生物化学0氨基酸与蛋白质

1、.o 结构域是球状蛋白的折叠单位结构域是球状蛋白的折叠单位 较小的蛋白质分子或亚基往往是单结构域的。较小的蛋白质分子或亚基往往是单结构域的。 结构域一般有氨基酸残基。结构域一般有氨基酸残基。 结构域之间常常有一段柔性的肽段相连，形成所谓的铰链区，结构域之间常常有一段柔性的肽段相连，形成所谓的铰链区，使结构域之间可以发生相对移动。使结构域之间可以发生相对移动。 结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用，可体结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用，可体现出蛋白质的总体功能。现出蛋白质的总体功能。 例：例：脱氢酶类的多肽主链有两个结构域，一个为NAD+结合结构域，一个是起催化作用的结构

2、域，两者组合成脱氢酶的脱氢功能区。 结构域间的裂缝，常是酶的活性部位，也是反应物的出入口结构域间的裂缝，常是酶的活性部位，也是反应物的出入口.整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上盘旋、折叠，形成的特定的整个空域的基础上盘旋、折叠，形成的特定的整个空间结构。间结构。三级结构是多肽链中所有原子的空间排布。三级结构是多肽链中所有原子的空间排布。. 大的球形蛋白大的球形蛋白(200(200氨基酸以上氨基酸以上) )，常常含有几个，常常含有几个结构域。结构域。 许多在一级结构上相差很远的氨基酸碱基在许多在一级结构上相差很远的氨基酸碱基在三级结构上相距很近

3、。三级结构上相距很近。 球形蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子球形蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子从球形蛋白的核心中被排出，这使得极性基团间从球形蛋白的核心中被排出，这使得极性基团间以及非极性基团间的相互用成为可能。以及非极性基团间的相互用成为可能。.主要的是二硫键，二硫键不指导多肽链的折叠，三级结构形成后，二硫键可稳定此构象。氢键氢键范德华力范德华力分子间及基团间作用力分子间及基团间作用力定向效应： 极性基团间诱导效应： 极性与非极性基团间分散效应： 非极性基团间疏水相互作用疏水相互作用离子键离子键盐键盐键共价健共价健.5、表面常常有空穴，配体结合部位（活性中心）1、含有丰富的二级结构

4、元件2、具有明显的折叠层次3、分子呈现球状或椭球状4、疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在外表. 有些对称的寡聚蛋白是由两个或多个不对称的等同有些对称的寡聚蛋白是由两个或多个不对称的等同结构成分组成，这种等同的结构成分称为结构成分组成，这种等同的结构成分称为。 如血红蛋白如血红蛋白2222就是由两个原体就是由两个原体组成。组成。有时也把原体称为单体。有时也把原体称为单体。 四级结构的蛋白质中每一个球状蛋白质称为四级结构的蛋白质中每一个球状蛋白质称为（或（或），亚基一般由一条多肽链组成。），亚基一般由一条多肽链组成。只有一个亚基的蛋白质称为只有一个亚基的蛋白质称为。.亚基间相互作用的表面是不同

5、的，形成亚基间相互作用的表面是不同的，形成线形或螺旋形的高聚物，如微管，病毒线形或螺旋形的高聚物，如微管，病毒外壳。外壳。1、同多聚与杂多聚、同多聚与杂多聚（homomultimeric and heteromultimeric)2、同种缔合与异种缔合（、同种缔合与异种缔合（isologus and heterologus)亚基间相互作用的表面是相同的，形成的亚基间相互作用的表面是相同的，形成的结构是对称的。结构是对称的。.1 1、降低比表面积，增加蛋白质的稳定性、降低比表面积，增加蛋白质的稳定性2 2、丰富蛋白质的结构，以行使更复杂的功能。、丰富蛋白质的结构，以行使更复杂的功能。3 3、提高

