蛋白质的相互作用研究方法ppt课件

1、 两个或两个以上的蛋白质结合在一同执行生物学功能时，发生相互作用。使蛋白质到发扬作用的位点。使蛋白质的构象发生改动，激活或抑制。 蛋白质蛋白质相互作用和识蛋白质蛋白质相互作用和识别在诸如生物催化、物质转运、信别在诸如生物催化、物质转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种生号传导、免疫、细胞调控等多种生命过程起着重要的作用。命过程起着重要的作用。第三节第三节 蛋白质的相互作用的研讨方法蛋白质的相互作用的研讨方法免疫共沉淀免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP)GST pull-down assay荧光共振能量转移荧光共振能量转移Fluorescent Resonant

2、Energy Transfer FRET双分子荧光互补双分子荧光互补Bimolecular Fluorescent ComplementBIFC酵母双杂交系统酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid Systerm其它方法其它方法1. 原理原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完好细胞内当细胞在非变性条件下被裂解时，完好细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保管了存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保管了下来。假设用蛋白质下来。假设用蛋白质X的抗体免疫沉淀的抗体免疫沉淀X，那么与，那么与X在体内结合的蛋白质在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种

3、目的蛋白质能否在体内结合，也可用用于测定两种目的蛋白质能否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。于确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。优点：生理条件下的结合优点：生理条件下的结合缺陷：能够检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋缺陷：能够检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用白质相互作用一、免疫共沉淀一、免疫共沉淀2.方法1) 收获培育的细胞11071108冷PBS洗涤2次2细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min3) 12000rpm 离心 30min4搜集上清并参与适量抗体，4C摇动1h过夜5参与ProteinA/G-Sepharose(琼脂糖凝胶)悬液， 4C摇动1h6细胞裂解液洗

4、涤ProteinA/G-Sepharose混合液7离心弃上清8沉淀加2蛋白Loading Buffer煮沸510min9离心，上清液跑SDS-PAGE 胶10考马氏亮兰染色、银染 Western Blot 质谱分析3.本卷须知本卷须知1细胞裂解细胞裂解 采用温暖的裂解条件，不能破坏细胞内存采用温暖的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子在的蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂变性剂NP40或或Triton X-100)。每种细胞的裂。每种细胞的裂解条件是不一样的，经过阅历确定。解条件是不一样的，经过阅历确定。 不能用高浓度的变性剂不能用高浓度的变性剂0.2SDS)

5、，细胞裂，细胞裂解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的cocktailer。2运用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共运用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。沉淀。3) 对照实验的设计。对照实验的设计。二、二、GST交融蛋白进展交融蛋白进展Pulldow实验实验 1 原理 细菌表达的谷胱甘肽s转移酶GST交融蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST交融蛋白作为探针，与溶液中的特异性同伴蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠可以沉淀GST交融蛋白的才干来确定相互作用的蛋白。普通在得到目的蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质蛋白质之间的相互作用时，可以启用

6、GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。 两种运用： 1确定交融或探针蛋白与未知或靶蛋白间的新的相互作用 2证明探针蛋白与知蛋白质间可疑的相互作用 2 方法：方法： 1 GST交融蛋白先与以下蛋白溶液之一孵育交融蛋白先与以下蛋白溶液之一孵育a, 单一明单一明确的重组蛋白；确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白表达得到的未知蛋白 2混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反响混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反响 4C 2h 3离心弃上清离心弃上清 4沉淀参与沉淀参与2 蛋白蛋白Loading Buffer煮沸，离心煮沸，离心 5取上清进

7、展取上清进展SDS-PAGE电泳，电泳， 6考马氏亮兰染色察看特异沉降的蛋白带，进一步做质谱考马氏亮兰染色察看特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确分析确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot来确定沉降的蛋白中能否有目的蛋白来确定沉降的蛋白中能否有目的蛋白留意：该实验设立留意：该实验设立GST对照，反响均在对照，反响均在4C进展进展GST-Pulldown Assay三、三、Fluorescence resonance energy transfer 荧光信号的产生荧光信号的产生 荧光基团在某波长的激发光刺激下，产荧光基团在某波长的激发光刺激下

