第八章配子与胚胎生物技术

1、第八章 配子与胚胎生物技术 第一节 胚胎移植技术一、概 述 （一）概念（记忆，P253） 胚胎移植（embryo transfer，ET）：又称借腹怀胎，受精卵移植。它是将体内（优秀母畜）、外生产的哺乳动物早期胚胎（一般情况下所移植的不是受精卵，而是发育至多细胞、桑椹胚或胚泡阶段的胚胎），（如果是体外内胚胎用手术或非手术的方法取出，在显微镜性下检出后），移植到同种的生理状态相同的雌性动物生殖道内，使之继续发育为正常个体的生物技术。 提供胚胎的个体供体（donor） 接受胚胎的个体受体（recipient）F超数排卵和胚胎移植通常同时应用，合称超数排卵和胚胎移植（multiple ovulati

2、on and embryo transfer，MOET），简称MOET技术（记忆，P209）（二） 发展历史（熟悉，P209-211）1、试验研究阶段2、实际应用阶段3、产业化阶段（三）胚胎移植在畜牧业生产上的意义（P256，记忆）1、提高良种母畜繁殖力；2、简化良种引进方法；3、降低种质资源保护利用；4、加速育种进程；5、利于防疫；在养猪业中，为了培育无特异性病原体(SPF)猪群，向封闭群引进新的个体时，作为控制疾病的一种措施，采用ET技术剖腹取仔的方法。 6、促进生殖生理理论与胚胎生物技术的发展 二、ET的生理学基础与基本原则（一）生理学原理（书P212，记忆）1、母畜发情后生殖器官的孕向

3、发育母畜发情后数日甚至10余日内，生殖系统的变化相同，即在相同的时期，生理状态一致，子宫内的环境相同。2、早期胚胎的游离状态游离状态是胚胎采集、保存、培养和体外操作等重要理论基础。3、子宫对早期胚胎的免疫耐受性即胚胎移植不存在免疫问题。4、胚胎遗传物质的稳定性胚胎的遗传特性不受受体母畜的影响。（二）ET遵循的基本原则（P212-213，记忆） 1、 胚胎移植前后所处环境的同一性（1）供体和受体在分类学上的属于同一物种；（2）胚胎发育阶段与受体发情时间上的一致性；（3）胚胎发育阶段与受体生殖道解剖位置的一致性。2、胚胎发育的阶段。 ET时间应在妊娠时别发生之前，通常在供体发情配种后38d内收集胚

4、胎，受体也在相同时间接受ET。 3、胚胎的质量。 保证质量。4、经济效益或科学价值。 供胚应具独特经济价值，而受体要求生产性能一般，但繁殖性能良好，环境适应能力强。（三）ET应具备的条件（熟悉，P213）1、实验室条件2、技术条件3、胚胎来源二、胚胎移植的技术（记忆）（一）供、受体母畜的选择（P214） 1、供体母畜 健康，较高育种价值，生殖机能正常，已证明对超排反应较好。 2、受体母畜 健康、繁殖性能良好，体型较大。 （二）受体母畜的同期发情（P214）同第四章第七节（三）供体母畜的超排（P214-216）1、超排方法（前已说）2、提高超排效果的措施（选择对象、规范化管理、优质药品）（四）供

5、体母畜的配种（P216） 适当的时间，优质精液对供体母畜进行输精。使用密度大、活率高的精液输精，输精次数2-3次，间隔8-10h。（五）胚胎采集（冲卵）（P216-219） 定义：是利用特定的溶液和装置将早期胚胎从母畜 子宫或输卵管中冲出并回收利用的过程。 1、冲胚液的配制与灭菌：含5%犊牛血清的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBSS）。2、冲胚器械用途和准备（1）二路式或三路式冲胚管；（2）外科手术器械。（3）保定架（4）必备药品 3、供体母畜的检查与处理 供体牛在发情的第5-6d通过直检卵巢上黄体数，确定进行冲胚处理的牛的头数。两侧上有2个或2个以上的黄体才冲胚，冲胚时间在发情第7d进行。 4、胚

