分子生物学-第5章 基因的表达与调控(上)dd

1、第六章 基因的表达与调控(上)原核基因表达调控模式自然选择倾向于保留高效率的生命过程。在每30分钟增殖一次的109细菌群体中，若一个细菌变成29.5分钟增殖，经过80天的连续生长后，这个群体中的99.9%都将具有29.5分钟增殖一倍的生长速度。原核生物细胞的基因和蛋白质种类较少，如大肠杆菌基因组约为4.20106bp共有4 288个开放读码框（表6-1）。据估计，一个细胞中总共含有107个蛋白质分子。表6-1 大肠杆菌、伤寒杆菌和尿殖道支原体基因组中的基因总量比较与功能分析基 因 数大肠杆菌伤寒杆菌尿殖道支原体总读码框数氨基酸合成分类辅基等的合成核苷酸合成细胞膜合成与装配能量代谢其它合成代谢脂

2、肪代谢DNA复制、重组和修复蛋白质结构调控蛋白转录翻译吸收与运转4288131103582372431884811591785518242717276854538411230258766427141123470151917316632771210134每个大肠杆菌细胞有约15 000个核糖体，50种核糖体蛋白、糖酵解体系的酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等都是代谢过程中必需的，其合成速率不受环境变化或代谢状态的影响，这一类蛋白质被称为永久型（constitutive）合成的蛋白质。另一类则被称为适应型或调节型（adaptive or regulated），因为这类蛋白质的合成速率明显地受环境的影

3、响而改变。如大肠杆菌细胞中一般只有15个-半乳糖苷酶，但若将细胞培养在只含乳糖的培养基中，每细胞中这个酶的量可高达几万个分子。6. 1 原核基因表达调控总论随着生物个体的发育，DNA分子能有序地将其所承载的遗传信息，通过密码子-反密码子系统转变成蛋白质，执行各种生理生化功能。科学家把从DNA到蛋白质的过程称为基因表达（geneexpression），对这个过程的调节就称为基因表达调控（gene regulation或genecontrol）。图6-1基因表达的第一步是由RNA聚合酶拷贝DNA双链中的模板链，生成与该序列完全互补的RNA链。基因表达调控主要表现在以下二方面：转 录 水 平 上 的

4、 调 控 （ transcriptionalregulation）；转录后水平上的调控（post-transcriptionalregulation），包括（1）mRNA加工成熟水平调控（differentialprocessing of RNA transcript）；（2）翻译水平调控（differential translationof mRNA）。细菌的转录与翻译过程几乎发生在同一时间间隔内，转录与翻译相耦联（coupled transcription andtranslation）。真核生物中，转录产物（primary transcript）只有从核内运转到核外，才能被核糖体翻译成蛋

5、白质（图6-2）。原核生物的基因调控主要是转录调控，包括负转录调控和正转录调控。在负转录调控系统中，调节基因 的 产 物 是 阻 遏 蛋 白（repressor），阻止结构基因转录。根据其作用特征又分为负控诱导和负控阻遏二大类。在负控诱导系统中，阻遏蛋白不与效应物（诱导物）结合时，结构基因不转录；在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录。阻遏蛋白作用于操纵区。在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白（activator）。根据其作用特性分为正控诱导系统和正控阻遏系统。在正控诱导系统中，效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状态；在正控阻遏系统中，效应物分子的存在使激活

6、蛋白处于非活性状态（图6-3，表6-2）。图6-3 细菌中的转录调控体系。a. 负控诱导系统；b. 正控诱导系统；c. 负控阻遏系统；d. 正控阻遏系统。因子在结构上具有同源性，所以统称70家族，含有4个保守区（图6-4），其中第2个和第4个保守区参与结合启动区DNA，第2个保守区的另一部分还参与双链DNA解开成单链的过程。图6-4 大肠杆菌中的因子（以70为例）主要包括四个结构域。54因子识别并与DNA上的-24和-12区相结合（图6-5）。70因子只有在核心酶结合到DNA链上之后才能与启动子区相结合，而54则类似于真核生物的TATA区结合蛋白（TBP），可以在无核心酶时独立结合到启动子上。

7、图6-5 70 （上）和54 （下） 因子识别并结 合在所调控基因上游的不同区域。6. 2 乳糖操纵子与负控诱导系统大 肠 杆 菌 乳 糖 操 纵 子 （ lactoseoperon）包括3个结构基因：Z、Y和A，以及启动子、控制子和阻遏子等。转录的调控是在启动区和操纵区进行的。3个结构基因各决定一种酶：Z编码-半乳糖苷酶；Y编码-半乳糖苷透过酶；A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶。-半乳糖苷酶是一种-半乳糖苷键的专一性酶，除能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。-半乳糖苷透过酶的作用是使外界的-半乳糖苷透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。-半乳糖苷乙酰基转移

