第10章 富含多不饱和脂肪酸的光合微生物的调查姜剑锋

1、第三部分 利用光合生长微生物生产单细胞油脂第10章 富含多不饱和脂肪酸的光合微生物的调查前言几种长链（C20-C22）多不饱和脂肪酸（VLC-PUFA）在人体健康和制药上具有非常大的价值。这些多不跑和脂肪酸中，有些是人体许多重要物质的前体，例如，花生四烯酸（AA）和二十二碳六烯酸（DHA）是大脑细胞膜磷脂的主要多不饱和脂肪酸，对婴幼儿视觉系统和智力的发育具有非常重要的作用。新生婴儿主要是从母乳中获得多不饱和脂肪酸，因此，无法母乳喂养的早产的婴儿应该摄入一定量的AA和DHA。实际上，很多健康权威当局都推荐了AA和DHA的添加量，美国食品药品监督管理局也批准了它们的联合使用。另外一种多不饱和脂肪酸

2、，双高-亚麻酸，具有消炎作用，并且可以治疗特应性湿疹、银屑病、哮喘、关节炎。n-3族长链多不饱和脂肪酸可以从微藻中获得。例如，Porphyridium cruentum，Nannochloropsis sp.，Phaeodactylum tricornutum和Monodus subterraneus是生产二十碳五烯酸（EPA）的潜在来源；寇氏隐甲藻和蓝隐藻富含DHA。然而，n-6族长链多不饱和脂肪酸和高含量的-亚麻酸在生物体中很少见，除非经过基因操作处理。AA在淡水藻中几乎不存在，在大多数海洋微藻中，它在总脂肪酸中的含量也不是很高（表10.A）。表10.A 富含AA的藻类的主要脂肪酸组成种类

3、主要脂肪酸（%）16:016:118:118:218:3n-618:4n-320:4n-620:5n-322:6n-3硅藻纲Thalassiosira pseudonana102911415绿藻纲Parietochloris incisa10216171431甲藻纲Amphidinium carteri121213192024褐藻纲Desmarestia acculeata1227610161919Dictyopteris membranacea20114141111119Ectocarpus fasciculatus1713415231113葱绿藻纲Ochromonas danica4726

4、1278红藻纲Graciaria confervoides183162146Phycodrys sinuosa225511442Porphyridium cruentum341212407微藻中存在的富含多不饱和脂肪酸的甘油三酯很多微藻都含有长链多不饱和脂肪酸，这些长链多不饱和脂肪酸是极性油脂的组成部分，然而，极性油脂的含量实际上非常低。含油藻类也能积累中性油脂，主要包括甘油三酯（TAG），在某些刺激作用下，如氮限制、盐或高温条件下，其脂肪含量可以达到86%以上；然而，甘油三酯主要由饱和或单不饱和脂肪酸组成。为了使微藻可以作为长链多不饱和脂肪酸的经济来源，必须找到甘油三酯中富含这些长链多不饱和

5、脂肪酸的藻种。Cohen研究发现，在氮源限制条件下，紫球藻（Porphyridium cruentum）体内的花生四烯酸含量可以达到细胞干重的2.5%，占其总脂肪酸含量的41%。在当时，这是所有植物来源的花生四烯酸中含量最高的，并且它是唯一一种三酰基甘油中含有多不饱和脂肪酸的光合微藻。相反，在真菌中，尤其是在被孢霉属，花生四烯酸可占脂肪酸含量的60%以上。微藻中油脂的积累微藻中，油脂的积累是一个双向的过程。在生长条件没有限制时，细胞的生长一直会进行，直到生长条件限制为止。在油脂积累阶段，多出的碳源和一个限制因子（大多数时候是氮源）会导致细胞中油脂的积累。当光照很强的时候，氮源的限制会导致细胞停

