动物生物化学实验技术（Word）

1、动物生物化学实验技术一、生物大分子的制备技术二、电泳技术三、层析技术四、基因重组技术与分子生物学鉴定技术一、生物大分子的制备技术l 1.材料的选择与预处理l 2.细胞的破碎l 3.提取l 4.分离纯化l 5.浓缩l 6.结晶l 7.干燥l 8.保存1.材料的选择与预处理l 选材的原则:l 含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低、注意动物的生理状态和微生物生长期之间的差异。l 预处理的方法：l 动物组织要先剔除结缔组织、脂肪组织等非活性部分，洗去血污等，微生物需将菌体和发酵液分离开。2.细胞的破碎l 1）机械法l 高速组织捣碎机、匀浆器、研磨器等l 2）物理法l 反复冻融法、冷热交替法、超声波处

2、理法、加压破碎法l 3）化学及生物化学法l 自溶法、溶菌酶法、表面活性剂（十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠）l 无论哪一种方法破碎细胞，均需在一定的稀盐溶液或缓冲溶液中进行3.提取1 / 31l 提取（抽提）：指制备物与细胞固体成分或其它结合成分的分离，是由固相转入液相或从细胞内生理状态转入外界特定溶液环境的过程l 1）水溶液提取l 2）有机溶剂提取1）水溶液提取l 球状蛋白质的提取一般以水溶液为主，以盐溶液及缓冲液提取蛋白质和酶时常需注意以下几个因素：l 盐浓度：常用等渗溶液，如0.02-0.05mol/L磷酸盐缓冲液、 l 0.15mol/L氯化钠溶液l pH值：保证蛋白质在稳

3、定的范围内，选择在偏离等电点的两l 侧，常为pH3-6。l 温度：0-5°Cl 其它：加入保护剂、底物、辅酶等2）有机溶剂提取l 一些与脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，常用有机溶剂提取，如丁醇提取法（pH3-10，-2 40°C）4.分离纯化l 分离纯化：在抽提的基础上，去除多种同类或异类物质的过程l 1）盐析法l 2）有机溶剂沉淀法l 3）等点沉淀法l 4）选择性变性法l 5）吸附法l 6）离心沉淀法l 7）透析法l 8）超滤法l 9）酶解法l 10）电泳法l 11）层析法1）盐析法l 原理：l 盐溶：由于少量离子的作用，减少了偶极溶质分子之间极性基团

4、的静电引力，增加了溶质和溶剂相互作用力的结果。l 盐析：由于盐浓度增加到一定程度，水的活度被降低，蛋白质表面的大量电荷被中和，水化膜被破坏，蛋白质分子相互聚集而沉淀析出。l 盐的选择：l 硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等2）有机溶剂沉淀法l 原理：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另一方面，由于溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，导致蛋白质沉淀析出。l 有机溶剂沉淀法的优缺点：l 优点：分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其它溶质只有在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内才会沉淀；沉淀不用脱盐，过滤比较容易；在生化制备中的应用比盐析法广。l 缺点：对某些具有

5、生物活性的大分子，容易引起变性失活，操作常在低温下进行，加入有机溶剂时注意搅拌以避免局部浓度过大。分离后的蛋白质沉淀，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度。3）等点沉淀法l 利用蛋白质在等电点溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离，常和盐析法、有机溶剂沉淀法一起使用。4）选择性变性法l 选择一定的条件使其它蛋白质沉淀而又不影响所需蛋白质的分离方法。如将提取液适当加热、用惰性液体氯仿震荡、利用酸碱或加入重金属离子等进行选择变性。5）吸附法l 吸附目的生物大分子或杂质，常在微酸性条件（pH5-6）及稀盐溶液中进行。l 洗脱时一般多在弱碱性条件或适当提高洗脱液离子强度，即可将被吸

6、附的生物大分子洗脱下来。吸附操作可用静态吸附，也可用柱层析吸附。l 常用的吸附剂：l 硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、聚苯乙烯、磷酸钙等。6）离心沉淀法l 离心：利用离心机，借助离心力分离液相非均一体系的过程，即进行固液相分离和不同比重或不同分子量大小的溶质与液体的过程。l 离心机的分类：l 低速（<0.4万r/min）、高速（0.4-1.5万r/min）和超速（1.5-5万r/min）l 大容量和小容量l 常温和低温使用离心机的注意事项l ：l 1.注意防潮、防止过冷和过热，尤其要注意防止腐蚀性试剂的污染l 2.使用前应先行检查离心机的安放是否水平和稳定，其次要检查对称位离心管、内容物和