8、，产生一个更长波长的发射光。生一个更长波长的发射光。什么是什么是FRET? FRET? 当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团间隔足够近时，吸收光谱发生重叠，且两个基团间隔足够近时，能量可以从短波长高能量的荧光基团传送到能量可以从短波长高能量的荧光基团传送到长波长低能量的荧光基团，这个过程称为荧长波长低能量的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移光共振能量转移(FRET),(FRET),实践相当于将短波长荧实践相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。光基团释放的荧光屏蔽。3. 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白 60年代，年代，Shimom

9、ura等首先从水母等首先从水母Aequoria Victoria 中分别出一种水母发光中分别出一种水母发光蛋白蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母中提取的颗粒都呈可产生蓝色荧光。然而水母中提取的颗粒都呈绿色，后经证明在水母体内还存在另外一种发绿色，后经证明在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白光蛋白即绿色荧光蛋白 GFP, 后经研讨阐明，后经研讨阐明，在水母体内在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光在蓝光的激发下，产生绿

10、色荧光的激发下，产生绿色荧光 。Osamu Shimomura Osamu Shimomura in the lab in the basement of his home. He is holding a sample of “real GFP isolated from Aequorea victorea, not produced by bacteria. In order to do his research Shimomura estimates that he collected over a million Aequorea specimens。 One Aequorea wei

11、gh about 50gWilliam Ward (right) met Douglas Prasher on a jellyfish-hunting expedition in the 1980s Douglas Prasher was the first person to realize the potential of GFP as a tracer molecule.GFP could be used to report when a protein was being made in a cell.GFP could potentially be a very useful rep

12、orter molecule. 容易检测分子量小 不需求其它底物Douglas Prasher 1992 克隆了GFP基因Chalfie 将GFP基因转入大肠杆菌中。Sergey A. Lukyanov 在珊瑚中发现了类似GFP的蛋白。他还发现了红色荧光蛋白。 Roger Tsien 对对GFP的机理作的机理作出了奉献。制造出了奉献。制造了很多了很多GFP突变突变体。体。GFPsequence MSKGEELFTGVVPVLVELDGDVNGQKFSVSGEGEGDATYGKLTLNFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFYK

13、DDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKMEYNYNSHNVYIMGDKPKNGIKVNFKIRHNIKDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMILLEFVTAARITHGMDELYKforbes/2019/07/26/0726gfp_/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm2019年诺贝尔化学奖GFP主要运用主要运用: 对活细胞中的蛋白质进展准确定位及动态察看对活细胞中的蛋白质进展准确定位及动态察看 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂

14、、分化过可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时空表达程中或外界刺激因子的作用下的时空表达, 如某种转录因子如某种转录因子的核转位、蛋白激酶的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。的膜转位等。 GFP基因与分泌蛋白基因衔接后转染细胞基因与分泌蛋白基因衔接后转染细胞, 可动态察看可动态察看 该分泌蛋白分泌到细胞外的过程该分泌蛋白分泌到细胞外的过程 GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的构造及病理过程。器的构造及病

15、理过程。 膜蛋白的挪动膜蛋白的挪动 Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP 蛋白之间的相互作用蛋白之间的相互作用FRET报告分子报告分子 将将GFP的基因连在特殊的启动子的后面，可以检测的基因连在特殊的启动子的后面，可以检测基因表达的时间和部位。基因表达的时间和部位。 人们在人们在GFP基因的根底上曾经制造出基因的根底上曾经制造出蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，青色荧光蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，青色荧光蛋白，又发现了红色荧光蛋白。蛋白，又发现了红色荧光蛋白。其中兰色荧光蛋白和绿色荧光蛋白其中兰色荧光蛋白和绿色荧光蛋白青色荧光蛋白和黄色荧光蛋