6、止生长。当碳的光和固定作用仍在进行的时候，碳氮比的增加会导致不含氮产品（如甘油三酯）的增加。按照普遍的说法，藻体内积累的甘油三酯，贮存有碳源和能量，可以在条件改善的时候支持细胞的生长。为了达到上述目的，饱和的酰基部分将是首选，因为它比生产多不饱和脂肪酸时需要很少的能量，并且可以为氧化提供能量，但这些对积累富含多不饱和脂肪酸的甘油三酯毫无意义。在紫球藻，运用放射性标记法对花生四烯酸进行标记，发现甘油三酯中积累的花生四烯酸，转移成构成叶绿体膜的主要脂质，多半是单半乳糖基二酰基甘油（MGDG）。并且，在对紫球藻的突变株HZ3的研究发现，低温下，二十碳五烯酸的含量和生长量都会减少。大多数藻类多生长在很

7、深的水中不同，温度的变化较慢，而紫球藻则生长在浅的沼泽和砂地里，这样，温度可以迅速的变动。MGDG中EPA的增加，尤其是在真核生物中，是在低温时得到的，这可能是生物体受到温度改变的刺激而作出反应的结果。HZ3突变株在真核途径上缺乏，但在原核途径上可以通过加强生产来补偿。存在于小生态环境的藻体，易受温度、盐度和可利用氮的影响，会导致明显和快速的反应，并最终体现油脂的脂肪酸组成和含量上。软而，在这种条件下，多不饱和脂肪酸的从头生物合成太慢。在这些藻类中，甘油三酯可能还有另外一种角色，即缓冲作用，当遇到环境改变时，可以构建叶绿体膜并使之快速适应环境的变化。富含多不饱和脂肪酸的三酰基甘油可用作修饰叶绿

8、体类脂的多不饱和脂肪酸来源在大多数植物和低等生物体中，膜脂肪酸的不饱和程度随着温度的下降而上升。因此，采用一个从高温到低温的转换，会有利于多不饱和脂肪酸的含量的增加。然而，低温时生物反应过程会减慢；甚至在室温时，在研究紫球藻时，放射性标记醋酸盐，研究结果表明，放射性的EPA在加入醋酸盐10以后才出现，这说明，低温时，想通过从头合成的方法来提高多不饱和脂肪酸的含量会非常困难。多不饱和脂肪酸还有一个重要的作用就是保护细胞不受高强度光照和紫外辐射的影响，尤其是在低温时，这也提高了藻体幸存的能力和适应环境的能力。甘油三酯贮存多不饱和脂肪酸的能力使该生物体具有很好的适应性。因为高含量的自由脂肪酸对细胞有

9、毒害作用，所以它们必须以油脂的形式存在。极性油脂是细胞膜的组成成分，因此，这些油脂的积累是有限的；所以，中性油脂（多半是TAG）是唯一的选择。我们推测，藻类的天然产地的环境条件具有快速的变化性，例如高山环境，长链多不饱和脂肪酸起到缓冲作用。雪藻（parietochloris incisa）的分离和鉴定为了对上述推测进行试验，我们从日本收集到几个藻种，它必须能忍受从0到20温度范围和普通光到强光的照射。对这些藻种进行筛选，分离得到绿藻纲的雪藻（Parietochloris incisa）藻株，是目前为止含花生四烯酸最高的藻种。这个藻种是第一个也是唯一一个富含高质量甘油三酯，尤其是多不饱和脂肪酸的

10、藻种。花生四烯酸是雪藻的主要脂肪酸，对数期时它占总脂肪酸含量的34%，而在稳定期时，它占总脂肪酸含量的43%。其它主要脂肪酸包括16:0、18:1和18:2。在那些含量较少的脂肪酸中，包含一些n-6族多不饱和脂肪酸，例如18:3n-6和20:3n-6，还有一些n-3族多不饱和脂肪酸，例如16:3n-3、18:3n-3和20:5n-3。甚至在对数期，甘油三酯也是主要脂类，它占总脂肪酸含量的43%（表10.B），在对数期，含量更是达到77%。与其它藻类的脂肪酸主要是饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸不同，雪藻的甘油三酯中花生四烯酸含量在对数期可以达到47%以上，除了花生四烯酸，它还含有16:0、18:1和