7、套管是否平衡，即重量相差不得超过0.1克，离心管及套管中如有玻璃碎片等，应予及时清除。套管底部必须加以缓冲胶垫，以免离心时离心管破裂。l 3.离心时应检查转速器是否位于起点,经检查转速无误后打开开关。启动后速度应缓慢提高。离心完毕后，将转速器缓慢退至起点，关闭开关并任机器自行停转。注意切不可用手施加l 外力助停，以免沉淀泛起。l 4.使用完毕，及时清除机内水滴及污物7）透析法l 透析：透过薄膜除去或添加小分子溶质的过程。可用于生物大分子脱盐、浓缩及添加小分子溶质。l 透析袋：透析袋的膜孔有大有小，要根据欲分离的具体情况而选择。透析膜有动物性膜、火棉胶膜、硫酸纸膜、蛋白质胶膜等。目前常用的透析膜

8、是由纤维素类物质制成的。l 透析的操作：8）超滤法l 超滤：加压膜分离技术之一，以超滤膜为分离介质，通过对薄膜上的溶液加压过滤，使小分子物质通过，大分子物质则被截留。这种利用超滤膜分离大分子和小分子物质溶液的方法称为超滤。这一近年来发展起来的新方法最实用于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩和脱盐，并具有成本低、操作方便、条件温和、回收率高、能较好地保持生物大分子的生理活性等优点。超滤法还可用于生物大分子的分离纯化，是目前发展较快且为人们乐于采用的生化技术之一。l 超滤膜的特点：微孔过滤用的膜平均直径为50nm-14um，用于分离较大颗粒。加压超滤用的膜平均直径为1-10nm，用于分离大分子溶质。

9、反渗透作用用的膜平均孔径最小，一般在1nm以下，用于分离小分子溶质。超滤膜可截留不同分子量的溶质，常用的规格有1000、5000、10000、20000、30000、50000、100000等相对分子质量截留值。l 超滤器：工业用管式等超滤器、实验室用离心式超滤器9）酶解法l 酶解法的目的：l 1.通过酶的分解时杂质大分子变为小分子,从而和待精制的生化产品分离。l 2.通过酶解法制备小分子生化产品l 酶解法的优越性：l 1.酶的催化效率高,专一性强,不发生副反应。产率高，质量好，便于产品的提纯，简化工艺步骤。l 2.酶的作用条件温和。生产时要求设备简单。l 3.酶及其反应产物大多无毒，适合于生

10、化制药工业、食品工业应用。l 影响酶解的因素：l 1. 温度的影响。l 2. pH的影响。l 3. 酶的用量。l 4.激活剂或抑制剂的影响5.浓缩l 1）蒸发法l 薄膜蒸发浓缩、减压加温蒸发浓缩、空气流动蒸发浓缩l 2）冰冻法l 生物大分子溶液冰冻时，水分子结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中。l 3）吸收法l 通过吸收剂直接除去溶液中溶剂分子而使溶液浓缩的方法。实验室常用的吸收剂有聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖、凝胶等。l 4）超滤法6.结晶l 1）生物大分子结晶的条件l a.纯度:>50%l b.浓度:较高l c.pH值:近等电点处l d.温度:0-5 °Cl e.

11、晶种:加入微量的要结晶的蛋白质或酶；有时用玻璃棒轻轻刮擦器壁也可。l f.金属离子：l g.结晶时间：由几小时、几天、几月不等7.干燥l 1）真空干燥l 适用于不耐高温、易氧化物质的干燥与保存l 2）冷冻真空干燥l 冻干：一般先将干燥的液体冷至冰点以下变成固体，然后在低温低压下将溶剂升华变成气体而除去。产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的保存。l 3）喷雾干燥l 是一种快速干燥的方法，喷雾后，液体分散为液滴，直径通常只有1-120um大小，与热空气接触面大，水分蒸发很快。在100°C的热空气中，只需不到1秒的时间即可干燥。8.保存l 1）干态保存l 0-

12、4°C，内装干燥剂密封，几月至数年。l 2）液态保存l 需要较严格的防腐措施，保存时间不能太长。l a.样品不能太稀（>1mg/ml），必须浓缩至一定浓度后才能分装保存。样品太稀时容易引起生物大分子的变性。l b.一般需加入防腐剂和稳定剂l 常用防腐剂有：甲苯、氯仿、百里酚等l 稳定剂：蛋白质和酶常用蔗糖、甘油，其中酶也可加入底物或附酶以提高稳定性；核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸与氯化钠的标准缓冲液中。l c.低温保存: 0-4°C二、电泳技术l 电泳技术的原理：l 常用电泳技术：l 垂直电泳：蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳l 水平电泳：DNA琼脂糖凝胶电泳l 影响电泳

13、迁移率的因素：l 1.样品l 2.电场l 3.缓冲液l 4.支持介质l 5.其它影响电泳迁移率的因素：1.样品l 1）电荷l 2）大小l 3）形状2.电场l 1）电流l 2）电压l 3）电阻3.缓冲液l 1）成分l 甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、巴比妥盐、磷酸盐、Tris、EDTA、吡啶l 2）浓度l 缓冲液离子强度的增加，缓冲液承载的电流也随之增加，但样品的电动势却随之减少，因此降低了样品的迁移率。一般最适离子强度在0.02-0.2之间。l 3）pHl 生物大分子的迁移率由缓冲液的pH值决定，可根据分离的需要选用pH=111范围的缓冲液。两个电极槽中的缓冲液一般是相同的，用来饱和支持介质。但在凝

