放线菌：孢子培养基多采用孢子

5、培养基多采用“人工合成人工合成Medium”Medium”高氏高氏1 1号，号，C C、N N源不能太丰富；源不能太丰富；C/NC/N应稍大，应稍大，N N少为宜少为宜目的：目的：少产菌丝，多产孢子少产菌丝，多产孢子沙土（冷冻）管沙土（冷冻）管母斜面母斜面子斜面子斜面摇瓶（菌丝）摇瓶（菌丝）种子罐种子罐发酵罐。发酵罐。温度：温度：28；时间：；时间：47d保存：孢子成熟，保存：孢子成熟，5冰箱（库）内；保存时间：冰箱（库）内；保存时间：7d，少数可达，少数可达13月。月。 霉菌孢子霉菌孢子 用天然培养基效果好：大米，小米，麸皮。用天然培养基效果好：大米，小米，麸皮。 优点：来源广泛；价格低；产

6、孢子量大优点：来源广泛；价格低；产孢子量大 培养工艺：培养工艺： 沙土（冷冻）管沙土（冷冻）管母斜面母斜面子斜面子斜面孢子悬液孢子悬液亲米亲米生产米生产米种子罐种子罐发酵罐发酵罐 细菌细菌：多保存于冷冻管多保存于冷冻管或安瓿瓶或安瓿瓶内。内。芽孢杆菌亦可用斜面或沙土管保存。用斜面保存时芽孢杆菌亦可用斜面或沙土管保存。用斜面保存时可用液体石蜡密封。可用液体石蜡密封。斜面斜面F F1 1（一代）（一代）斜面斜面F F2 2-F-Fn n（二代（二代n代代）摇瓶摇瓶 种子罐种子罐发罐酵。发罐酵。 2.注意事项注意事项 放线菌：放线菌：3点点 A.斜面要合格：斜面要合格： 40时摆斜面，防冷凝水过多；

7、时摆斜面，防冷凝水过多；28培养培养34d，无，无杂菌则杂菌则5保存备用，保存时间不超过保存备用，保存时间不超过1月。月。 B.沙土管接斜石：沙土管接斜石： 绝对要求采用绝对要求采用“干接法干接法”，严防将水带入沙土管。，严防将水带入沙土管。 用干法取适量沙土孢子，均匀散布于空白斜面上，用干法取适量沙土孢子，均匀散布于空白斜面上，长出之菌落均匀分布，密度适宜。沙土管用后，立长出之菌落均匀分布，密度适宜。沙土管用后，立即冷藏保存。即冷藏保存。 C.斜面传代：斜面传代： 勿超过勿超过3代，以防衰退变异。代，以防衰退变异。霉菌斜面霉菌斜面A.菌种活化：菌种活化：使母斜面上的菌落尽量使母斜面上的菌落尽

8、量分散分散，以挑到单，以挑到单个菌落，便于接到子斜面上；个菌落，便于接到子斜面上；B.接种：接种：应挑落菌应挑落菌中央丰满中央丰满部分的孢子；部分的孢子；C.保藏：保藏：孢子或熟后移入孢子或熟后移入5冰箱备用；或冰箱备用；或“真空抽干真空抽干”至至含水含水10%保存。干燥孢子菌种在生产上可连续使保存。干燥孢子菌种在生产上可连续使用半年，对稳定生产有利。抽干适合用半年，对稳定生产有利。抽干适合保存孢子保存孢子，纯，纯菌菌丝丝用此法易引起用此法易引起死亡死亡。细菌斜面细菌斜面 对传代要求不严格。对传代要求不严格。3.3.影响孢子质量的因素影响孢子质量的因素培养基原料培养基原料 如琼脂，牌号异，其中