11、18:2。得益于甘油三酯在稳定期的积累，沉积在甘油三酯中的花生四烯酸的含量也由对数期时的60%上升到稳定期的90%。除了花生四烯酸，雪藻体内其它的脂肪酸组成与其它藻类并没有明显的差异，主要包括C16和C18多不饱和脂肪酸。117表10.B 雪藻在对数期(L)和指数期(S)的主要脂肪酸组成脂质类别油脂含量脂肪酸组成（占总脂肪酸%）16:016:1n-1116:2n-616:3n-318:018:1n-918:1n-718:2n-618:3n-618:3n-320:3n-620:4n-620:5n-3BiomassL13.94.71.74.01.76.75.113.21.510.31.233.61

12、.7S10.11.81.30.92.512.24.217.20.82.01.042.50.7MGDGL22.11.91.08.520.50.43.60.814.50.831.90.313.91.1S4.93.41.220.811.00.54.30.031.40.718.50.26.10.6DGDGL14.216.01.11.41.71.95.84.026.01.518.60.718.11.4S6.834.00.50.20.64.56.93.031.02.42.90.47.60.6PCL5.729.52.70.20.54.211.82.016.04.52.31.921.01.8S0.731.21

13、.4-5.58.915.421.12.61.40.79.6-DGTSL4.047.11.80.30.57.42.07.49.43.61.90.915.20.8S4.630.00.42.60.63.95.42.834.23.33.50.410.00.6PEL2.911.11.40.21.33.94.218.24.81.23.04.143.21.7S0.619.84.50.34.87.14.324.711.21.51.82.014.3-TAGL42.913.30.5-0.43.715.36.810.41.11.01.543.01.0S77.18.40.4-3.118.04.014.10.70.41

14、.147.10.7雪藻的油脂组成也是罕见的，它同时存在1，2-二酰基甘油-O-4'-(N,N,N-三甲基)高丝氨酸（DGTS）、卵磷脂（PC）和脑磷脂（PE），这并不常见。1，2-二酰基甘油-O-4'-(N,N,N-三甲基)高丝氨酸在许多绿色藻类中大量存在，例如Dunaliella salina、Chlamydodmonas reinhardtii和Volvox carteri体内，它存在于细胞膜基质中。1，2-二酰基甘油-O-4'-(N,N,N-三甲基)高丝氨酸与卵磷脂在很多方面相类似，它一般在卵磷脂缺乏或者含量很低时出现。这三种油脂的共同存在的状况也发生在微拟球藻(

15、Nannochloropsis sp.)和微藻M. subterraneus生产EPA的过程中。总体来说，1，2-二酰基甘油-O-4'-(N,N,N-三甲基)高丝氨酸或者与卵磷脂同时出现，或者与脑磷脂同时出现，但不会和它们一起出现。例如，Chlamydodmonas reinhardtii含有脑磷脂和1，2-二酰基甘油-O-4'-(N,N,N-三甲基)高丝氨酸，杜氏盐藻和D.parva含有卵磷脂和1，2-二酰基甘油-O-4'-(N,N,N-三甲基)高丝氨酸。我们推测，雪藻中中这些物质共同存在与花生四烯酸有关。诱导雪藻中花生四烯酸的积累为了达到氮源限制的效果，在对雪藻培养

16、的稳定期的早期阶段，应使雪藻在无氮培养基中继续培养。运用电子显微镜对甘油三酯的研究显示，甘油三酯在藻体中聚集成大的油滴（图10.1）。无氮培养14天后，脂肪酸占总干重的含量由17%增加到36%，而在常规培养基中，这个数字只是增加到25%（表10.C）。花生四烯酸占总脂肪酸含量也有一个明显的变化，从40%增加到59%，而通常情况下只增加到46%。在所有脂类中，花生四烯酸的含量都会变化，尤以中性油脂的变化为甚，增加到64%，而普通培养下只增加到51%。对照的，在后期的无氮培养中，花生四烯酸占干物质的含量由7%增加到21%，而普通培养只增加到11%；中性油脂，主要是甘油三酯，占总脂肪酸含量的87%，