6、胎的收集（时间、方法）胚胎收集时间（记忆）： 配种后38d后，发育至4-8细胞胚以上为宜（大多数动物） 或桑葚胚或早期囊胚（配种后6-8d）（牛和水牛）收集胚胎的方法（记忆） （1）手术法（小动物和实验动物） 在腹中线处作一切口，然后将子宫角和卵巢一起拉出，检查排卵点或血红体数量。冲胚方式采取：输卵管采胚法（于羊和兔）；子宫角采胚法（于羊、猪和兔等）（2）非手术法收集胚胎（大家畜） 麻醉、消毒直肠把握充气灌流冲胚液 消毒生殖道用含抗生素的生理盐水冲洗2d后消黄（六）胚胎的检查胚胎的检查：是指在体视镜下从冲卵液回收胚胎，同时间差胚胎数量和质量。对发育正常的胚胎供移植或体外培养和保存。胚胎的鉴定：

7、指应用各种手段对胚胎质量和活力进行评定或等级分类。形态学上可分为A、B、C、D或1、2、3、4。还有体外培养法、荧光法、测定大写活性和胚胎的细胞计数。（七）胚胎的保存（P221-224） 胚胎保存：指将胚胎在体内、体外正常发育温度下，暂时储存起来而不使其失去活力；或将其保存于低温或超低温情况下，使细胞代谢处于新陈代谢和分裂速度减慢或停止，即使其发育处于暂时停顿状态，一旦恢复正常温度时，又能再继续发育。胚胎冷冻保存意义：适应ET产业化；便于运输、建立基因库。方法：异体活体保存（1-3d）常温保存，15-25（24h）低温保存0-5, 目前认为5-10比较好，保存温度较短。超低温冷冻保存：常规冷冻

8、保存（程序冷冻控制仪）和玻璃化冷冻保存（高浓度抗冻剂）（八）胚胎的移植（P224-225）1、手术法移植（小动物和实验动物）与冲胚同。2、腹腔内窥镜法移植（人）3、非手术法移植：直肠检查黄体位置，然后似人工授精般将胚胎用移植管通过子宫颈放入到与黄体同侧的子宫角内，或两侧子宫角各放一枚胚胎。（1）直肠把握（2）移植到与黄体同侧的子宫角（九）受体移植后的饲养管理（P225） 1、加强饲养管理 2、妊娠诊断以便分群饲养和管理 3、及时注射疫苗四、胚胎移植的实际效果和影响妊娠率的因素（P225-226）（一）胚胎移植的实际效果主要取决于：1、胚胎来源（1） 排卵率：超排处理后有超排反应得供体所占百分率

9、。（2） 回收率：收集的卵子和胚胎占总黄体数的百分率。在50-80%，非手术法低于手术法（3） 受精率：发育正常的胚胎数占所收集的卵子和胚胎总数的百分率。排出的恶卵子有形态不正常或未受精，有的胚胎发育迟缓或死亡的。以上三种情况决定了最后可利用的胚胎数。2、胚胎冷冻和胚胎分割的应用胚胎冷冻成功，使得胚胎的利用不受时间空间的限制，但冻胚的移植妊娠率下降5-20%。而利用胚胎分割则可以成倍增加胚胎的数量，降低成本，提高经济效益。（二）影响妊娠率的因素因为胚胎附植、妊娠的确立涉及胚胎、子宫环境和黄体之间的一系列协调关系，所以影响因素很多，主要因素如下：（1）胚胎因素 （2）母体因素（3）其他因素胚胎移