14、胶电泳中，缓冲液是支持介质的一部分，常使用一种与电极缓冲液不同的缓冲液。4.支持介质l 1.吸附: l 支持介质对样品分子的滞留作用，导致样品分子的拖尾，降低了样品分子的迁移率。l 2.电渗： l 由于支持介质在缓冲液中或多或少带有一定的电荷，导致与支持介质相接触的水溶液带有相反的电荷。在电泳时，液体相对支持介质呈现相对移动，称为电渗。在电泳时，颗粒泳动的表观速度是颗粒本身真实速度与电渗携带移动速度的加和。l 3.分子筛:l 这是凝胶电泳的一个特性。在凝胶电泳中，半刚性支持介质（凝胶）的分子筛特性不但有助于蛋白质和核酸在电泳迁移率方面的区别，而且有助于在大小、形态上也有所不同的生物大分子的分离

15、。琼脂、淀粉和聚丙烯酰胺凝胶的分子筛原理是，大分子的移动随凝胶交联度的增加，孔径的减少，而阻力逐渐增加，如果使用Sephadex型的凝胶则情况正好相反。电泳的一般技术l 一、装置l 1.电源装置l 2.电泳装置l 二、支持介质l 1.纸l 2.醋酸纤维素薄膜l 3.薄层l 4.凝胶l （1）琼脂l （2）聚丙烯酰胺l 三、操作过程l 1.支持介质的饱和l 2.加样l 3.样品的分离l 4.取出支持介质l 5.染色和物质的回收一、装置l 1.电源装置:l 稳定的直流电，0500伏特、0150毫安l 2.电泳装置：l 电极：常用白金电极l 缓冲液槽：有两个缓冲液槽，电泳时通过缓冲液饱和的支持介质相

16、连。二、支持介质l 1.纸：已落后、过时l 2.醋酸纤维素薄膜：l 吸附小、分辨率较高、分离较快，可用于临床研究，如血清蛋白的分析、免疫电泳、放射性核素应用的电泳。l 3.薄层：l 硅胶、氧化铝、纤维素均可在玻璃板上制成薄层用于电泳。l “指纹图谱”：对薄层，可在一个方向上电泳（薄层），然后在另一个方向上进行薄层（电泳）分离，应用此法分离鉴别蛋白质和核酸水解产物的方法。4.凝胶l 琼脂、聚丙烯酰胺等凝胶在使用前用缓冲液配制，这个过程常常较费时间。因为凝胶的吸附、电渗和由于扩散形成的区带弥散现象均很轻微，所以凝胶电泳不但用于制备，而且更多地用于分析。尤其是对于分离具有相同电荷、但质量相差很小的混

17、合物应用效果更好。l （1）琼脂l 琼脂糖是从琼脂中提取出来的，是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖结合的链状多糖,含硫酸根比琼脂少,因而分离效果明显提高。l 琼脂糖电泳具有以下优点：琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附极微；琼脂糖作为支持介质，均匀、区带整齐、分辨率高、重复性好；电泳速度快；透明而不吸收紫外线可以直接用紫外检测仪做定量测定；区带可染色，样品易回收，有利于制备。l 缓冲液的选用：pH=69，离子强度为0.020.05，常用缓冲夜有硼酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液、Tris缓冲液。l 琼脂糖电泳的主要应用：核酸电泳、免疫电泳、

18、同工酶电泳等。 （2）聚丙烯酰胺凝胶l 特点：l 可以随需要制备各种孔径的凝胶，制备的重复性好；可以在各种缓冲液中使用；分离时间短；吸附和电渗作用低；在280nm处不吸收紫外线，因此经分离的蛋白质可通过对波长的吸收来确定；在一定浓度范围内，对热稳定，无色透明，便于对分离物进行染色和观察，并可用扫描仪直接进行测定。l 凝胶的制备：l 单体：丙烯酰胺l 交联剂：甲叉双丙烯酰胺l 催化剂：引发剂：过硫酸铵，在形成中提供自由基，通过自由基 l 传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应。l 加速剂：四甲基乙二胺，加快引发剂释放自由基的速度l 凝胶孔径和用途：l 凝胶孔径由丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交l

19、 联剂的相对比例决定。孔径与丙烯酰胺的总浓度有关，l 总浓度约大，孔径相应变小，机械强度增加。l 含丙烯酰胺77.5%的凝胶，适用于分子量为1100万的生 l 物大分子。含丙烯酰胺1530%的凝胶，适用于分子量为1万以 l 下的生物大分子。 7.5%的凝胶应用最广，被称为“标准凝胶”。三、操作过程l 1）支持介质的饱和或凝胶的制备l 2）加样：微量加样器加样l 3）样品的分离：稳压稳流，110小时l 4）取出支持介质或凝胶l 5）染色和物质的回收l 常见的染色剂：l 氨基黑10B或考马斯亮蓝用于蛋白染色；l 苏丹黑用于脂蛋白染色；l 碘用于多聚糖染色；l 甲基氯-焦宁用于核酸染色，溴化乙锭用于