6、基因编码的效率和经济性。、提高基因编码的效率和经济性。4 4、使酶的催化基团汇集，提高催化效率。、使酶的催化基团汇集，提高催化效率。5 5、形成一定的几何形状，如细菌鞭毛。、形成一定的几何形状，如细菌鞭毛。6 6、适当降低溶液渗透压。、适当降低溶液渗透压。7 7、具协同效应和别构效应，实现对酶活性的调节、具协同效应和别构效应，实现对酶活性的调节.别构蛋白的别构部位与效应物的结合改变了蛋白质的构象，从而对活性部位产生的影响。 除了有活性部位（结合底物）外，还有别构部位（结合调节物）。有时活性部位和别构部位分属不同的亚基（活性亚基和调节亚基），活性部位之间以及活性部位和调节部位之间通过蛋白质构象的

7、变化而相互作用。.就是别构效应，别构部就是别构效应，别构部位与效应物的结合对活位与效应物的结合对活性部位的影响性部位的影响 同位效应一般是指活性部位之间的效应。同位效应一般是指活性部位之间的效应。同位效应是别构效应的基础，别构效应同位效应是别构效应的基础，别构效应可以看成是对同位效应的一种修饰可以看成是对同位效应的一种修饰.一种配基的结合促进后续配一种配基的结合促进后续配基的结合，基的结合，S S型配体结合曲线。型配体结合曲线。一种配基的结合抑制促进后续一种配基的结合抑制促进后续配基的结合。配基的结合。促进活性部位与配基结合的别促进活性部位与配基结合的别构效应物。构效应物。抑制活性部位与配基结

8、合的别抑制活性部位与配基结合的别构效应物。构效应物。.8段直的段直的-螺旋组成，分别命名为螺旋组成，分别命名为A、B、CH，拐弯处是由拐弯处是由18个氨基酸组成的松散肽段（无规卷曲）。个氨基酸组成的松散肽段（无规卷曲）。4个个Pro残基各自处在一个拐弯处，另外残基各自处在一个拐弯处，另外4个是个是Ser、Thr、Asn、Ile。 血红素辅基血红素辅基 ，扁平状，结合在肌红蛋白表面的一个洞穴内。，扁平状，结合在肌红蛋白表面的一个洞穴内。是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质。是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质。由一条多肽链（珠蛋白）和一个血红素辅基组成。由一条多肽链（珠蛋白）和一个血红素辅基组成。球状分子，单结

9、构域。球状分子，单结构域。.His93His64.p255.在血液中结合并转运O2.接近于球体，接近于球体，4 4个亚基分别在四面体的四个角上，个亚基分别在四面体的四个角上，每个亚基上有一个血红素辅基。每个亚基上有一个血红素辅基。 、 链的三级结构与肌红蛋白的很相似。链的三级结构与肌红蛋白的很相似。成人：成人： HbAHbA： 2 2 2 2 98% 98% ， HbAHbA2 2： 2 2 2 2 2% 2% 胎儿：胎儿： HbF HbF 2 2 2 2早期胚胎：早期胚胎： 2 2 2 2.增加增加COCO2 2的浓度、降低的浓度、降低pHpH能显能显著提高血红蛋白亚基间的协同著提高血红蛋白

10、亚基间的协同效应，降低血红蛋白对效应，降低血红蛋白对O O2 2的亲的亲和力，促进和力，促进O O2 2的释放，反之，的释放，反之，高浓度的高浓度的O O2 2也能促使血红蛋白也能促使血红蛋白释放释放H+ H+ 和和COCO2 2 。血红蛋白上有血红蛋白上有COCO2 2和和BPGBPG结合部位，因此，血红蛋结合部位，因此，血红蛋白还能运输白还能运输COCO2 2 。波耳效应.BPG是血红蛋白的负效应物。BPG（2,3-二磷酸甘油酸）通过与它的两个亚基形成盐键稳定了血红蛋白的脱氧态的构象，因而降低脱氧血红蛋白的氧亲和力。BPG进一步提高了血红蛋白的输氧效率。在肺部，PO2超过100torr，因