10、植效果（了解）v 新鲜一级和优级胚及自然发情受体受胎率50-60%v 新鲜一级和优级胚及同期发情受体受胎率40-50% v 体内一级和优级冻胚及自然发情受体受胎率35-45% v 体内一级和优级冻胚及同期发情受体受胎率30-40% v 体外一级和优级冻胚及自然发情受体受胎率25-30%v 体外一级和优级冻胚及同期发情受体受胎率20-30%五、ET主要存在的问题（熟悉，P226-227）1、胚胎来源限制了NT的效率和实际应用；2、缺乏熟练操作的技术人员；3、胚胎冷冻保存仍存在很多问题；4、ET费用高，人力和时间耗费大，条件严格制约了其推广应用；5、羊、猪胚胎采集和移植主要采用手术法易造成粘连，受

11、体重复使用受限制。六、ET技术的发展前景（了解，P227）1、牛羊的胚胎冷冻保存和移植技术已基本成熟，一些国家已进入产业化阶段，近年来，我国畜牧业发达地区推广速度很快，有潜在的开发前景；2、胚胎冷冻保存是实现ET产业化的重要保障，其具有重要意义。胚胎冷冻保存可以使：（1）使胚胎不受时间和空间的限制；（2）利于国内国际之间的品种交流；（3）能够解决印中和防止或减少疾病的传播；（4）加速品种改良和扩大优良品种覆盖率；（5）建立家畜和濒危动物的“基因库”，免受各种灾害造成品种灭绝的危险。（6）对于胚胎组织学、发育生物学、遗传育种学和胚胎生物技术的基础理论研究具有重要价值，为将来组织和器官的冷冻保存提

12、高充分的理论依据。3、如何超排效果、简化技术操作过程，提高移植妊娠率等很多方面仍有很多工作要做。 第二节 体外受精一、IVF技术的发展历史（一）补充IVF概念（记忆） 在自然条件下，哺乳动物精子和卵子的受精过程是在体内完成的。如将精子和卵子分别从公、母畜体内取出并经过一系列的处理，使精卵在体外条件下结合的过程，称为体外受精(in vitro fertilization，IVF)。 由于卵子和精子的受精过程是在实验室中完成，故通过这一技术而产下的动物又称为“试管动物”，如“试管牛”、“试管猪”、“试管婴儿”等。（二）发展历史（P228）u 1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚Austin发现精子

13、capacitation；u 20世纪60-80年代中期，纷纷得到了世界首例试管小鼠（1968）、大鼠（1974）、婴儿（1978），犊牛（1982）、绵羊和山羊（1985）、猪（1986）。u 我国学者卢克焕在爱尔兰建立了一整套牛体外受精技术体系，并利用该技术体系于1987年生产了世界上数量最多的试管牛群，并于1988年初又研究成功了世界首例完全体外的试管双犊。u 蒋和生等于1993年利用体外成熟的卵母细胞进行IVF，获得了我国首例试管水牛。u 20世纪80年代中期以后，IVF-ET技术在医学上得到广泛应用，成为治疗不孕症的主要方法之一；u 同时，家畜IVF技术（牛）发展迅速。采用能够IVF

14、-ET技术，每对废弃的牛卵巢可获得3头犊牛；u 80年代后期，牛0PU（ovum pick up）技术发展迅速，OPU和IVF-ET结合已成为扩大良种母牛群选择的重要的繁殖技术；u 至今，IVF不仅用于畜牧生产，同时也成为其他胚胎生物技术，如克隆、转基因、胚胎干细胞和性别控制等重要的辅助手段。二、IVF技术的基本操作程序（熟悉，P228-230）体外受精的主要内容包括：卵子的体外成熟（in vitro maturation, IVM）卵子和精子的体外受精（ in vitro fertilization, IVF）受精卵的体外培养（ in vitro culture, IVC）（一）卵母细胞的采