20、核酸荧光染色；l 甲苯胺蓝用于酸性粘多糖染色；l 酶可以用底物生成有色产物的方法染色；l 放射性化合物可用放射性自显影、放射性层析图谱扫描仪观察或用液体闪烁计数器测定放射性。三、层析技术l 层析技术：l 利用混合物中各组分在两相中分配系数不同而达到分离目的的一种生物化学实验技术。是分离生物大分子研究中必不可少的工具，是当前分离生化样品最有效的手段。不管是哪种层洗方法，其最基本的特征是具有一个固定相和一个流动相，各种物质得以分离的最基本原因就在于它们在这两个相中具有不同的分配系数。当两相作相对运动时，这些物质在两相间进行反复多次的分配，从而得到分离。l 分类：按动相-定相分：气相层析、液相层析l

21、 按实验技术分：柱层析、薄层层析l 按分离机制分：吸附层析、l 离子交换层析、l 凝胶过滤、l 亲 和层析常用的层析技术l 一、吸附层析l 二、凝胶过滤（分子筛层析）l 三、离子交换层析l 四、亲和层析一、吸附层析l 吸附层析的原理：l 当样品的组分被吸附剂（固定相）吸附后，用适当的洗脱液（流动相）冲洗，就能改变洗脱剂的吸附能力，使被洗脱组分解脱下来，随洗脱液向前移动。当这些洗脱下来的组分向前移动时，又将遇到新的吸附剂而再被吸附，然后又被后来的洗脱液洗脱下来。经过反复的吸附-脱吸附-再吸附-再脱吸附，样品组分就可不断向前移动。由于吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同，它们在洗脱液的冲洗下移动的速

22、度也不同，因而可逐渐得到分离。吸附剂与展层液或洗脱液l 吸附剂的要求：l 具有较大的吸附表面和一定的吸附能力；与展层液或洗脱液及样品中各组分不发生化学反应，在展层液或洗脱液中不溶解；吸附剂的颗粒应有一定粒度并且均匀一致。l 常见的吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺l 展层液或洗脱液的要求：l 被分离物质的极性：l 极性较大的化合物可从溶液中较强地被吸附剂吸附，需要极性较大的溶剂才能被置换。l 吸附剂的性能：l 分离极性小的物质，一般选用吸附活性较大的吸附剂，否则反之。l 流动相的极性：l 通常极性小的溶剂对被分离混合物中极性小的物质亲和力强，在层析中移动较快，从而与一些极性大的物质分离，反之亦然。l

23、 常见流动相极性递增的次序是：石油醚<环己烷<四氯化碳<苯<甲苯<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<水吸附柱层析法l 层析柱：在玻璃管的底部垫以尼龙网、 l 玻璃棉或烧结玻璃滤板等。l 装柱：填装一定量的吸附剂l 加样：在吸附剂的上面加样l 洗脱：l 收集：l 测定：吸附薄层层析法l 吸附薄层层析法是发展较快的一种微量、快速层析方法。吸附薄层层析是把吸附剂均匀地在玻璃板上铺成薄层，然后将样品加在薄层一端，在密闭的容器中用适当的溶剂展层，即可达到分离鉴定的目的。l 制板：吸附剂铺于玻璃板l 点样：几微克l 展层

24、：在被溶剂蒸汽饱和的密闭容器中进行。l 显色：在紫外灯下观察、自显颜色、加显色剂显色等l Rf值计算：l Rf =原点到样品斑点中心的垂直距离/原点到容积l 前沿的垂直距离二、凝胶过滤（分子筛层析）l 基本原理：l 利用网状结构的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。当大小不同的分子流经凝胶层析柱时，分子直径比凝胶的孔径大的分子不能进入凝胶颗粒的微孔中，只能经过凝胶颗粒之间的间隙，这样的分子随洗脱液一起移动，因而最先流出柱外。而分子直径比凝胶的孔径小的分子能进入凝胶颗粒的微孔中，迁移距离长，移动速度小于大分子，并于大分子相互分离。不同大小的分子被凝胶颗粒阻滞的速度不同，因而以不同

25、的速度流出。对于中等大小的分子，其迁移行为是既在凝胶颗粒内部移动又在凝胶颗粒之间移动，分子量大的在凝胶柱中全部迁移距离短先流出，分子量小的则后流出，因而得以分离。常见的分子筛层析支持物l 交联葡聚糖（Sephadex）l 聚丙烯酰胺（Bio-gel P）l 琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-gel A）l 琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶l 受控微孔玻璃球交联葡聚糖（Sephadex）柱层析的基本步骤l 用于物质的分离、脱盐、大分子溶液的浓缩，还可用于大分子物质的分子量测定l 1.凝胶颗粒的溶胀:l 凝胶颗粒浸泡在洗脱液中，除去飘浮在表面的细碎颗粒。l 2.层析柱的准备:l 从大分子（MW>