9、的无机离子不同，如琼脂，牌号异，其中的无机离子不同，孢子质孢子质量。量。选同牌号琼脂。选同牌号琼脂。培养条件培养条件 A.温度：温度：对斜面孢子的质量影响很大。对斜面孢子的质量影响很大。温度略低，有利于孢子形成和孢子质量提高；温度略低，有利于孢子形成和孢子质量提高；高温相反。高温相反。实例，龟裂链霉菌为土霉素产生菌。斜面孢子制备实例，龟裂链霉菌为土霉素产生菌。斜面孢子制备时，时，36.537适宜，适宜，t37，孢子成熟早，易老，孢子成熟早，易老化，接入发酵罐，菌丝对糖、化，接入发酵罐，菌丝对糖、N利用减慢，氨基利用减慢，氨基N提前提前回升，效价降低。回升，效价降低。变温培养：产孢量上升：变温培

10、养：产孢量上升：采用变温培养程序：采用变温培养程序：36.53d 28.51d产孢量可达恒温（产孢量可达恒温（36.54d）培养的）培养的37倍倍： B.空气湿度：空气湿度： 孢子数孢子数湿度（湿度（%），相对湿度），相对湿度=45%50%，产孢量高。原因？产孢量高。原因？ 斜面孢子培养，适宜的相对湿度：斜面孢子培养，适宜的相对湿度：北方北方40%45%，南方，南方35%42%。此湿度下，孢。此湿度下，孢子数量适中，成熟较快，外观好；进发酵罐后，发子数量适中，成熟较快，外观好；进发酵罐后，发芽早、糖芽早、糖N代谢快。代谢快。 增加培养箱湿度的措施增加培养箱湿度的措施：加入：加入盛水平皿盛水平皿

11、。相对湿度（相对湿度（% %）16.516.5191925 25 363640 40 4545活孢子（亿活孢子（亿/ /支）支） 1.21.22.32.35.75.7.冷藏时间冷藏时间 斜面孢子冷藏时间对菌种质量影响大；冷藏影响随斜面孢子冷藏时间对菌种质量影响大；冷藏影响随菌种而异。菌种而异。 原则：宜短不宜长（原则：宜短不宜长（7d）。）。成熟成熟孢子斜面孢子斜面耐冷藏耐冷藏，但时间过长时菌种特性亦会衰退。但时间过长时菌种特性亦会衰退。 实例：土霉素菌种，实例：土霉素菌种，培养培养4.5d，孢子未完全成熟：冷藏，孢子未完全成熟：冷藏7-8d，菌丝自溶，菌丝自溶培养培养5d，孢子成熟：冷藏，孢

12、子成熟：冷藏20d亦不自溶。亦不自溶。结论结论：成熟成熟后后再冷藏再冷藏。孢子龄及孢子量孢子龄及孢子量 A. 幼龄不耐冷藏幼龄不耐冷藏：耐冷藏能力与孢子龄有关。：耐冷藏能力与孢子龄有关。B.孢龄过长：孢龄过长：活力下降，生产力下降。活力下降，生产力下降。孢龄最佳：数量多、成熟完全、发酵单位正常。孢龄最佳：数量多、成熟完全、发酵单位正常。.孢子接入量孢子接入量 液体培养中，孢子量影响菌丝球大小：液体培养中，孢子量影响菌丝球大小：A.接入孢子少：接入孢子少：接入发酵罐后长出的菌丝球大而少，接入发酵罐后长出的菌丝球大而少，菌丝球内菌丝球内O2供应和养分传递差，青霉素产量低；供应和养分传递差，青霉素产

13、量低；B.接入孢子数多：接入孢子数多：接入发酵罐后长出的菌丝球体小接入发酵罐后长出的菌丝球体小而多，菌丝球内而多，菌丝球内O2供应和养分传递好，球状孢子数量供应和养分传递好，球状孢子数量适宜，青霉素产量高。适宜，青霉素产量高。4.4.斜面孢子质量指标斜面孢子质量指标 A.菌丝形态：色泽；密度；孢子量；色素分泌等；菌丝形态：色泽；密度；孢子量；色素分泌等；B.发芽率：高发芽率：高C.变异率：低变异率：低D.污染菌：低污染菌：低E.发酵单位：高发酵单位：高（二）摇瓶种子培养（二）摇瓶种子培养1.1.目的目的 菌丝体菌丝体制备：孢子萌发的过程在制备：孢子萌发的过程在摇瓶中摇瓶中完成。完成。检查斜面孢