15、集和成熟培养（P228-230）1、卵母细胞的采集 （1）超数排卵（实验动物或小型多胎家畜） （2）离体卵巢采卵（主要来源） 方法：卵泡抽吸法和卵巢解剖法（3）活体采卵（优良品种） 借助超声波探测仪或腹腔镜2、卵母细胞的选择（P229）卵丘细胞-卵母细胞复合体（cumulus oocyte complex, COC）A：3层以上卵丘细胞紧密包围，细胞质均匀B：卵丘细胞低于3层，细胞质均匀C：无卵丘细胞包围（裸卵，光卵）D：死亡或退化的卵母细胞3、卵母细胞的体外成熟（IVC）（1）培养液：用于卵母细胞体外成熟的最为广泛基础培养液是M199。加入一定的血清和激素。（2）温度和气相：温度一般为383

16、9。气相一般要求在含5C02的空气和最大湿度的环境。（3）培养时间： 牛和羊卵母细胞体外成熟培养的时间一般为2224h，而马为3036h，猪为4044h。（4）培养方法：通常采用微滴法（50 200ul）。（二）体外受精（IVF）1、精子获能处理：（1）培养：一定介质中培养（2）化学诱导：如肝素、钙离子载体法2、受精：即获能精子与成熟卵子的共培养，一般在获能液中完成受精过程。（三）胚胎培养（IVC）1、培养体系： 复杂胚胎培养液：如TCM199采取和体细胞共培养 成分明确培养液：CZB、SOF、CRaa等2、培养方法：微滴法（3-10ul） 3、受精后，卵母细胞应立即CO2培养箱中培养2444

17、h，其中牛2224h，将假定的受精卵从受精液中取出，再在早期胚胎体外培养液中继续培养1833h。受精后4044h检查受精卵的分裂率。其中48-72h更换一次培养液（换1/2）。三、家畜IVF技术的发展现状和存在的问题（231-232）（一）发展现状（P231）牛：卵裂率（CR）80-90%， 囊胚（BL）发育率%：40-50%，BL冷冻后能继续发育率80%，ET后产犊率30-40%。平均每个卵巢获A级卵母细胞10个，经IVF可获得3-4BL，ET后产犊1-2头。羊：CR：80-90%；BL：30-40%; BL冷冻后能继续发育率80%，ET后产犊率50%。猪：CR: 90%, BL: 60-7

18、0%; ET后产仔率30%。（二）存在问题和发展方向（P232）1、存在问题（1）囊胚发育率低，细胞数少；（2）产犊率低，胎儿出生重高。2、发展方向（1）深入研究卵母细胞成熟和胚胎发育的分子机理；（2）加强腔前卵泡的培养研究，充分利用优良母畜的遗传资源；（3）加强IVF与其它生物技术的结合。四、辅助受精技术（ P232-233）辅助受精技术：通过人为方法使精子和卵子完成受精过程，克服精子不能穿过透明带和卵黄膜的缺陷。目前有透明带修饰和精子注入法，由于两种方法都需借助显微操作仪来完成，故又称显微授精（microinsemination）。（一）透明带修饰法 对透明带打孔、部分切除或撕开缺口。（二

19、）精子注入法（P233）直接注入到卵黄周隙或卵母细胞的胞质中，前者称透明带下注射（subzonal insemination, SUZI），后者称胞质内注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）第三节 克隆技术 克隆（cloning）（记忆，P233）：指不通过精子和卵子的受精过程而产生遗传物质完全相同的新个体的一门胚胎生物技术。哺乳动物克隆技术：广义：胚胎分割和细胞核移植技术狭义：胚胎细胞核移植和体细胞核移植技术一、胚胎分割定义（记忆，P233）：是运用显微操作系统将哺乳动物附植前胚胎分成若干个具有继续发育潜力部分的生物技术。（一）发展简介（P233