26、20000）中分离小分子，如无机盐或代谢中间物（MW<1500）时，柱床体积应是上样体积的410倍，柱高：柱直径应为5：115：1，这类柱称为脱盐柱。相反，分离生物大分子时，柱床体积应是上样体积的25100倍，柱高：柱直径应为20：1100：1。l 3.上样和洗脱：l 上样量： 1025%（脱盐）、15%（分离生物大分子）l 洗脱液：离子强度大于0.08l 4.凝胶的再生:l 层析柱可反复使用数十次，如层析柱受到污染，则可用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl的混合液进行处理。三、离子交换层析l 离子交换层析：离子交换是指液相中的离子与固相上的活性基团离子之间的可逆交换反应

27、。将要分离的混合样品先在一定pH值条件下全部解离，然后流过固定相使与固定相上的离子进行交换并吸附于固定相上，在根据混合样品中各组分解离度的差别，用不同pH值和不同离子强度的缓冲液分别洗脱，从而达到分离混合样品中各组分的目的。这种利用离子交换反应分离物质的方法称为离子交换层析。离子交换剂l 交换剂母体：l 人工合成的树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖，l 阳离子交换剂：强酸型阳离子交换剂：-SO3Hl 中强酸型阳离子交换剂：-PO3H2l 弱酸型阳离子交换剂：-COOH、-OHl 带正电荷的蛋白质和核酸常用在纤维素上引入羧甲基（-O-CH2- l COO-）的阳离子交换剂l 阴离子交换剂：强碱型：-N

28、+（CH3）3OHl 弱碱型：-N（CH3）2、-NHCH3、-NH2l 带正电荷的蛋白质和核酸在纤维素上引入二乙基氨基乙基（-O-CH2- l CH2- NH （CH2 CH3 ）2的阴离子交换剂离子交换层析的基本操作过程l 1.交换剂的选择:l 被分离的物质是阳离子应选用阳离子交换剂,否则反之。l 2.交换剂的处理、转型和再生l 蒸馏水浸透使之充分吸水溶胀，酸碱处理，在用无离子水洗至中性；转型是使交换树脂带上所要求的离子，如需将阳离子交换剂转为Na+型，则用NaOH处理，如需NH4+，则用NH4Cl处理，最后都要用无离子水洗至中性，再用缓冲液平衡。所谓平衡就是通过洗涤，使流出液与所需pH值

29、和离子强度相同。用过的交换剂，经处理后可继续使用，此处理过程称为再生，一般是用酸和碱分别浸泡，再用水洗至中性。 l 3.装柱：l 装好的柱要求无气泡、无分节、柱床表面平坦，装好的柱床表面要保持一层溶液。l 4.样品上柱：l 阶段洗脱：用几种不同离子强度和pH值的洗脱液依次相继洗脱。l 梯度洗脱：采用梯度混和器，使洗脱液的离子强度和pH值发生逐渐的变化，分离效果较好。l 5.洗脱四、亲和层析l 利用由高度生物特异性及亲和力引起的生物大分子与小分子之间的结合平衡而建立起来的分离生物大分子的层析方法。这种特异可逆结合（配体与受体）的物质很多，如抗原与抗体、底物与酶、激素与受体等。l 将配体固定在固相

30、载体上，并且将其装在层析柱中，当样品通过层析柱时，由于配体和相对应的生物大分子有专一的亲和作用，将生物大分子吸附于柱中，样品中的其它组分不产生这种专一性的结合，而直接流出层析柱。然后，便可以利用洗脱剂将吸附于柱中的生物大分子洗脱下来。l 亲和层析具有高度的专一性，而且层析过程简单快速，是一种理想的有效分离纯化生物大分子的手段。 亲和层析的基本步骤l 1.固相载体的选择:l 如琼脂糖Sepharose-4B等 l 2.配体的选择:l 与生物大分子之间有合适的亲和力，配体有双重功能，即和载体及生物大分子都能结合。l 3.配体与载体的偶联：l 偶联剂：溴化氰、环氧乙烷等l 4.使用方法l 吸附、洗脱

31、四、基因重组技术与分子生物学鉴定技术l 一、多聚酶链式反应(PCR)l 二、DNA核苷酸顺序测定 三、DNA重组技术 四、转基因技术 五、体细胞克隆技术 六、DNA指纹技术 七、蛋白质工程一、多聚酶链式反应(PCR) 多聚酶链式反应（PCR，Polymerase chain reaction），是20世纪80年代末发展起来的一种快速的DNA特定片段体外合成扩增的方法。 PCR反应的步骤在微量离心管中,加入适量的缓冲液，微量的模板DNA，人工合成的两个DNA引物，四种脱氧单核苷酸(dNTP)，一种耐热的多聚酶和Mg2+。将上述溶液加热，使模板DNA在高温下(如95)变性，双链解开为两条单链；然后