14、子有无杂菌污染：检查斜面孢子有无杂菌污染： 摇瓶中易观察细菌污染摇瓶中易观察细菌污染2.2.摇瓶种子培养的必要性摇瓶种子培养的必要性 A.A.以孢子形式作发酵种子的优点以孢子形式作发酵种子的优点工艺路线短，易控制；斜面易保藏；一次可制备大量工艺路线短，易控制；斜面易保藏；一次可制备大量孢子；减少染菌、节约人、财、物力；保证生产稳定。孢子；减少染菌、节约人、财、物力；保证生产稳定。B.B.缺点缺点有些微生物孢子有些微生物孢子发芽慢发芽慢，菌丝繁殖难，发酵周期长，菌丝繁殖难，发酵周期长，种子罐培养周期长，所以，种子罐前必须加摇瓶培养。种子罐培养周期长，所以，种子罐前必须加摇瓶培养。摇瓶培养：两级：

15、母瓶摇瓶培养：两级：母瓶子瓶，两级瓶子均可直接进子瓶，两级瓶子均可直接进种子罐。种子罐。3.3.摇瓶种子培养的缺点摇瓶种子培养的缺点 工艺过程复杂，操作污染机会多。工艺过程复杂，操作污染机会多。4.4.摇瓶种子质量摇瓶种子质量外观颜色；菌丝浓度；发酵液粘度；效价；外观颜色；菌丝浓度；发酵液粘度；效价；pHpH及及糖氮代谢指标等；糖氮代谢指标等；有无混浊（细菌污染）！有无混浊（细菌污染）！5.5.工艺路线工艺路线 孢子孢子摇瓶培养摇瓶培养菌丝体菌丝体种子罐种子罐发酵罐发酵罐三三. .生产车间种子制备生产车间种子制备 摇瓶菌丝体摇瓶菌丝体种子罐种子罐培养培养1.定义定义将实验室制备的孢子或摇瓶菌丝

16、体种子移接到将实验室制备的孢子或摇瓶菌丝体种子移接到种种子罐扩大培养的过程。子罐扩大培养的过程。 要求：需供给足够的要求：需供给足够的“无菌空气无菌空气”； 不断搅拌，使菌丝体在培养液中均匀分布，不断搅拌，使菌丝体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。获得相同的培养条件。2.种子罐接种法种子罐接种法孢子悬液：孢子悬液：一般采用一般采用微孔注射微孔注射接种法接种；接种法接种；摇瓶菌丝体种子：摇瓶菌丝体种子：可在可在火焰保护火焰保护下接入种子罐或采用下接入种子罐或采用“压差法吸入压差法吸入”。种子罐之间或种子罐与发酵罐间的移种：种子罐之间或种子罐与发酵罐间的移种：主要采用主要采用压差法压差法。移

17、种时要防止接受罐压降过低，。移种时要防止接受罐压降过低，以防染菌。以防染菌。3.生产车间种子制备应注意的问题生产车间种子制备应注意的问题种子罐的级数要合理种子罐的级数要合理发酵级数：发酵级数：指制备种子需指制备种子需“逐级扩大培养的逐级扩大培养的次数次数”。级数愈少，愈易控制，污染少。级数愈少，愈易控制，污染少。发酵级数取决于发酵级数取决于3个因素个因素: A.菌种生长特性：菌种生长特性：生长快的细菌：生长快的细菌：种子用量少，种子罐级数少，多采种子用量少，种子罐级数少，多采用用2级级发酵（发酵（1个种子罐个种子罐+1个发酵罐）；个发酵罐）；生长慢的链霉菌等生长慢的链霉菌等：种子用量大，采用种