20、）（二）胚胎分割的基本程序（P234 ）器具的准备胚胎预处理胚胎分割分割胚的培养分割胚的保存和移植（三）胚胎分割的技术进展和存在问题（P235） 存在问题： 1、初生重低 2、遗传一致性 3、异常与畸形 4、同卵多胎的局限性二、单个卵裂球分离培养（P235-236）定义：把哺乳动物早期胚胎分离成单个卵裂球，再把卵裂球单独培养为正常胚胎，然后移植给受体得到克隆后代。三、胚胎细胞核移植（P236-239）胚胎细胞核移植（embryonic cell nuclear transfer ）（记忆，P236）：又称胚胎克隆。它是通过显微操作将早期胚胎细胞核移植到去核卵母细胞中构建新合子的生物技术。 核供

21、体：提供细胞核的胚胎核受体：接受细胞核的卵子胚胎克隆的理论基础：早期胚胎细胞具有发育的全能型或多能性 。胚胎细胞核移植的意义（了解，P236）：1、可大量扩增遗传性状优良的个体，加速品种改良和育种的进程；2、可扩大濒危种群；3、为科学研究提供遗传同质动物；4、大大提高转基因和性别控制技术的效率；5、为探索核质互作，非细胞核遗传规律和早期胚胎的发育调控机理等提供了有效手段。（一）哺乳动物胚胎克隆的研究简介 小鼠、绵羊、牛、家兔、山羊和猪（二）胚胎克隆的操作程序（P236-239）1、卵母细胞去核2、供体核的准备和移植3、卵裂球与卵子的融合4、卵子的激活（电脉冲）5、克隆胚的培养（三）胚胎克隆技术

22、存在的问题（P238）1、供体核数量的局限性；2、受体卵子的质量；3、核质关系的影响；4、操作技术的影响。 （四）胚胎克隆技术的发展远景（P238-239）1、比胚胎分割、卵裂球培养大大提高了生产遗传同质动物的效率；2、在动物研究个体发生发育中，为探索核质互作、胚胎细胞的分化规律上提供了很好的研究手段。3、为体细胞核移植提供有益的借鉴。四、体细胞核移植（P239-240）体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer, SCNT）（记忆）：又称体细胞克隆，它是把分化程度较高的体细胞移入到去核卵子中，构建新合子的生物技术。与胚胎细胞克隆比有2大优点：1、供体核的数量可无

23、限获得；2、通过对供体细胞的改造，加速家畜品种改良或生产转基因动物。SCNT的意义（了解，P239）：1、实现优良家畜的无限扩增；2、简化品种保存为组织细胞的冷冻保存；3、改造体细胞，可大大提高目前的转基因率；4、通过对特殊个体的无性繁殖可提高经济效益；5、对高价值的特殊医学模型动物进行扩增；6、为人类ES细胞系的建立提供胚胎；7、对生物学基础研究如细胞分化和胚胎早期发育调控有重要意义。（一）SCNT技术研究概况（P239）（二）SCNT技术的关键环节（P239） 与胚胎细胞克隆基本相同。主要差别在于供体细胞的选择（三）SCNT技术目前存在的问题（P240）1、结果不稳定，效率低（0.5-5%

24、）；2、后代死亡率高；3、用其他体细胞作供体的探索；4、细胞质遗传问题；5、供体细胞的保存和细胞周期的影响。（四）SCNT技术的发展远景（了解，P240）1、大大提高畜牧业的生产效率；2、加强濒危动物的保护力度；3、克隆与转基因技术结合将大幅度提高转基因效率，克服外源基因随机整合带来的消极影响；4、进行治疗性克隆。治疗性克隆：通过体细胞核移植并培育到囊胚期，并从这个囊胚分离出ES细胞，体外定向诱导分化成有特定功能的细胞，就能为需要的病人提供不具有排斥反应的细胞、组织和器官。第四节 转基因技术哺乳动物转基因技术（记忆，P240-241）：是基因工程与胚胎工程结合的一门新兴生物技术。它是通过一定方