32、降低反应温度，使两条引物在低温下(37)分别与两条模板互补退火，形成局部双链；再升高反应温度至中温(72)，此时多聚酶以dNTP为原料，以两引物为复制的起点，在两条模板上合成新的DNA子链。如此重复改变反应温度，即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段。 PCR反应的结果 以三次改变温度为一个循环，每一次循环就使欲扩增的DNA区段的拷贝数放大一倍，即第一次循环，每条模板双链DNA变为2条；第二次循环，则变为4条；第三次循环，变成8条以几何级数扩增下去。一般样品经30次循环最终使特定DNA片段放大了数百万倍。 退火 在高温变性的DNA逐渐降低温度，复性为双链DNA的过程。 PCR的特点 (1)对D

33、NA模板要求不高，纯度要求不严，用量很低，DNA分子量的长度仅为几百个bp，只要含有未损伤的需要扩增的片段即可。 (2)引物设计十分重要，它决定了PCR扩增片段的大小及特异性。引物的设计是按需要及引物设计原则进行的。现在已有DNA合成仪，设计好的引物能很快合成。(3)需要一个耐热的DNA聚合酶。发现了TaqDNA聚合酶，PCR才进入实用阶段。PCR技术现已成为分子生物学、医学、生物工程、法医学及考古学等领域不可缺少的工具。 TaqDNA聚合酶 1988年Saiki开始用Cetus公司从水生栖热菌YT-1(Thermus aquaticus Strain YT-1)中获得的耐热聚合酶(称为Taq

34、DNA Polymerase)进行PCP扩增，从此PCR才进入实用阶段。Taq聚合酶在DNA变性温度(95)时不变性，聚合方向为53，需要Mg2+，最适温度为75-80。PCR技术的应用 PCR技术可以广泛应用于科研和实际检测中，用于DNA研究、序列分析、测定基因表达，从cDNA可放大特定克隆、构建基因图、进化分析、生物证据分析和医学研究与临床检验等。PCR反应示意图二、DNA核苷酸顺序测定 DNA顺序测定技术有A.Maxam和W.Gilbert提出的化学裂解法和1978年F.Sanger提出的双脱氧核苷酸末端终止法。以Sanger法最适用。 Sanger法 Sanger法从引物的3-端开始能

35、合成约300个核苷酸的排列顺序。是现今分子生物学中最重要的手段之一。 Sanger法的程序 Sanger法最突出的特点是在反应中加入一种2，3-二脱氧核苷三磷酸(ddNTP), 整个测定的程序如下：将被测DNA制成单链模板。分别加入4个反应管中。并在每个管中加入引物、DNA聚合酶和4种dNTP(其中一种为32P标记)。然后在4个管中分别加入ddTTP、ddCTP、ddGTP和ddATP。然后进行保温反应。由于双脱氧的ddNTP比正常的dNTP少了3-羟基，当它在DNA聚合酶作用下掺入到正在延伸的DNA链时，因ddNTP不含3-羟基，于是就阻止了其它dNTP的继续掺入，起了特异性终止剂的作用。2

36、，3-二脱氧核苷三磷酸结构图Sanger法的结果分析 反应结束后在4个管中分别形成一些全部具有相同5-引物端、和分别以ddT、ddC、ddG、ddA 残基为3-端结尾的一系列长短不一的混合物。每种混合物经变性聚丙烯酰胺电泳分离及放射自显影，可见4种混合物形成不同的电泳迁移条带。每一条带都代表着一段以ddNTP终止的片段。只要按照电泳条带出现的先后次序即可读出被测DNA的顺序。Sanger法的结果分析图三、DNA重组技术 DNA重组技术是按生物科学规律及人为设计，实现体外基因改造，最后使生物的遗传性状获得改变，故称为“遗传工程”(genetic engineering)。 （一）DNA重组技术的

37、基础 （二）DNA重组技术的基本过程 （三）DNA重组技术的意义DNA重组技术定义 DNA重组技术是运用多种限制性内切酶和DNA连接酶等，在细胞外将一种外源基因DNA(来自原核或真核生物)和载体DNA重新组合连接(重组)，形成杂交DNA。最后将杂交DNA转入宿主生物(如大肠杆菌)。使外源基因DNA在宿主生物细胞中，随着生物细胞的繁殖而增殖，或最后得到表达。最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。DNA重组技术别称 其本质是基因的体外重组，所以又称“基因工程”(gene engineering)或“DNA重组技术”(recombinant DNA techniques)、分子克隆(mole

38、cular cloning)等。（一）DNA重组技术的基础 DNA重组技术出现不是偶然的，它是许多技术方法发展的结果。 1.核酸的制备 2.限制性内切酶 3.分子杂交 4.载体 5.宿主细胞1.核酸的制备 现在已经能从动、植物组织、细菌及病毒中制得比较完整的DNA分子了。 RNA的分子比DNA小，极易遭到核糖核酸酶(RNase)的降解。RNase很稳定，具有惊人的活力，加热到蛋白质变性的温度(90)其活力也不完全丧失。RNase分布极广，不但存在于细胞内也分布在环境中，包括实验器皿上，如不小心制得的RNA也易被降解。近年来经过技术改进，已经能制得各种RNA，尤其是mRNA。2.限制性内切酶 所