17、而普通培养只占62%（表10.D）。在缺乏氮的条件下，超过90%的花生四烯酸结合在甘油三酯中，花生四烯酸含量的增加得益于甘油三酯含量的增加和花生四烯酸占总甘油三酯比例的增加。在无氮培养中，甘油三酯的主要分子是三花生四烯酸甘油，它占总甘油三酯的40%左右，而普通培养只占21%（表10.E）。在其它的分子种类中，二花生四烯酸部分的，包括18:2、18:1和16:0，占到54%左右，而一花生四烯酸部分的几乎没有。表10.C 氮缺乏对脂肪酸组成和含量的影响培养时间（d）含量（占干物质%）主要脂肪酸组成（占总脂肪酸%）总脂肪酸花生四烯酸16:018:018:1n-918:1n-718:2n-618:3n

18、-618:3n-320:4n-6一般016.56.6112115171440一般1424.711.492144171246无氮1435.821.1929691159表10.D 氮缺乏培养雪藻的脂肪酸分布培养基油脂成分含量（占总脂肪酸%）主要脂肪酸组成（占总脂肪酸%）16:018:018:1n-918:1n-718:2n-618:3n-618:3n-320:4n-6无氮中性脂类8783949trtr64一般中性脂类629115610tr251无氮半乳糖脂10122541111230一般半乳糖脂19915321Tr1521无氮磷脂类3263314133329一般磷脂类19171611191725表

19、10.E 常规和缺氮培养中甘油三酯的主要分子组成分子种类（占总脂肪酸%）培养基常规培养基无氮培养基20:4/20:4/20:4214020:4/20:4/18:2171620:4/20:4/18:1182020:4/20:4/16:0111820:4/18:2/16:015220:4/18:2/18:111-20:4/18:1/18:12120:4/18:1/18:03-脂肪酸的积累与培养基中的碳氮比（C/N）有关，适当的增加碳源有利于脂肪酸的积累。我们研究了在N缺乏的培养基中加入醋酸盐对雪藻的影响，发现它对脂肪酸含量有一定的影响，但对脂肪酸组成的影响更为显著；观察到的增加最多的是18:1，增

20、加了40%，伴随着花生四烯酸的减少。运用标记法研究发现，醋酸盐的加入不仅仅影响到脂肪酸的从头合成，还影响到C16链的延长。显然的，获得的油酸盐的量太多，会在结合成甘油三酯时和花生四烯酸形成竞争，这种竞争的作用大过其合并到磷脂类进行去饱和作用。细胞密度对AA含量的影响在氮缺乏培养雪藻的过程中，低光照强度和高光照强度（35mol/m2s光子量和400mol/m2s光子量）都会导致脂肪酸含量的减少。但是，在光照强度为200mol/m2s光子量的时候，脂肪含量和花生四烯酸的比例都会上升，分别为34%（占干重）和57%（占总脂肪酸）。在经过14的发酵后，花生四烯酸的含量达到细胞干重的19%（图10.2）

21、。然而，花生四烯酸的最高生产力（mg/L）却是在全营养培养基和高光照条件下得到的，因为此时有着更高的细胞密度（图10.3）。总的来说，藻类在相对较高的光照时获得更多的甘油三酯。在对各种微藻培养生产EPA的研究中发现，相对较高的光照会获得相对较多的EPA。相反，在对雪藻进行研究的时候，在氮源充分和氮缺乏，尤其是氮缺乏的时候，高强度的光照都会使脂肪酸减少。在利用紫球藻培养生产花生四烯酸时也得到相似的结果。原因可能是，在微藻中积累的甘油三酯是作为能量贮存的，所以，高的光照强度意味着有更多的剩余光的能量转入到甘油三酯中贮存起来。在甘油三酯的脂肪酸组成中，饱和和单不饱和脂肪酸占大多数。然而，藻类却可以生

22、产富含多不饱和脂肪酸的甘油三酯，例如雪藻和紫球藻，它们可以将甘油三酯保存起来，被用来构建叶绿体脂类。这些甘油三酯主要在高细胞密度或者低光照强度下积累。雪藻（parietochloris incisa）中AA的生物合成雪藻中花生四烯酸的生物合成的研究建立在标记实验的基础上。对1-14C进行标记，发现油脂链式反应的第一步是利用细胞质油脂。卵磷脂（磷脂酰胆碱）和1，2-二酰基甘油-O-4'-(N,N,N-三甲基)高丝氨酸是油酸12和6去饱和途径的主要酰基载体，并最终形成亚油酸（18:2）和-亚麻酸（18:3n-6）。因为18:3的延长发生在羧酸端，酰基部分必须从磷脂载体上除去，以便延长到20