11、此，即使没有BPG，血红蛋白也能被饱和，在组织中，PO2低，BPG降低血红蛋白的氧亲和力，加大血红蛋白的卸氧量。（1 1）高山适应和肺气肿的生理补偿变化；）高山适应和肺气肿的生理补偿变化；BPGBPG升高。升高。（2 2）血库储血时加入肌苷可）血库储血时加入肌苷可BPGBPG。BPG 2,3-二磷酸甘油酸二磷酸甘油酸.协同效应协同效应、波耳效应波耳效应、别构效应别构效应使血红蛋白的输氧能力达到最高使血红蛋白的输氧能力达到最高效率效率. 抗原是指进入异体机体后，能致敏淋抗原是指进入异体机体后，能致敏淋巴细胞产生特异抗体，并能与抗体发生特巴细胞产生特异抗体，并能与抗体发生特异结合的物质（主要有蛋白

12、质、核酸及其异结合的物质（主要有蛋白质、核酸及其它高分子化合物）。它高分子化合物）。.抗原性由抗原分子表面特殊的化学抗原性由抗原分子表面特殊的化学基团决定（一级结构或空间结构），基团决定（一级结构或空间结构），这种决定或控制抗原性的化学基团。这种决定或控制抗原性的化学基团。包括免疫原性和抗原特异性。包括免疫原性和抗原特异性。是指诱导特异免疫反应的能力。是指诱导特异免疫反应的能力。是指与抗体特异结合的能力。是指与抗体特异结合的能力。被免疫活性细胞识别，从而激活免疫活性细胞产生抗体。被免疫活性细胞识别，从而激活免疫活性细胞产生抗体。与相应抗体的与相应抗体的FabFab结合。结合。.是在对抗原刺激的

13、免疫应答中，是在对抗原刺激的免疫应答中，B B淋巴细淋巴细胞产生的一类糖蛋白，它是能与相应抗原胞产生的一类糖蛋白，它是能与相应抗原特异性结合、产生免疫反应的球蛋白，也特异性结合、产生免疫反应的球蛋白，也称免疫球蛋白。称免疫球蛋白。高度特异性高度特异性多样性多样性几乎所有的外源蛋白都能诱导相应的特异性抗体，几乎所有的外源蛋白都能诱导相应的特异性抗体，人体内任一时刻约有人体内任一时刻约有1010，000000种抗体存在。种抗体存在。.抗原抗体反应的条件：抗原抗体反应的条件： 抗原决定簇与抗体结合部位构象互补。抗原决定簇与抗体结合部位构象互补。 二者各有对应的化学基团，通过作用力使二者结二者各有对应

14、的化学基团，通过作用力使二者结合（离子键、氢键合（离子键、氢键 等）等）抗体是抗体是2 2价的，抗原是多价的。价的，抗原是多价的。 抗体极度过剩，抗原分子所有价被抗体的饱和，可溶。抗体极度过剩，抗原分子所有价被抗体的饱和，可溶。 抗原一抗体比例适中，形成网状的抗原抗原一抗体比例适中，形成网状的抗原抗体复合物，抗体复合物，不可溶。不可溶。 抗原极度过剩，抗体被饱和，可溶。抗原极度过剩，抗体被饱和，可溶。.基于抗体基于抗体- -抗原相互作用的生化分析方法抗原相互作用的生化分析方法.对于某一种蛋白质来说，在某一对于某一种蛋白质来说，在某一pHpH，它所，它所带的正电荷与负电荷恰好相等（即净电荷带的正

15、电荷与负电荷恰好相等（即净电荷为零），这一为零），这一pHpH称为蛋白质的等电点。称为蛋白质的等电点。中性盐（中性盐（CaCa2+2+、MgMg2+2+、Cl Cl - - 、HPO4HPO42- 2-）影）影响滴定曲线形状和等电点。盐离子浓度为响滴定曲线形状和等电点。盐离子浓度为0 0时的等电点称等离子点。时的等电点称等离子点。溶解度法聚焦电泳法.化学组成法测定最低分子量化学组成法测定最低分子量SDS-PAGESDS-PAGE法法凝胶过滤法凝胶过滤法渗透压法渗透压法扩散系数法扩散系数法沉降系数法和沉降平衡法沉降系数法和沉降平衡法测分子量的方法测分子量的方法.例例如如肌红蛋白肌红蛋白含含0.3