39、谓DNA重组即是在实验室将两种DNA分子经过切割，选择适合的片段连接起来的过程。实现这一步，是在限制性内切酶发现以后才实现的。50年代有人在实验中曾经发现同一种噬菌体分别与两种细菌培养，噬菌体只在一种细菌中成活，而在另一种中绝大多数不能成活，表明这个菌株对入侵的噬菌体具有限制性作用。限制修饰系统 1962年Arber等人经过多次实验终于证明：细菌中存在有两种酶，一种是限制性内切酶，可以将外源DNA切割降解；另一种是修饰酶也称甲基化酶，能使DNA中的核苷酸甲基化，使之不受限制性酶的降解。两种酶可对同一DNA序列作用。细菌借助这两种酶，将自身的DNA进行甲基化修饰使之不受限制性酶的降解，而对外来的

40、、末甲基化的DNA则进行降解，以保证细菌自身的DNA不受外来DNA的干扰，保持其遗传性状的稳定性。这两种酶称限制修饰系统(restriction-modification system)。限制性内切酶 一类核酸内切酶，可以将外源DNA在特定位点切割降解 。以后从细菌中分别分离出了I型和型两类限制性内切酶。 I型限制性内切酶 I型能识别DNA分子内非甲基化的特定序列，但切割是随机的，且切割位点远离识别位点，不能生成特定片段。型限制性内切酶 型是1970年Smith第一次从流感嗜血杆菌中分离到的。它能识别双链DNA分子中特定的序列，大部分具有双重交替式的对称点，即从5到3方向读这段DNA的单链碱基

41、，发现两条互补链的碱基是相同的。 型限制性内切酶识别的DNA序列一般长度是4、5和6个碱基对。EcoRI的识别序列 限制性内切酶切割DNA的方式 a.从识别序列的中间切开b.在识别序列对称轴的左右两方进行切割 c.在识别序列对称轴的右边(5-3链)和对称轴左边(3-5链)切开 a.从识别序列的中间切开从识别序列的中间切开产生平齐末端(blunt ends), 如Hae b.在识别序列对称轴的左右两方进行切割 即分别在5-3链和3-5链对称轴的左右方切开 ，形成带有凸出的5磷酸基团的粘性末端(Cohesive ends)，如EcoR c.在识别序列对称轴的右边(5-3链)和对称轴左边(3-5链)

42、切开形成带有凸出的3羟基的粘性末端，如pstI平齐末端 有些限制性内切酶在识别序列的中间切开，产生没有未互补碱基的末端称为平齐末端。 平齐末端需要另一DNA片段也修饰成平齐末端方可连接。 粘性末端 有些限制性内切酶在识别序列对称轴的左右两方进行切割，形成带有凸出的5-磷酸基团的单链部分，称为粘性末端。 粘性末端可与用同一个酶切割的DNA片段退火连接。粘性末端法连接DNA分子限制性内切酶的命名 用细菌同名的第一个字母(大写)和种名的前两个字母(小写)构成酶的基本名称。若酶是从其中一种特殊菌株来，还在基本名称后加上菌株名称符号。名称后的罗马数字，表示在该特殊菌株中发现此酶的先后次序。如HaeII是

43、从(Haemophilus aegypticus)中提取的，并且是从中发现的第二个酶。3.分子杂交 经限制性内切酶切割的DNA片段可以通过凝胶电泳分开并显示，很容易检测出DNA片段的存在和大小。用聚丙烯酰胺凝胶可分离1000碱基对(bp)以下的片段。用多孔的琼脂糖凝胶可分离20kb的片段。这些凝胶的分辨率很高，某些胶可从长为几百个核苷酸的片段中分辨出一个核苷酸的差异。 含有特定碱基顺序的DNA的鉴定 含有特定碱基顺序的DNA的限制性酶切割片段，可以进行分子杂交鉴定。即用另一标记的与之互补的DNA链作探针进行杂交鉴定。如Southern杂交(Southern印迹法) 、Northern杂交、 w

44、estern blot。 Southern杂交 它是由E.M.Southern发明的。它是将混合在一起的限制性酶切DNA片段，用琼脂糖电泳分开，并变性为单链DNA，再转移到一张硝酸纤维素膜上。在膜上的这些DNA片段可以用P32标记的单链DNA探针杂交。再用放射自显影方法显示出与探针顺序互补的限制性酶切DNA片段的位置。用这个方法能很容易地将上百万片段中间的一个特殊片段鉴定出来，像从一堆干草中寻找出一颗针一样，十分灵敏有效。Southern杂交示意图Northern杂交 用凝胶电泳分离RNA，将特殊片段转移到硝酸纤维素膜上，之后用杂交法来鉴定它，此法称为Northern杂交或称Northern印

