高中生物选修1生物技术实践复习知识梳理2总结

1、选修1生物技术实践知识梳理专题一 课题1 果酒和果醋的制作【补充知识】发酵1、概念：利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体及各种不同代谢产物的过程.2、类型：（1）根据是否需要氧气分为：需氧发酵和厌氧发酵。（2）根据产生的产物可分为：酒精发酵、乳酸发酵、醋酸发酵等。一、基础知识（一）果酒制作的原理酶酶1菌种是酵母菌，属于真核生物，新陈代谢类型异养兼性厌氧型，有氧时，进行有氧呼吸，大量繁殖（以出芽生殖为主），反应式为：C6H12O6+6H2O+6O2 6CO2+12H2O+能量；无氧时，能进行酒精发酵，反应式为：C6H12O6 2C2H5OH+2CO2+能量。2酵母菌繁殖的最适温

2、度20左右，酒精发酵一般控制在1825。3自然发酵过程中，起作用的主要是附着于葡萄皮上的野生型酵母菌。（二）果醋制作的原理1菌种是醋酸菌，属于原核生物，新陈代谢类型为异养需氧型。只有在氧气充足时，才能进行旺盛的生命活动。变酸的酒表面观察到的菌膜就是醋酸菌在液面大量繁殖形成的，其繁殖方式为分裂生殖。酶2当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸，当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，反应简式为C2H5OH+O2 CH3COOH+H2O。3醋酸菌的最适生长温度为3035。4菌种来源：到生产食醋的工厂或菌种保藏中心购买，或从食醋中分离醋酸菌。二、实验流程图挑选葡萄 冲洗 榨

3、汁 酒精发酵 果酒（醋酸发酵果醋）三、操作提示（一）材料的选择与处理选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗（冲洗的目是洗去灰尘，且不要太干净，以防止洗去野生型酵母菌），然后再除去枝梗。（二）防止发酵液被污染1、榨汁机要清洗干净，并晾干。2、发酵瓶要清洗干净，用体积分数70%的酒精消毒。3、装入葡萄汁后，封闭充气口。（三）控制好发酵条件1、葡萄汁装入发酵瓶时，要留出大约1/3的空间（目的是先让酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖，耗尽O2后再进行酒精发酵；同时可防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出）。2、制作葡萄酒过程中，将温度严格控制在1825，时间控制在1012d左右，可通过出料口对发酵的情况进行

4、及时的监测。3、制作葡萄醋的过程中，将温度严格控制在3035，时间控制在78d左右，并注意适时通过充气口充气。四、课题延伸（一）如何判断果酒的制作是否成功？1、发酵后取样，通过嗅味或品尝进行初步鉴定；2、显微镜观察酵母菌数量变化进行鉴定；3、，用重铬酸钾来检验是否有酒精产生。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。检测时，先在试管中加入发酵液2mL，再滴入物质的量的浓度为3mol/L的H2SO43滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴。（二）如何判断果醋的制作是否成功？1、通过嗅味或品尝进行初步鉴定；2、显微镜观察醋酸菌数量变化进行鉴定；3、检测发酵前后的PH作进一步鉴定。【教

5、材答案】（一）旁栏思考题 1.你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？答：应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。 2.你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？提示：葡萄应先冲洗、再去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净；每次排气时只需拧松瓶盖、不要完全揭开瓶盖等。 3.制葡萄酒时，为什么要将温度控制在1825 ？制葡萄醋时，为什么要将温度控制在3035 ？答：温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20 左右最适合酵母菌繁殖。因此需要将温度控制在其最适温度范围内。而醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为3035 ，因此要将温度控制在3035 。 4.制葡萄醋时，为什么

6、要适时通过充气口充气？答：醋酸菌是好氧菌，在将酒精变为醋酸时需要氧的参与，因此要适时向发酵液中充气。（二）资料发酵装置的设计讨论题请分析此装置中的充气口、排气口和出料口分别有哪些作用。为什么排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接？结合果酒、果醋的制作原理，你认为应该如何使用这个发酵装置？答：充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出CO2的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是防止空气中微生物的污染。使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接气泵，输入氧气。五、查漏补缺专题二 课题一 微生物的实验室培养1、培养基：

7、人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。培养基按照物理性质可分为液体培养基（主要用于工业生产）、半固体培养基（观察细菌运动、鉴别菌种）和固体培养基（主要用于菌种的分离、计数、鉴别）。在液体培养基中加入凝固剂琼脂后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。菌落是菌种鉴定的重要依据。按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴别培养基。培养基的化学成分包括：水 、无机盐、碳源、氮源、（生长因子）等。 无机碳源不能为微生物提供能量； 含碳有机物是异养型微生物的碳源和能源； 无机氮源NH3既是硝化细菌的氮源，也是其能源；N2是固氮菌（如根瘤菌