16、35%0.335%的铁的铁最低相对分子量最低相对分子量FeFe分子量分子量Fe(%)Fe(%)100% = =55.80.335=16,700. 用一用一半透膜半透膜将蛋白溶液与纯水隔开，当将蛋白溶液与纯水隔开，当渗透达平渗透达平衡衡时，测定其渗透压，计算分子量：时，测定其渗透压，计算分子量：C C：浓度（克：浓度（克/ /升）升）R R：气体常数（：气体常数（0.0820.082升升/ /大气压大气压/ /克分子克分子/K/K开氏温度）开氏温度）T T：绝对温度（开氏温度）：绝对温度（开氏温度） ：以大气压表示的渗透压：以大气压表示的渗透压ccTRMr0lim.SDSPAGESDSPAGE即

17、十二烷基硫酸钠即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳.质点大小在质点大小在1-100nm1-100nm，可以进行布朗运动，可以进行布朗运动 蛋白质分子直径在蛋白质分子直径在1-100nm1-100nm之间，在水溶液中具之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）。通过半透膜）。蛋白质表面极性基团形成的水化膜蛋白质表面极性基团形成的水化膜非等电状态时，同种电荷的互相排斥。非等电状态时，同种电荷的互相排斥。.大量的中性盐大量的中性盐 （NHNH4 4）2 2SOSO4 4、NaNa2 2SOSO4 4、Nacl

18、Nacl，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。破坏水化膜，降低介电常数，破坏水化膜，降低介电常数，PEGPEG、丙酮、乙醇等、丙酮、乙醇等pHpHpIpI时带负电荷，与重金属离子（时带负电荷，与重金属离子（HgHg2+2+、 PbPb2+2+、CuCu2+2+等）结成不溶性沉淀。等）结成不溶性沉淀。.pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。. 强酸和强碱；强酸和强碱； 有机溶剂：破坏疏水作用；有机溶剂：破坏疏水作用； 去污剂：去污剂都是两亲分子，破坏疏水作用；去污剂：去污

19、剂都是两亲分子，破坏疏水作用； 还原性试剂：尿素、还原性试剂：尿素、 - -硫基乙醇；硫基乙醇； 盐浓度：盐析、盐溶；盐浓度：盐析、盐溶； 重金属离子：重金属离子：HgHg2+2+、pbpb2+2+，能与，能与-SH-SH或带电基团反应。或带电基团反应。 温度；温度； 机械力：如搅拌和研磨中的气泡。机械力：如搅拌和研磨中的气泡。.制备活性蛋白质时严防蛋白质变性制备活性蛋白质时严防蛋白质变性 生物活性丧失生物活性丧失硫水基团外露，分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解。硫水基团外露，分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解。溶解度降低、沉淀，粘度增加。溶解度降低、沉淀，粘度增加。次级键（有时包括二硫键）被破坏

20、，天然构象解体。次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。但变性不涉及一级结构的破坏但变性不涉及一级结构的破坏不可逆变性不可逆变性可逆变性可逆变性.前处理前处理粗分级粗分级细分级细分级浓缩浓缩保存保存增加制品增加制品(preparation)(preparation)的纯度或比活性。的纯度或比活性。. 生物组织生物组织 无细胞提取液无细胞提取液破碎、溶破碎、溶 解、差速离心解、差速离心精制后的蛋白质精制后的蛋白质.将组织和细胞破碎将组织和细胞破碎超声波震荡、与砂研磨超声波震荡、与砂研磨高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖）高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖）动物组织和细胞动物组织和细胞电动捣碎机