25、法把人工重组的外源DNA导入到受体动物的基因组中或把受体基因中的一段基因切除，从而使受体动物的遗传信息发生人为改变，并且这种改变能遗传给后代的一门生物技术。通过这种方式又到遗传改变的动物称为转基因动物（transgenic animals）。一、哺乳动物转基因技术的研究意义（P241）（一）在基础生物学中1、已用于研究真核细胞的基因转录、表达和调控规律以及个体发育分子的调控规律；2、借助转基因基因模型作更深一步研究。（二）在基础医学研究中1、制备动物疾病模型；2、治愈人类的遗传疾病。（三）在畜牧业中1、改造家畜的基因，以达到人们所需目的如加快生长速度、提高饲料报酬或增强抗病力等；2、生产药用或

26、营养蛋白质；3、作器官移植。二、哺乳动物转基因技术的研究概况（P241-242）三、哺乳动物转基因技术的主要环节（P242）（一）目标基因克隆和体外重组1、人工合成2、互补DNA的克隆3、DNA克隆 （二）外源基因的导入（P242-244）1、显微注射法 2、反转录病毒感染法（P243）3、胚胎干细胞法（P243）4、精子载体法5、细胞核移植法6、生殖细胞转染法 （三）外源DNA整合、转录及表达的检测（P244-245）1、外源基因的整合检测2、外源基因的转录检测3、外源基因的表达检测 （四）转基因动物品系或品种的建立（P245）第一代转基因动物：半合子转基因动物，外源基因仅在一条染色体上稳定

27、整合通过选种选配，将2个半合子转基因动物成功交配才能得到纯合子转基因动物，建立转基因动物家系，外源DNA才能在后代中稳定遗传。四、哺乳动物转基因技术存在的主要问题（P245）1、效率低，成本高。2、外源基因的随机整合和异常表达3、转基因与动物保护的矛盾4、转基因动物释放及生物安全五、哺乳动物转基因技术的发展趋势（P245-246）1、提高效率，降低成本2、加强基因定点整合技术的研究3、转基因技术的发展将对人类产生深刻的影响第五节 性别控制技术一、性别控制技术的发展概况动物性别控制技术定义（P246，记忆）：是通过对动物的正常生殖过程进行人为干预，使成年雌性动物产生人们期望性别后代的一种生物技术

28、。性别控制的意义（P246）1、可充分发挥受性别限制的生产性状（如泌乳性状）和受性别影响的生产性状（如肉质,生长速度等）的最大的经济效益； 2、可增强良种选种强度、加快育种进程； 3、克服牛ET中出现的异性孪生不育现象；4、排除伴性有害基因的危害。一、性别控制技术的发展概况（P246）Ø 物理法时期（1925-1970）：离心，电泳等 这些方法都是以x和y精子之间存在物理差异为依据，如密度、重量、形态、大小、活力和表面电荷。 Ø 免疫法时期（1971-1989）：H-Y抗原（雄性特异的组织性相容性抗原）Ø 流动细胞仪分离法时期（1990-）：最科学，最可靠二、哺乳

29、动物的性别控制技术（P246-248）（一）X、Y精子的分离1、 X和Y精子的差异 X精子染色体的含量高于Y精子染色体上特异SRY (Sex-determining region of Y-chromosome）序列。2、X和Y精子的分离理论基础：DNA含量：X>Y，Hoechst 33342染色流动细胞器分类法进行X、Y精子分离的程序（记忆，P247）：1、先用DNA特异性染料对精子进行活体染色；2、然后精子连同少量稀释液逐个通过激光束，探测器可探测精子的发光强度并不把不同强弱的光信号传递给计算机；3、计算机指令液滴充电器使发光强度高的液滴带正电，弱的带负电；4、然后带电液滴通过高压电场，不同电荷的液滴在电场中被分开，进入到两个不同的收集管，正电荷收集管为X精子，负电荷收集管为Y精子 。（二）早期胚胎性别鉴定（P247-248）1、核型分析法 从早期胚胎中取出部分细胞，制备染色体标本，观察性染色体类型。2、SRY片段基因的PCR扩增法从早期胚胎中取出一个或几个卵裂球，用特异