8、）的氮源。2、无菌技术：获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。3、消毒与灭菌的区别消毒：指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部一部分微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒常用煮沸消毒法、巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）、化学药剂消毒、紫外线消毒。灭菌：则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干

9、热灭菌、高压蒸汽灭菌。灭菌方法：接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱；培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。 （4）消毒与灭菌的共同点：都需借助理化性质营造微生物难以生存的不良环境； 其作用原理都是通过使蛋白质变性来抑制微生物的生命活动或杀死微生物。4、制作牛肉膏蛋白胨固体培养基方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。 称量：牛肉膏黏稠，用称量纸称取；牛肉膏、蛋白胨易吸潮，称取要快、加盖。 溶化：牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解取纸蛋白胨、NaCl琼脂补水定容调pH。 思考：溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一

10、起加热? 答：可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中,减少误差 倒平板：待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。【教材答案】 1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？答：还能有效避免操作者自身被微生物感染。 2.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。 3.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 4.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝

11、固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 5.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。5、 纯化大肠杆菌 微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。 平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体（菌落）。 稀释涂布平板法是将菌液进行一

12、系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。 用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。 平板划线法操作步骤：详见教材 平板划线操作的讨论：为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过

13、划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 稀释涂布平板法中涂布平板操作的步骤：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。取少量菌液，滴加到培养基表面。 将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却810s。 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。 （8）平板划线法与稀释涂布平板法各自的优缺点是什么？共同点：都能使细菌纯化；不同点：平板划线法不易分离出单个菌落，不能计数；稀释涂布平板法能使单菌落分离，便于计数。优缺点： 稀释涂布平板法统计样品中的数目往往比实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在

14、一起时，平板观察到的只是一个菌落。6、 菌种培养 将接种后的培养基和一个未接种的培养基（起对照作用）一起放入37恒温箱中培养，分别观察并记录结果。7、菌种的保存对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。（于4的冰箱中保藏。缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。） 对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。（菌液与甘油充分混匀后放在-20的冷冻箱中保存。）8、查漏补缺专题二 课题二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、课题背景尿素-是一种重要的农业氮肥，但尿素不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为

15、它们能合成脲酶。二、筛选菌株（1）实验室中微生物的筛选应用的原理人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。（2）选择培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。加入青霉素的培养基：细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长；不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物；加入高浓度的食盐的培养基：可选择培养金黄色葡萄球菌等。三、统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。（2）显微镜直接计数法缺点:不能区分死菌与活菌.【例】每一个大方格边长为 1mm ，则每一

16、大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数是多少?1ml菌液中的总菌数?(1ml=1cm3=1000mm3）【答案】 5A 5AB×104（3）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目（又叫间接计数法或活菌计数法）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。公式：每mL样品中的菌株数=（C÷V）×M；C代表计数的平均菌落数，V代表涂布平板时所用

17、的稀释液体积，M代表稀释倍数。为了保证结果准确，一般设置35个平板（至少3个），选择菌落数在30300的平板进行计数，并取平均值。 缺点：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。四、设置对照设置对照的主要目的是:排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。五、实验设计（1）土壤取样：从富含有机物、潮湿、pH7的土壤中取样。铲去表层土3cm左右，在距地表约38cm的土壤层取样。（2）制备培养基：分别配置牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基。（牛肉膏蛋白胨培养基作为对

18、照,用来判断选择培养基是否起到了选择作用）（3）样品的稀释和涂布：在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板。 测定土壤中细菌的数量，一般选用104 、 105 、 106倍的稀释液进行平板培养； 测定放线菌的数量，一般选用103 、 104 、105倍的稀释液进行平板培养； 测定真菌的数量，一般选用102 、 103 、104倍的稀释液进行平板培养；（4）微生物的培养: 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。 细菌 3037 12天 放线菌 2528 57天 霉菌 2528 34天(5) 计数：每隔24小时统计一次菌落数

19、目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。六、操作提示 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 应在火焰旁称取土壤10 g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。 实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。 为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间。7、 菌种鉴定在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强，PH升高。因此，我们可以通过检测培养基pH变化来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮

20、源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。八、查漏补缺专题三 课题一 菊花的组织培养一、植物组织培养的概念 1、概念：植物的组织培养又叫离体培养，是指在人工培养基上，离体培养植物的器官、组织或细胞，并使其生长、增殖、分化以及再生出植株的技术。 2、植物组织培养的原理：植物细胞的全能性。 3、细胞全能性的概念：指已分化的细胞具有发育成完整个体的潜能。 4、细胞具有全能性的原因：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因.二、植物组织培养的基础知识 1、细胞分化：在生物个体发育过程中，细胞在形态、

21、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程。细胞分化过程中遗传物质没有改变，其实质是基因选择性表达。 2、愈伤组织：细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。 3、由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。 4、脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。 5、植物组织培养的过程： 三、影响植物组织培养的因素1、外植体选取： （1）不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。容易无性繁殖的植物，容易进行组织培养。 （2）植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。 （3）菊花组织培养一般

22、选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝作材料。2、培养基的营养成分： （1）植物组织培养常用的培养基是MS培养基。 （2）MS培养基的主要成分： 大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S； 微量元素：B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co； 有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等； 植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素等； （3）各种营养物质的作用：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞对特殊营养的需求。 （4）同微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？ 【答】微生物培养基以有机

23、营养为主，MS培养基则需提供大量无机营养。3、植物激素： （1）植物组织培养的关键性激素是生长素和细胞分裂素。 （2）在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。 （3）生长素和细胞分裂素的使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但细胞不分化先使用细胞分裂素，后使用生长素细胞既分裂也分化同时使用分化频率提高生长素 细胞分裂素比值与结果比值高时促根分化，抑芽形成比值低时促芽分化，抑根形成比值适中促进愈伤组织生长 （4）植物组织培养至少使用三种培养基：脱分化培养基、生芽培养基、生根培养基。4、PH、温度、光等环境条件： 不同的植

24、物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将pH控制在58左右，温度控制在1822，并且每日用日光灯照射12h. 四、实验操作 配制MS固体培养基： 配制各种母液：大量元素浓缩10倍、微量元素浓缩100倍、用量较小的有机物一般按1mg/ml的质量浓度单独配置成母液。使用时根据母液的浓缩倍数，计算用量，并加蒸馏水稀释。 配制培养基：在菊花组织培养中，可以不添加植物激素，因菊花茎段组织培养比较容易。 灭菌：采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。 外植体的消毒： 流水冲洗少许洗衣粉软刷刷洗流水冲洗20分钟无菌纸吸干70%酒精摇动23次无菌水冲洗无菌纸吸干0.1%氯化汞12分钟无菌水冲洗至少三次，漂

25、净消毒液 接种：接种过程中插入外植体时形态学上端朝上，不要倒插。每个锥形瓶接种68个外植体。外植体接种与细菌接种相似，操作步骤相同，而且都要求无菌操作。 培养：应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度（1822）和光照（12h） 移栽：栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。 栽培 五：外植体在培养过程中被污染的可能原因： 外植体消毒不彻底； 培养基灭菌不彻底； 接种中被杂菌污染； 锥形瓶密封性差等。6、 查漏补缺专题四 课题一 果胶酶在果汁生产中的作用一、酶的

26、基础知识 1、酶的概念：酶是活细胞所产生的具有生物催化作用的一类特殊的有机物； 2、酶的本质：蛋白质（大多数）或RNA；酶的组成单位：氨基酸或核糖核苷酸； 3、酶的功能及原因：酶具有催化作用，因为酶能降低化学反应的活化能。 4、酶的特性：高效性、专一性、需要适宜的条件二、果胶和果胶酶 1、制作果汁要解决两个主要问题：一是果肉的出汁率低，耗时长；二是榨取的果汁浑浊、黏度高，容易发生沉淀。人们使用果胶酶、纤维素酶等来解决上述问题。 2、果胶：是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一，不溶于水，在果汁加工中，既影响出汁率，又使果汁浑浊。 3、果胶的基本组成单位（单体）：半乳糖醛酸。 4、果胶酶的作用

27、：将果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸，瓦解植物的细胞壁及胞间层，并且使果汁变得澄清。 5、果胶酶是一类酶总称，包括果胶分解酶 、多聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶等。 6、产生果胶酶的生物：植物、霉菌、酵母菌和细菌均能产生果胶酶；【小贴士】由于原核生物的细胞壁的主要成分是肽聚糖，真菌细胞壁的主要成分是几丁质，因此这两类生物的细胞壁均不能用纤维素酶和果胶酶除去。三、酶的活性与影响酶活性的因素 1、酶的活性：是指酶催化一定化学反应的的能力；酶活性的高低可以用反应速度来表示。 2、酶反应速度：用单位时间内、单位体积中反应物的减小量或产物的增加量来表示。 3、影响酶活性的因素：温度 、PH、酶的抑制剂等；当酶处于

