番茄抗性基因Ty-2和Ph-3多重PCR的检测应用

1、番茄抗性基因Ty-2和Ph-3多重PCR的检测应用番茄抗性基因Ty-2和Ph-3多重PCR的检测应用林涛 蔡锦玲 郑凯玲 2.4 多重PCR体系的验证与应用用该多重PCR 技术，对24 份番茄材料进行2个基因Ty-2和Ph-3的基因型鉴定图3，编号124表示材料801824。材料1、5、8和14带型相同，有550、350 和260 bp 大小的3 条带，其基因型为双抗。材料2、4、13和20均有800、260 bp大小的2条带，说明它们的基因型为ty-2/ty-2、Ph-3/Ph-3;材料3显示的4条带，可知其基因型为Ty-2/Ty-2、Ph-3/ph-3;材料6、7、912这6份材料仅有80

2、0、500 bp大小的2条带，说明它们的基因型为双感;编号1519和2123共8份材料，显示了相同的5条带，说明其基因型为Ty-2/ty-2、Ph-3/Ph-3;材料24的带型说明它的基因型是ty-2/ty-2、Ph-3/ph-3。结合表2，单引物一般PCR鉴定可得材料1、3、5、8和14这5份材料含纯合Ty-2 基因;7、1519和2123这9份材料有2条带，说明其含杂合Ty-2基因;800 bp的单条带说明剩余的10份材料基因型是ty-2/ty-2图4。番茄晚疫病Ph3基因CAPS标记结果如图5，含有Ph3纯合抗病基因型的材料含有酶切位点，PCR产物酶切后会产生260 bp的特异条带，杂合

3、基因型材料酶切后有500 bp和260 bp的2条特异条带，而纯合感病基因型材料酶切后只有1条长度为500 bp的条带。材料6、7和912这6份材料显示只有500 bp的单条带，含纯合感病基因;2份材料有2条带，说明材料3和24含杂合Ph-3基因;其他16份材料均含有纯合抗病基因。上述多重PCR技术检测的材料基因型与单引物一般PCR分别检测所获的基因型进行综合比对，两者最终结果一致，说明选用SCAR标记T0302引物和CAPS标记TG328引物，同时检测Ty-2、Ph-3基因的多重PCR 体系可行性得到进一步验证。结合图2和图3，实际运用读图时，带型显示为6条带的双杂材料和显示800 bp和5

4、00 bp这2条带的双感材料首先淘汰，材料双抗基因型组合的带型显示为3 条带550、350和260 bp 优先入选，再依据这2个基因的优先顺序进行读图及材料选留，如以检测Ty-2基因优先时先找无800 bp条带的带型，以检测Ph-3基因优先时先找无500 bp条带的带型，这样很简单通过读图推断筛选到目标基因型的材料。3 结论与商量为快速精确地鉴定筛选到番茄抗性目标基因，要求检测技术必需具有可靠性和操作的便利性。该讨论在多重PCR 体系优化讨论过程中，对Taq酶含量、2对引物的正反引物浓度、退火温度、PCR扩增循环数，及酶切反应中酶用量和反应时间等条件进行摸索。最终确定多重PCR反应体系为20

5、L：2×EasyTaq PCR SuperMix+dye 10 L，SCAR标记正反引物各0.4 L 10 mmol/L，CAPS标记正反引物各0.2 L 10 mmol/L，DNA 模板1 L 100 ng，ddH2O 补足至20 L。PCR 扩增程序中退火温度为56 ，时间1 min，酶切时间调整为10 min，其他条件不变。同时使用2个共显性分子标记的2对引物扩增时，酶切前对扩增产物没有影响，产物经酶切后，可清晰辨别出最多有6条带，而且每个带型条带间距适当、简单区分不同的带型。通过带型可知该多重PCR体系酶切反应，对Ph-3基因的扩增产物酶切结果不变，与该基因单引物一般PCR技

6、术鉴定所得的条带大小相同;而Ty-2纯合抗病基因型900 bp的条带酶切成550和350 bp的2条带、杂合基因型酶切后有900、800、550和350 bp的4条带，但对基因型Ty-2/ty-2和ty-2/ty-2的800 bp的条带没有影响，因此仍可通过带型推断它们的基因型。此多重PCR检测显示结果说明，共有9种带型对应相应的基因型，与单引物一般PCR分别鉴定的基因型综合分析后的结果一致。分子標记技术进展很快，李宗俊等18接受托付专业机构检测的方式，使用第三代分子标记技术，利用KASP标记基于已知SNP 检测来帮助番茄育种。然而短期内多数育种者在学习利用新技术的同时，充分应用已有设备和相应技术还是必经阶段。该多重PCR体系的基础是第二代分子标记技术，在实践中，即使带型中部分条带显色较弱，只