21、（电动捣碎机（waring blender)waring blender)匀浆器（匀浆器（homogenizer)homogenizer)超声波处理（超声波处理（ultrasonication)ultrasonication)植物组织和细胞植物组织和细胞石英砂石英砂+ +提取液，研磨提取液，研磨纤维素酶处理纤维素酶处理微生物细胞微生物细胞.差速离心法收集细胞的某一组分差速离心法收集细胞的某一组分如果提取膜蛋白，超声波或去污如果提取膜蛋白，超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提剂使膜解聚，然后用适当的介质提取取.（NH4NH4）2 2SOSO4 4分级沉淀法（盐析）分级沉淀法（盐析）等电点选

22、择性沉淀法等电点选择性沉淀法有机溶剂分级沉淀法有机溶剂分级沉淀法热处理选择性沉淀法热处理选择性沉淀法生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法一般用选择性沉淀法一般用选择性沉淀法.首先采用透析或首先采用透析或sephdex G-25sephdex G-25凝胶过滤除盐。凝胶过滤除盐。凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相亲和层析、疏水层析（反相HPLCHPLC）自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘状电泳、膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘

23、状电泳、等电聚焦、双向电泳等。等电聚焦、双向电泳等。.晶体保存晶体保存 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度晶不仅是纯度 的一个指标，也是判断制品是否有活的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节析、加有机溶剂、调节pHpH、接入晶种。、接入晶种。冻干粉保存冻干粉保存溶液保存溶液保存加入抗冻剂（加入抗冻剂（50%50%甘油）后甘油）后-20-20至至-

24、70-70保存。保存。.根据蛋白质的溶解度分离根据蛋白质的溶解度分离根据电荷差异分离根据电荷差异分离根据分子大小分离根据分子大小分离根据配体特性异性分离（亲和层析）根据配体特性异性分离（亲和层析）选择性吸附分离（物理吸附）选择性吸附分离（物理吸附）根据疏水性的差异根据疏水性的差异 .盐析法盐析法PEGPEG沉淀法沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法重金属盐选择性沉淀法重金属盐选择性沉淀法 （pHpI，蛋白质带负电荷）生物碱和酸选择性沉淀法生物碱和酸选择性沉淀法 （pHpI，蛋白质带正电荷）热处理沉淀法（铜锌热处理沉淀法（铜锌SODSOD，6565、1515分钟、稳定分钟、

25、稳定. 在在pI时，分子电荷为零，蛋白质分子间的时，分子电荷为零，蛋白质分子间的静电排斥消失，从而蛋白质出现聚集沉淀。静电排斥消失，从而蛋白质出现聚集沉淀。在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。度最小，粘度最大。.低盐浓度时，蛋白质溶解度低盐浓度时，蛋白质溶解度，称盐溶。，称盐溶。高盐浓度时，使蛋白质溶解度高盐浓度时，使蛋白质溶解度析出，称盐析。析出，称盐析。盐析多用溶解度大的中性盐，如盐析多用溶解度大的中性盐，如(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4、NaClNaCl、MgClMgCl2 2、NH4ClNH4Cl、KClKCl等的饱和

26、溶液等的饱和溶液.交 联 葡 聚 糖交 联 葡 聚 糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P ，），） 琼 脂 糖 凝 胶琼 脂 糖 凝 胶（Sepharose，Bio-Gel A）.交联葡聚糖（交联葡聚糖（Sephadex）的分子结构）的分子结构.从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳从装置上分：从装置上分： 圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。从支持物分：从支持物分： 自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、 凝胶电泳（凝胶电泳（PAGE PAGE ，琼脂糖胶，淀粉胶等），琼脂糖胶，淀粉胶等）普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳.等电聚焦电泳法测定蛋白质等电聚焦电泳法测定蛋白质pI.2D gel in proteomics.离子交换纤维素：离子交换纤维素：离子交换交联葡聚糖：离子交换交联葡聚糖：离子交换交联琼脂糖：离子交换交联琼脂糖：.交联葡聚糖离子交换剂交联葡聚糖离子交换剂.极性吸附材料：硅胶、氧化铝、岩藻土（离子吸引和