微卫星DNAPCR扩增结果示例学习教案

1、会计学1微卫星微卫星DNAPCR扩增结果扩增结果(ji gu)示例示例第一页，共61页。 由于基因诊断的发展时间还不长，人类对基因的了解还有许多空白，因此许多疾病的诊断还主要依赖于传统的方法，但随着(su zhe)分子遗传学、分子生物学，特别是人类基因组计划的完成，基因诊断将显示出强大的生命力。第2页/共61页第二页，共61页。传统的诊断传统的诊断(zhndun)（举例）：（举例）：、问、望、听、触经验型诊断、化验/检验材料：细胞、组织、大分子、小分子、代谢/排泄物等。方法：细胞学、微生物学(wi shn w xu)、生物化学、免疫学、病理学等。、影像学X光、B超、CT、核磁共振、内窥镜等。、

2、特殊检查染色体检查、肌电/心电/脑电、骨密度等。 在医学发展的过程中，这些方法发挥了巨大作用，随着技术水平的发展，这些方法也在不断提高(t go)和完善，也还会有其他新的诊断方法的问世。这些诊断有一个无法逾越的鸿沟：预测也就是说“发病”了才能诊断。第3页/共61页第三页，共61页。基因诊断基因诊断(zhndun)的对象的对象1、病原生物的侵入，如流感、肝炎、艾滋病2、单基因遗传性疾病， 如苯丙酮尿症、无丙种球蛋白血症3、多基因疾病，如肿瘤、高血压 4、其它，如亲子鉴定、个体识别(shbi)、法医物证第4页/共61页第四页，共61页。遗传遗传(ychun)标记标记1、第一代遗传标记(bioj)限

3、制性酶切片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)8kb5kb3kb在个体和群体(qnt)中，片段长度表现出多态性。如3kb, 5kb, 7kb, 8kbRFLP呈现孟德尔式遗传。常用检查方法：核酸杂交；PCR-酶切等。第5页/共61页第五页，共61页。产生多态性的原因(yunyn)是内切酶位点的变化。原位点的消失；新位点的产生。GAATTCCTTAAGGATTTCCTAAAG1 21 2III2kb3kb5kb7kb第6页/共61页第六页，共61页。2、第二代遗传标记微卫星DNA(Micro-satellite DNA) 属

4、高度重复序列，重复单元26bp，重复区大多几十几百bp，分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。呈现(chngxin)孟德尔式遗传。目前微卫星DNA已经发现了万余个位点。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG常用(chn yn)检查方法：PCR等。第7页/共61页第七页，共61页。微卫星微卫星DNA PCR扩增结果扩增结果(ji gu)（示例）：（示例）：500bp400bp300bp240bp 该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有4种。 微卫星DNA差异(chy)

5、最小只相差2个碱基（重复片段只有2个碱基）。第8页/共61页第八页，共61页。2、第三代遗传(ychun)标记单核苷酸多态性(SNP) 某些DNA位点上，单个碱基存在着变化。如：AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCTAATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCTAATGGCATAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCGGCT个体(gt)A个体(gt)B个体(gt)C SNP分布于整个基因组，可在基因内，也可在基因间。估计每1000个bp存在一个。在人类DNA序列(xli)变异中，SNP占90%。 单个碱基的插入和缺失不认为是SNP。

6、目前已知基因组中含有150万个SNP第9页/共61页第九页，共61页。对于人类来说，SNP的意义在于：、致病SNP、疾病(jbng)易感性SNP、具有诊断价值的SNP、疾病(jbng)的SNP谱、人表型相关SNP、药物作用与不良反应的SNP、药物剂量SNP目前SNP研究的两个(lin )热点：、cDNA上的SNP（cSNP）、启动子上的SNP第10页/共61页第十页，共61页。芯片杂交(zjio)结果示意图A C G T位点1位点2位点3常用检查方法：DNA测序、芯片(xn pin)杂交等。第11页/共61页第十一页，共61页。基因基因(jyn)(jyn)变异的类型变异的类型1、点突变）单个碱