16、白之间可以发青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白之间可以发生荧光共振能量转移生荧光共振能量转移Look at physical interactions between proteins四、Bimolecular Fluorescent Complementation五、五、Yeast TwoHybrid Systerm1.原理原理 酵母双杂交系统由酵母双杂交系统由Fields和和Song等首先在研讨真等首先在研讨真核基因转录调控中建立。核基因转录调控中建立。 典型的真核生长转录因子，典型的真核生长转录因子， 如如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的构造域等都含有二个不同的构造域: DNA结合构造域结

17、合构造域(DNA-binding domain)和转录激活构造域和转录激活构造域(transcription-activating domain)。前者可识别。前者可识别DNA上的特异序上的特异序列，并使转录激活构造域定位于所调理的基因的上列，并使转录激活构造域定位于所调理的基因的上游，转录激活构造域可同转录复合体的其他成分作游，转录激活构造域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调理的基因的转录。用，启动它所调理的基因的转录。 根据这一特点，假设使能够存在相互作用的两种蛋白根据这一特点，假设使能够存在相互作用的两种蛋白X和和Y分别以和分别以和BD/AD构成杂合蛋白的方式的酵母中表达构成杂合蛋

18、白的方式的酵母中表达分布于细胞核中，分布于细胞核中，X与与Y之间的相互作用就可以将之间的相互作用就可以将BD和和AD在空间构造上重新结合为一个整体而与报告基因的上在空间构造上重新结合为一个整体而与报告基因的上游激活序列游激活序列upstream activation sequence结合，结合，进而发扬激活转录的功能，使受调控的报告基因得到表达。进而发扬激活转录的功能，使受调控的报告基因得到表达。根据这一原理，双杂交系统经过简便的酵母遗传分析对报根据这一原理，双杂交系统经过简便的酵母遗传分析对报告基因表型进展检测即可实现对于蛋白质间相互作用的研告基因表型进展检测即可实现对于蛋白质间相互作用的研

19、讨。讨。 酵母双杂交系统利用杂交基因经过激活报告酵母双杂交系统利用杂交基因经过激活报告基因的表达探测蛋白蛋白的相互作用。主要有基因的表达探测蛋白蛋白的相互作用。主要有二类载体二类载体: a 含含DNA -binding domain的载体的载体; b 含含Transcription-activating domain的载体。另的载体。另外还需求特殊的酵母菌株如外还需求特殊的酵母菌株如GAL4缺陷型。缺陷型。1两种蛋白之间能否有相互作用两种蛋白之间能否有相互作用2寻觅一种蛋白能够的相互作用蛋白寻觅一种蛋白能够的相互作用蛋白2. 运用运用 1它并非对一切蛋白质适用。它并非对一切蛋白质适用。 交融蛋

20、白的相互作用激活报告基因转录是在细胞交融蛋白的相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的，而表达的交融蛋白在细胞内能否正确折核内发生的，而表达的交融蛋白在细胞内能否正确折叠并运至核内是检测的前提条件。虽然目前曾经在表叠并运至核内是检测的前提条件。虽然目前曾经在表达质粒中插入了核定位序列，但仍不能排除不少必需达质粒中插入了核定位序列，但仍不能排除不少必需经过内质网等细胞器进展翻译后加工修饰的蛋白质尤经过内质网等细胞器进展翻译后加工修饰的蛋白质尤其是胞外蛋白不能进入核内，或因产生错误的构象而其是胞外蛋白不能进入核内，或因产生错误的构象而影响筛查结果影响筛查结果.3. 双杂交系统的缺陷双杂交系统的缺陷 2假阳性的发生较为繁多。假阳性的发生较为繁多。 在筛库过程中遇到的假阳性可被简单分成三型：在筛库过程中遇到的假阳性可被简单分成三型：型：表达单独的型：表达单独的AD-Y交融蛋白即可激活转录。交融蛋白