45、迹法。Western blot Western blot(western印迹法)是用化学免疫法鉴定蛋白质的技术。它是用特殊的抗体与对应的蛋白质(抗原)结合染色。这项技术是鉴定基因表达产物所不可缺少的。原位杂交 即将长在培养皿上的菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上用标记探针进行分子杂交。这些检测手段都是DNA重组技术所不可缺少的。4.载体 能将外源基因DNA带入宿主细胞并能复制或最终使外源基因DNA表达的自主DNA，称为载体(vector)。用得最广泛的载体是大肠杆菌的质粒(plasmid)。质粒 质粒是一种环状双链的DNA分子。自身在细菌细胞中能不断复制繁殖，有些质粒当细菌停止繁殖时，自身还能复

46、制扩增，称为复制松弛型控制(relaxed control)；有的随着细菌停止繁殖，复制也停止，称为严紧型控制(stringent control)。研究比较深入的质粒有大肠杆菌的性因子(F因子)、大肠杆菌素因子和抗药因子等。抗药因子 抗药因子(质粒)在其DNA上编码有某些酶的基因，表达产生的酶对链霉素、氯霉素、磺胺、青霉素、四环素、卡那霉素等药物能产生生物化学修饰，使之钝化而失效。质粒的作用 质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌。这个过程称转化。转入的质粒DNA仍能进行复制，这种性能为DNA重组技术提供了重要的条件，即将一种外源基因与质粒重组后，再转入细菌中去复制繁殖，使外源基因得以增

47、殖。质粒自身的某些抗药基因成为从转化的细菌中筛选它们的一种标记。除质粒外，噬菌体、病毒也能通过“感染”将外源基因带入细菌并进行复制。 目前所使用的质粒 目前实验中所使用的质粒、噬菌体和病毒载体种类很多。但都是经过了人工改造，更适宜运用于DNA重组技术。它们既保留了转化和感染活细胞的能力，又具有多处携带外源DNA的酶切位点，并含有特殊的筛选标记。这些载体中有些只能复制扩增带入的外源基因；有些可以使外源基因复制、转录和翻译出基因的蛋白质产物，这种载体称为表达载体。5.宿主细胞 DNA重组技术最终的目的是要使外源基因得以增殖和表达，而增殖和表达必须借助于活细胞内的酶，底物及各种因子才能实现。宿主细胞

48、是重组技术不可缺少的条件。 质粒是运用最早的载体，转化的宿主细胞是细菌，因此细菌(大肠杆菌E.Coli)是实现DNA重组技术的第一个宿主生物体。目前所使用的大肠杆菌宿主细胞都是缺陷性的。缺陷性 大肠杆菌由于存在于人体及其环境之中，无所不在。DNA重组技术发展之初，人们害怕在无意间会将癌基因等有害基因重组于载体。重组体转入大肠杆菌后，癌基因会随着大肠杆菌的四处传染，导致其严重后果。鉴于这种潜在性危险，世界各国曾制定了各种准则和严格规定，以防范危害人类事件的发生。以后，由于科学工作者的努力，对所使用的大肠杆菌作了改造，使之缺陷某些必需因子，这样细菌只有在实验条件下满足缺陷因子才会生长繁殖，其它环境

49、难以存括。 重组DNA的宿主细胞 现在除大肠杆菌外，酵母、真菌及各种真核细胞、受精卵细胞都成为重组DNA的宿主细胞。(二)DNA重组技术的基本过程 (1)选择人们所期望的外源基因(称为目的基因)； (2)将目的基因与适合的载体DNA(如质粒)在体外进行重组、获得重组体(杂交DNA)； (3)将重组体转入合适的生物活细胞，使目的基因复制扩增或转录、翻译表达出目的基因编码的蛋白质； (4)从细胞中分离出基因表达产物或获得一个具有新遗传性状的个体 。重组技术DNA分子克隆DNA重组的发展过程 人类第一例DNA重组是70年代初， S.N.Cohen将一种细菌抗四环素的质粒DNA与另一种细菌抗卡那霉素的

50、质粒DNA进行体外重组，杂交DNA再转入大肠杆菌，结果细菌表达出了双亲DNA的遗传信息，即同时抗四环素和抗卡那霉素，说明外源基因得到了表达。现在人、猪、牛的生长激素、胰岛素、干扰素等许多具有生物学功能的蛋白质，已经通过DNA重组技术由细菌等生物来生产，满足人类的需要。 DNA重组技术的具体步骤1. 目的基因的获得2重组3转化1.目的基因的获得 目前普遍采取三种方法。 (1)以mRNA为模板，用反转录酶合成DNA。 (2)构建基因文库 (3)人工合成基因(1)以mRNA为模板，用反转录酶合成DNA 以mRNA为模板，用反转录酶合成DNA。关键是要预先获得目的基因的mRNA。(2)构建基因文库 生物(包括动物)细胞染色体DNA分子上编码了生物的全部基因，但每个基因在DNA上的确切位置是不知道的。要想从中找到所需要的目的基因，是先将DNA从细胞中尽量完整地提取出来