23、:3n-6。因为标记的20:3n-6先后在脑磷脂和卵磷脂中被发现，我们推测，这些油脂（尤其是脑磷脂）是20:3n-6的5去饱和途径转变为花生四烯酸的最有可能的载体。卵磷脂和脑磷脂这些常见分子种类的出现更是支持了上述推测。半乳糖脂（大部分是双半乳糖甘油二脂）在叶绿体7，n-6和n-3去饱和途径中充当载体的角色，这主要发生在高等植物和大部分绿色藻类中。在占优的系列上，18:1和16:0会连续的去饱和，最终形成18:3n-3和16:2n-3分子，通过与原核途径相似的途径，这也是高等植物和一些绿色藻类常用的方法。单半乳糖甘油二脂和双半乳糖甘油二脂（包括花生四烯酸）分子的真核途径的存在说明，在雪藻中，花

24、生四烯酸的生成途径与紫球藻相似。雪藻中多不跑和脂肪酸的生物合成途径见线路图10.1。有趣的是，在一些藻类中，C18和C20的去饱和途径包含两种油脂，卵磷脂和脑磷脂（或者）1，2-二酰基甘油-O-4'-(N,N,N-三甲基)高丝氨酸。在雪藻中，在不同的阶段，它分别包含上述所有的三种去饱和途径。抑制剂水杨基氧肟酸（SHAM），对12和6去饱和途径都有抑制作用。在雪藻中中，水杨基氧肟酸使18:1的含量明显增加，尤其是在卵磷脂和1，2-二酰基甘油-O-4'-(N,N,N-三甲基)高丝氨酸上，而这些油脂是C18去饱和途径的底物。另外一种抑制剂，哒嗪酮取代物SAN 9785，会阻碍绿色巴夫

25、藻(Pavlova viridis)中甘油三酯的形成。雪藻中，先前的研究表明，除草剂对甘油三酯的形成具有抑制作用，并使结合在甘油三酯中的花生四烯酸的含量由80%减少到52%，大多数本可以结合到甘油三酯中的花生四烯酸被输出到半乳糖脂中，包括单半乳糖甘油二脂和双半乳糖甘油二脂，使细胞中结合在单半乳糖甘油二脂和双半乳糖甘油二脂中的花生四烯酸含量明显的增加，分别由2%和4%增加到10%和17%（表10.F）。这些发现与我们的假设相一致，这些油脂（半乳糖脂）具有贮存花生四烯酸的功能，而甘油三酯是花生四烯酸的来源。我们推测，甘油三脂中的花生四烯酸可以利用相同的载体转化到半乳糖脂中。这种抑制作用使雪藻中甘油

26、三酯占总脂肪酸的比例由54%下降的25%。然而，甘油三酯中花生四烯酸的含量则有40%增加到58%；卵磷脂中花生四烯酸的含量增加了一倍，由21%增加到42%，结合在卵磷脂中的花生四烯酸占总花生四烯酸的比例由6%增加到11%，这更加支持了卵磷脂是甘油三酯中花生四烯酸主要来源的推测。结果显示，水杨基氧肟酸处理会抑制花生四烯酸的积累，但不会影响甘油三酯；而哒嗪酮取代物SAN 9785处理会抑制甘油三酯的形成，而不是花生四烯酸。这表明，这两个过程是相互独立的，而不必须联合使用。AA在雪藻（parietochloris incisa）中的作用 对富含多不饱和脂肪酸藻种的研究，建立在一种假说的基础上，即富含

27、多不饱和脂肪酸的甘油三酯能为快速变化的环境做出对策，使藻体存活下来。为了对上述假说进行评定，我们研究了24时从氮缺乏到恢复的过程中油脂和脂肪酸组成的变化，我们发现，在两个不同的温度，从氮缺乏到恢复的过程中，放射性标记油酸显示雪藻的中性和极性油脂的脂肪酸都进行了重分配（图10.4）。在这个回复（氮恢复）的过程中，标记的甘油三酯持续的减少，一部分转化为叶绿体脂类，包括单半乳糖甘油二脂、双半乳糖甘油二脂和硫代异鼠李糖甘油二脂。同样，在没有标记的培养中，甘油三酯消耗主要被用来支持生长，但是，叶绿体脂类的花生四烯酸含量却有一个明显的增加，主要表现在单半乳糖甘油二脂上（表10.G）。在单半乳糖甘油二脂的分