7、基置换）单个碱基的缺失或插入2、片段缺失编码片段；调节序列3、片段插入编码片段；调节序列4、重排融合基因5、扩增拷贝大量增加6、动态突变遗传物质传递过程(guchng)中不等交换使STR重复数增加第12页/共61页第十二页，共61页。基因诊断的技术基因诊断的技术(jsh)方法方法Southern 杂交(zjio)第13页/共61页第十三页，共61页。Northern 杂交(zjio)第14页/共61页第十四页，共61页。Western印迹(yn j)中蛋白电泳第15页/共61页第十五页，共61页。PCR原理(yunl)第16页/共61页第十六页，共61页。PCR原理(yunl)变性(binxn

8、g)第17页/共61页第十七页，共61页。PCR原理(yunl)复性(f xn)第18页/共61页第十八页，共61页。PCR原理(yunl)延伸(ynshn)第19页/共61页第十九页，共61页。PCR原理(yunl)变性(binxng)第20页/共61页第二十页，共61页。PCR原理(yunl)复性(f xn)第21页/共61页第二十一页，共61页。PCR原理(yunl)延伸(ynshn)第22页/共61页第二十二页，共61页。PCR原理(yunl)变性(binxng)第23页/共61页第二十三页，共61页。PCR原理(yunl)复性(f xn)第24页/共61页第二十四页，共61页。PCR

9、原理(yunl)延伸(ynshn)第25页/共61页第二十五页，共61页。 DNA以指数形式扩增以指数形式扩增(2n)，其中长片段，其中长片段(pin dun)以线性形式扩增以线性形式扩增 (2n+2)，最终主产物片段，最终主产物片段(pin dun)长度在两个引物之间。长度在两个引物之间。预变性(binxng)(92-95C,2-5m)变性(binxng)(92-95C,30s)复性(40-60C,30s)延伸(72C,30-60s)总延伸(72C,7m)(25-35)PCR的一般过程：的一般过程：经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。2401625611452228200

10、短片段（单链）1412108642长片段（单链）128643216总片段（单链）循环数第26页/共61页第二十六页，共61页。等位基因特异性寡核苷酸杂交(zjio)（allele-specific oligonucleotide，ASO ） 当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时需要合成两种或两种以上的探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与

11、突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来. PCR可结合ASO，即PCRASO技术(jsh)，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。第27页/共61页第二十七页，共61页。异常(ychng)探针 T A G正 常 人 患 者(hunzh) DNA DNA点杂交(zjio)正常探针 G A G正常人 患者 DNA DNA点杂交第28页/共61页第二十八页，共61页。单链构象单链构象(u xin)(u xin)多态性多态性PCR (S

12、SCP-PCR)PCR (SSCP-PCR)DNA分子在电泳中的行为取决于分子量和分子构象。DNA单链的构象取决于序列。PCR产物变形后于中性胶中电泳，与正常对照(duzho)比较，若电泳行为异常，则认为内含突变的碱基。第29页/共61页第二十九页，共61页。对照对照(duzho) 实验实验第30页/共61页第三十页，共61页。等位基因特异性等位基因特异性PCR(Allele-Specific PCR(Allele-Specific PCR, AS-PCR)PCR, AS-PCR)利用(lyng)末端突变的引物进行PCR。实际应用中，常使用三个引物：A35G3553正常(zhngchng)上游

13、引物正常(zhngchng)下游引物突变上游引物使用正常引物，在正常人有扩增，异常人无扩增。使用突变引物，在异常人有扩增，正常人无扩增。（严格条件下的PCR）第31页/共61页第三十一页，共61页。O碱基碱基CPOHH12345O碱基碱基CPOHH12345OH脱氧核苷酸的连接脱氧核苷酸的连接(linji)DNA测序测序第32页/共61页第三十二页，共61页。O碱基碱基CPOH12345O碱基碱基CPOHH12345H2O脱氧核苷酸的连接脱氧核苷酸的连接(linji)第33页/共61页第三十三页，共61页。O碱基碱基CPHH12345O碱基碱基CPOHH12345OHX双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸

14、?第34页/共61页第三十四页，共61页。四套反应四套反应(fnyng)体系体系1-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddATP2-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddCTP3-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddGTP4-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddTTPATGCGGTACCAT53测序模板5 TA5TACGCCA5TACGCCATGGTACCC第一套反应第二套反应555第35页/共61页第三十五页，共61页。ACGTATGGTACCGCAT第36页/共61页第三十六页，共61页。DNA自动测序第37页/共

15、61页第三十七页，共61页。荧光荧光(ynggung)(ynggung)原位杂交原位杂交(Fluorescence in situ (Fluorescence in situ Hybridization,FISH)Hybridization,FISH) 利用生物素或地高辛等非放射性物质标记(bioj)探针，并通过荧光素偶联得抗原-抗体检测系统，在组织、细胞及染色体上对DNA或RNA进行定性或定位分析。标记(bioj)物：脱氧尿嘧啶三磷酸Bio-11-dUTP(生物素) Dig-11-dUTP(地高辛)标记(bioj)方法：缺口平移法，随机引物法。第38页/共61页第三十八页，共61页。荧光(y

16、nggung)标记原位杂交原理示意图第39页/共61页第三十九页，共61页。染色体FISH探针(tn zhn)整条染色体涂染探针染色体重复(chngf)序列探针染色体专一位点探针基本(jbn)过程：1、染色体标本制备2、探针制备3、杂交4、显微观察（染色体分带）第40页/共61页第四十页，共61页。整条染色体涂染第41页/共61页第四十一页，共61页。通过(tnggu)整条染色体涂染判断易位染色体第42页/共61页第四十二页，共61页。染色体重复(chngf)序列探针第43页/共61页第四十三页，共61页。染色体专一位点探针(tn zhn)第44页/共61页第四十四页，共61页。荧光标记探针(

17、tn zhn)检测精子第45页/共61页第四十五页，共61页。引物原位标记技术引物原位标记技术( (Primed in situ Primed in situ Labeling, PRINS)Labeling, PRINS) 针对染色体的特异性-卫星DNA 序列设计和合成引物。 利用未标记的寡核苷酸引物与变性后的染色体DNA特异结合(jih), 然后用荧光素标记的脱氧核苷酸(dUTP)与未标记的脱氧核苷酸一起在DNA聚合酶的作用下进行延伸反应,标记了的dUTP将以碱基配对的形式掺入到新合成的DNA单链中, 最后用相应的荧光抗体与标记物结合(jih)以显示检测结果。 第46页/共61页第四十六页

18、，共61页。应用21号染色体特异性卫星(wixng)DNA与间期细胞核杂交，显示21号染色体的数目。第47页/共61页第四十七页，共61页。基因诊断基因诊断(zhndun)实例实例丙型肝炎丙型肝炎(HCV)基因基因(jyn)诊断实例诊断实例丙型肝炎为RNA病毒(bngd)，9500mer，编码3011-3033个氨基酸，具有高变异性。基因组组成：E1NS2NS3NS43-NCRCNS1/E2NS15-NCR高变异区（编码衣壳和包膜蛋白）（NCR: 非编码区） 5-NCR为保守的区域，将引物设计在该区域，进行RT-PCR, 可特异性的扩增HCV。PCR引物：+: 5-GATTCTCGAGGCGA

19、CACTCCACCATAGAT-: 5-ATACTCGAGGTGCACGGTCTACGAGACCTPCR产物长度为322bp第48页/共61页第四十八页，共61页。第49页/共61页第四十九页，共61页。第50页/共61页第五十页，共61页。第51页/共61页第五十一页，共61页。DXS52位点多态性诊断位点多态性诊断(zhndun)甲型血友病甲型血友病 DXS52位点的微卫星DNA与Xq28位点紧密(jnm)连锁，甲型血友病的基因位点也在此区域，因此可以通过DXS52间接诊断血友病。 DXS52在群体(qnt)中的类型： 0.7，1.3，1.39，1.57，1.63，1.69，2.1，2.4kb。引物序列：5-GGCATGCATCACTTCTCTCATGTT5-CACCACTGCCCTCACGTCACTT第52页/共61页第五十二页，共61页。家系I第53页/共61页