28、最适温度或最适pH时，酶的活性最高；若温度过高、过酸或过碱，则导致酶变性失活。四、实验设计-探究温度对酶活性的影响 此实验的自变量是温度；根据单一变量原则，应确保各实验组相同的变量有PH、底物浓度底物量、实验器材、酶的用量等等 果胶酶的最适温度为4550 ，设置温度时，要以4550 为中心设置温度梯度,例30、35、40、45、50、55、60、65。 为什么在混合苹果泥和果胶酶之前，要将苹果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理？【答】将苹果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理,可以保证底物和酶在混合时的温度是相同的,避免了苹果泥和果胶酶混合时影响混合物的温度,从而影响果胶酶活性的问题。 果胶

29、酶的活性是通过相同反应时间内产生的果汁的体积来体现的。（因为：在一定范围内，果肉的出汁率和果汁的澄清度与果胶酶的活性成正比）5、 查漏补缺专题五 课题3 血红蛋白的提取和分离一、基础知识（一）凝胶色谱法1、凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。2、凝胶是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖或琼脂糖。3、凝胶小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短

30、，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。（二）缓冲溶液1、缓冲溶液的作用：能够抵制外界酸或碱对溶液PH的影响，维持PH基本不变。2、缓冲溶液通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成的，如NaH2PO4 / Na2HPO4。3、生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了能够在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。凝胶色谱法中缓冲溶液用于维持蛋白质的状态，凝胶电泳法中缓冲溶液使蛋白质带上电荷。（三）电泳1、电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。2、在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。3、电泳利用了待分离样

31、品中各分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。4、两种常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，在凝胶中加入SDS，电泳速率完全取决于分子大小，因此，在测定蛋白质分子量时通常使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。5、聚丙烯酰胺凝胶-由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺聚合而成，蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。6、SDS的作用：使蛋白质完全变性并解聚成单条肽链，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质自身电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别。7、SDS-聚丙烯酰胺

32、凝胶电泳：电泳迁移率完全取决于分子的大小。二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。（一）样品处理1、红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白（血浆蛋白）。采集血样、加抗凝剂柠檬酸钠； 低速短时间离心（500r/min、2min）；【目的：防止白细胞等一同沉淀，达不到分离效果】吸出上层黄色血浆，将下层暗红色的红细胞倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水（质量分数为0.9%），缓慢搅拌10min；低速短时间离心，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。2、血红蛋白的释放：添加蒸馏水和甲苯（溶解细胞膜），充分搅拌，使红细胞破裂释放出血红蛋白。3、

33、分离血红蛋白溶液：高速长时间离心（2000r/min、10min），试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明的血红蛋白水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。（二）粗分离-透析1、原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。2、目的：去除血红蛋白水溶液中的分子量较小的杂质。3、方法：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液（PH7.0）中，透析12h。透析可以

34、去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。4、思考：为尽快达到理想的透析效果，应如何操作？ 【答】增加缓冲溶液的量；及时更换缓冲溶液。（三）纯化-凝胶色谱操作1、制作凝胶色谱柱 玻璃管的高度与分离度有关（要求：40CM）； 玻璃管直径大小不影响分离效果，但直径过大将造成洗脱液体积过大，使样品稀释度变大；2、装填凝胶色谱柱 凝胶的选取：交联葡聚糖凝胶（G-75），G表示凝胶的交联程度、膨胀程度和分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 配置凝胶悬浮液：为加速膨胀，可使用沸水浴加热，这种方法不但节约时间，还可以除去凝胶中的微生物、排除凝胶内的空气。 装填时将凝胶悬浮液

35、要一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时要轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀，色谱柱内不得有气泡存在，一旦发现，必须重装。（“气泡”会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。） 装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300mL物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液（PH7.0）充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。【提示】如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。3、样品的加入和洗脱准备：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的的缓冲液与凝胶面平齐，关闭出口。加样：用吸管小

36、心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。加样后打开下端出口，直到样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱：小心加入物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液（PH7.0）到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。【提示】如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。（4） 纯度鉴定：SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳三、查漏补缺专题六课题二胡萝卜素的提取1、 基础知识1、 胡萝卜素性质： 橘黄色结晶，化学性质比较稳定，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂。2、 胡萝卜素分类： 依据碳碳双键的数目划分为、 三类，其中最主要的组成成分为-胡萝卜素。3、 胡萝卜素作用： 治疗夜盲症、幼儿生长发育不良、干皮症等疾病；食品色素；使癌变细胞恢复成正常细胞。4