28、子种类中，20/18和20/20两种类型的含量分别由1.4和0.2g/mL增加到11.8和2.8g/mL；而18/16系列的含量并没有变化，但是不饱和度却增加了（表10.H）。同样，在雪藻培养的指数期，如果温度突然降到4，标记过的结合了大部分的花生四烯酸的甘油三酯，也转化成极性脂类。这些发现支持了我们的假说，即雪藻中富含花生四烯酸的甘油三酯的一个重要作用就是构建富含多不饱和脂肪酸的叶绿体膜，尤其是在低温时，多不饱和脂肪酸的从头生物合成太慢的条件下。的确，最近人们建议，脂质体的亚细胞作用比上述假设要复杂得多，它们相对无效的碳储存方式。这就促使我们要对极性油脂进行改造。在一些绿色藻类和高等植物中，

29、叶绿体脂质被分为两类：原核脂类和真核脂类。在原核脂类中甘油骨架sn-2位上是C16脂肪酸，记为18/16；而在真核脂类中，两个位置都是C18脂肪酸，记为18/18。我们的发现表明，在雪藻中，叶绿体油脂的产生有两种途径：第一种途径是原核途径，与16:3植物和少数几种绿色藻类类似，生产出18/16类型的分子，也就是单半乳糖甘油二脂（或许还有其它的叶绿体脂类）。另一种途径是原核途径，生产出三种类型的分子，分别是18/18、20/18和20/20，这些分子类型看来是从1，2-二酰基甘油-O-4'-(N,N,N-三甲基)高丝氨酸和卵磷脂，还有甘油三酯衍生来的（图10.5）。我们随之对构建叶绿体脂

30、质的几种方法进行了试验。发现，当环境条件不利于藻体生长的时候，例如，在稳定期或者氮缺乏时，原核途径占优势，包含了超过70%的单半乳糖甘油二脂，产生出诸如18:2n-6/16:2n-3的分子类型。在通常情况下，真核途径（真核途径）占优势，而且两种途径的n-3去饱和途径都会加强，通过原核途径和真核途径分别产生出18:3n-3/16:3n-3和18:3n-3/18:3n-3的分子类型。当培养的过程中突然要求我们要加强去饱和途径的时候，例如在最佳温度条件下从缺氮培养中恢复过来的是时候，利用1，2-二酰基甘油-O-4'-(N,N,N-三甲基)高丝氨酸和卵磷脂从头合成并不能满足需要。因为藻体的生长

31、条件可能是瞬变的，甘油三酯能迅速的释放富含花生四烯酸的酰基部分，并被输送到叶绿体中生产20:4/20:4的分子类型（真核途径）（表10.H）。花生四烯酸基部分的输入只是短暂的，在最佳条件下生长几天后，叶绿体花生四烯酸就会减少到正常水平，而原核分子类型也会恢复它的优势地位。另外一种藻类紫球藻的研究结果也相类似。当紫球藻的生态环境突然变化的时候，真核分子类型的单半乳糖甘油二脂含量由30时的42%增加到20时的58%；并且，伴随着氮的补充，通过甘油三酯中花生四烯酸的输入，产生了20/20分子类型的单半乳糖甘油二脂。最近，高等植物的脂质体被证明在种子和其它植物器官中具有代谢活性。Stobart等人证明

32、，在发育的红花种子中，微粒体膜上存在着一个甘油三酯的酰基转移机制。暴露在强光中会损害光合机制，尤其是在低温条件下，损害的主要地方是光合系统的D1蛋白质。脂肪酸的去饱和作用对忍受强光非常重要，尤其在低温时，低温会导致D1蛋白质的加速合成。雪藻的最佳生长温度是25，但是从日本分离的一个藻株能经受4的低温。通过测量氧气的演化和可调的荧光，我们发现雪藻P.incisa比紫球藻对低温共有抵抗力，它的低温耐受性几乎和极地雪藻Chlamydomonas nivalis一样高。双高-亚麻酸产品双高-亚麻酸是人体许多重要具有生理活性物质（如前列腺素、白细胞三烯）的前体，它还具有重要的药理学意义。但是目前，我们还