18、子用量大，采用3级级（2个种个种子罐子罐+1个发酵罐）发酵或个发酵罐）发酵或4级级发酵（发酵（3个种子罐个种子罐+1个个发酵罐）。发酵罐）。 B.孢子发芽率及菌体繁殖速度：快者少孢子发芽率及菌体繁殖速度：快者少 C. V2 / V1：大者多：大者多发酵罐容积（发酵罐容积（V2）及其与种子罐容积（）及其与种子罐容积（V1）比率）比率 种子级数愈少，工艺愈简单，控制易进行，接种污种子级数愈少，工艺愈简单，控制易进行，接种污染比率少。染比率少。 种龄要适宜种龄要适宜 种龄：种龄：种子罐中培养的菌丝体从种子罐中培养的菌丝体从接入开始到转入接入开始到转入下下一级种子罐或发酵罐所用的一级种子罐或发酵罐所用

19、的培养时间。培养时间。 即从入罐到出罐所需要的时间即从入罐到出罐所需要的时间= =种龄种龄 适宜的接种龄：适宜的接种龄：对数期细胞对数期细胞，活力旺盛。，活力旺盛。 接种量要适当接种量要适当取决于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。取决于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。生长繁殖快的菌种，接种少，否则，要多。生长繁殖快的菌种，接种少，否则，要多。抗生素发酵接种量：（抗生素发酵接种量：（7 71515 20202525）% %。大量接种的优点：大量接种的优点：A.A.缩短缩短发酵罐中菌丝生长达高峰所需发酵罐中菌丝生长达高峰所需时间，产物形时间，产物形成提前成提前： B.B.形成优势菌，抑制杂菌生长

20、：形成优势菌，抑制杂菌生长：大量接种的缺点：大量接种的缺点：菌丝生长过快，培养液粘度增加，溶菌丝生长过快，培养液粘度增加，溶O O2 2快速减少，快速减少，产物合成受阻。产物合成受阻。接种量大小需经试验确定。接种量大小需经试验确定。9.3 9.3 常见微生物发酵种子扩大培养方法常见微生物发酵种子扩大培养方法一一. .酵母发酵时的种子扩大培养酵母发酵时的种子扩大培养面包酵母工业生产：扩大级数多（面包酵母工业生产：扩大级数多（4 45 5级）。级）。1.1.菌种退化菌种退化 酵母活力衰减；杂菌污染酵母活力衰减；杂菌污染现象与处理：絮凝程度变化：絮凝物漂浮表面，并现象与处理：絮凝程度变化：絮凝物漂浮

21、表面，并有大量杂菌，弃去漂浮物，保留有大量杂菌，弃去漂浮物，保留下层细胞下层细胞供发酵用。供发酵用。2.2.下层细胞处理下层细胞处理 目的：目的：除去：除去：A.PrA.Pr；B.B.死细胞；死细胞；C.C.污染菌污染菌方法：方法：3 3洗，洗，酵母悬浮液酵母悬浮液pHpH调至调至2.5-3.02.5-3.0水洗水洗，（NHNH4 4）3 3POPO4 4溶液洗溶液洗抗生素洗抗生素洗（青霉素、多粘菌素等）（青霉素、多粘菌素等）级数级数培养条件培养条件培养时间（培养时间（h h）1 1活化菌种活化菌种4L4L摇瓶摇瓶1 1级培养物级培养物181824242 21 1级培养物级培养物250L250L发酵器发酵器6 63 32 2级培养物级培养物600L600L发酵器发酵器6 64 43 3级培养物级培养物12000L12000L发酵器发酵器6 6二二.细菌发酵种子扩大培养细菌发酵种子扩大培养“对数期对数期”活力活力强种子。强种子。实例：枯草杆菌生产实例：枯草杆菌生产“杆菌肽杆菌肽”时接种物扩大程序：时接种物扩大程序：三三.丝状真菌发酵时种子扩大培养丝状真菌发酵时种子扩大培养 1.能形成能形成“无性孢子无性孢子”的工业真菌的工业真菌 常用常用“孢子悬液孢子悬液” 接种。接种。 深层培养产生孢子方法：形成深层培养产生孢