33、缺乏双高-亚麻酸来源和应用上的研究。与其它多不饱和脂肪酸可以在高等植物、真菌和藻类积累不同，双高-亚麻酸仅仅是花生四烯酸生物合成的中间体，它在任何生物体中都不存在。并且，在人体内，从-亚麻酸到双高-亚麻酸的转换只有在特定情况下才会出现，如低钙时，并且这种转换非常少，在这种情况下，我们不能认同-亚麻酸就和双高-亚麻酸一样。唯一报道过的双高-亚麻酸的来源是被孢霉菌。雪藻中高含量的花生四烯酸提示我们，这个有机体也可以用来生产其它多不饱和脂肪酸。因此，我们利用N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍来对雪藻进行诱变。因为花生四烯酸的一个作用就是在低温下为细胞膜提供一个高水平的不饱和状态，因此，我们选择突变株的一

34、个重要原则就是在这些条件（低温）下，那些欠缺这种转换能力的突变株。事实上，在这些突变株中，P127在-5去饱和途径上有缺陷，它几乎不能将双高-亚麻酸转化为花生四烯酸。这个突变株的发现是因为基因上一个终止密码子的出现，使得这种转化酶的功能丧失。诱变株产生很少量的花生四烯酸和高含量的双高-亚麻酸，占到总脂肪酸含量的39%以上（表10.I），占细胞干重的14%，这就使之成为生产双高-亚麻酸的潜在菌种。诱变株中油脂的分配和野生株基本相同，但是脂肪酸组成有着明显的差别。诱变株的脂类主要包括卵磷脂、脑磷脂、1，2-二酰基甘油-O-4'-(N,N,N-三甲基)高丝氨酸和花生四烯酸转化而来的双高-亚麻

35、酸。然而，在叶绿体脂类和甘油三酯中，诱变株的双高-亚麻酸含量比野生株中对应的花生四烯酸含量低得多，在甘油三酯中，双高-亚麻酸的含量是27%，但在野生株中，花生四烯酸的含量为54%，另一方面，18:1却由野生株的20%增加到43%。在单半乳糖甘油二脂（MGDG）和双半乳糖甘油二脂（DGDG）两种半乳糖脂中，双高-亚麻酸的减少是由n-3去饱和途径的加强导致的，并最终导致16:3和18:3含量的增加。实际上，诱变株的单半乳糖甘油二脂和双半乳糖甘油二脂主要由原核的18/16和真核的18/18分子种类组成，这就使n-3去饱和途径的脂肪酸占优势。我们推测，野生株叶绿体脂类的双高-亚麻酸和不饱和脂肪酸的减少

36、是由原核和真核类型1的分子种类的增加和n-3去饱和途径的加强导致的。所以，低温下，突变株的生长能力比野生株的低。双高-亚麻酸的生产率野生株中，双高-亚麻酸的含量比野生株中花生四烯酸少，而C18（主要是18:1和18:2）脂肪酸的比例则出现增加。这尤其重要，因为这两种脂肪酸通常会损害双高-亚麻酸，而自身在甘油三酯中积累。这就要求我们要仔细衡量环境条件对双高-亚麻酸含量和C18/双高-亚麻酸比率的影响。氮缺乏会导致总脂肪酸和双高-亚麻酸含量的增加，而磷酸盐缺乏会导致一些脂肪酸含量的增加和双高-亚麻酸含量的减少。另一方面，增加十倍浓度的磷促进了生物量的增加和双高-亚麻酸含量的增加，并且，还会导致C18/双高-亚麻酸比率的下降。缓冲剂的加入减弱了pH的影响，并使脂肪酸含量由34%增加到42%，双高-亚麻酸的比例也由28%增加到35%，总双高-亚麻酸含量由10%增加到15%。并且，18:1和