8、酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙酰基转移到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。6. 2. 1 酶的诱导lac体系受调控的证据一般情况下，lac+基因型大肠杆菌细胞内-半乳糖苷酶和透过酶的浓度很低，每个细胞只有12个酶分子。但是，在乳糖培养基上酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或7%，超过105个酶分子/细胞。在无葡萄糖有乳糖的培养基中，lac+细菌中将同时合成-半乳糖苷酶和透过酶。用32P标记的mRNA与模板DNA进行定量分子杂交，表明培养基中加入乳糖12分钟后，编码-半乳糖苷酶和透过酶的lac mRNA量就迅速增加，去掉乳糖后，lac mRNA量立即下降。实验室常用两种乳糖类似物异丙基巯基半乳糖苷（I

9、PTG）和巯甲基半乳糖苷（TMG），在酶活性分析中常用发色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）。因为它们都不是半乳糖苷酶的底物，所以又 称 为 安 慰 性 诱 导 物 （ gratuitousinducer）。用35S标记大肠杆菌细胞（培养基中没有半乳糖），将这些带有放射性的细菌转移到不含35S的培养基中，加入诱导物后-半乳糖苷酶便开始合成。分离纯化-半乳糖苷酶，发现这种酶无35S标记，说明这种酶是加入诱导物后新合成的。6. 2. 2 操纵子模型及其影响因子Jacob和Monod认为诱导酶（他们当时称为适应酶）现象是个基因调控问题，而且可以用实验方法进行研究，他们通过大量实验及分析，建立了现在已经

10、被人们广泛接受的乳糖操纵子的控制模型。图6-9 Lac操纵子的调控模式。A. Z、Y、A基因产物由同一条多顺反子mRNA分子所编码。B. 该mRNA分子的启动区（P）位于阻遏基因（I）与操纵区（O）之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效表达。C. 操纵区是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。D. 当阻遏物与操纵区相结合时，lac mRNA的转录起始受到抑制。E. 诱导物通过与阻遏物结合，改变其三维构象，使之不能与操纵区相结合，诱发lac mRNA的合成。图6-10 培养基中有无诱导物对LacmRNA及-半乳糖苷酶活性的影响阻遏物lac I基因产物及功能lac操纵子

11、阻遏物mRNA是由弱启动子控制下永久型合成的，该阻遏蛋白有4个相同的亚基，每个亚基均含有347个氨基酸残基，并能与1分子IPTG结合,每个细胞中有510个阻遏物分子。-半乳糖苷酶在乳糖代谢中的作用是把前者分解成葡萄糖及半乳糖。如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中，大肠杆菌在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发lac操纵子（图6-11）。某大肠杆菌突变体，它不能将葡萄糖-6-磷酸转化为下一步代谢中间物，该细菌的lac基因能在葡萄糖存在时被诱导合成。所以，不是葡萄糖而是它的某些降解产物抑制lac mRNA的合成，科学上把葡萄糖的这种效应称之为代谢物阻遏效应（catabolite repression）。cAM

12、P与代谢物激活蛋白cAMP是在腺苷酸环化酶的作用下由ATP转变而来的，在真核生物的激素调节过程中也起着十分重要的作用。将细菌放在含葡萄糖的培养基中培养，cAMP的浓度就低；如果培养基中只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途径的碳源，cAMP的浓度就会很高。大肠杆菌中的代谢物激活蛋白，由Crp基因编码，能与cAMP形成复合物。CRP和cAMP都是合成lac mRNA所必需的，cAMP-CRP是一个不同于阻遏物的正调控因子，而lac操纵子的功能是在这两个相互独立的调控体系作用下实现的。图6-13 gal，lac 和ara操纵子上游启动子区与CRP-cAMP结合位点的相对位置分析半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、山

13、梨醇等在降解过程中均转化成葡萄糖或糖酵解途径中的其他中间产物，这些糖代谢中有关的酶都是由可诱导操纵子控制的，被称为降解物 敏 感 型 操 纵 子 (catabolitesensitive operon），由cAMP-CRP调控。图6-14 大肠杆菌lac操纵子启动区CRP-cAMP及-35区，-10区序列分析。cAMP-CRP复合物与启动子区的结合是lac mRNA合成起始所必需的，因为这个复合物结合于启动子上游，能使DNA双螺旋发生弯曲，有利于形成稳定的开放型启动子-RNA聚合酶结构。阻遏物则是一个抗解链蛋白，阻止形成开放结构，从而抑制RNA聚合酶的功能。图 6-15CRP-cAMP 与上

14、游 DNA位点结合后造成模板 DNA 沿对称序列中央发生90的弯曲6. 2. 3 lac操纵子的调控区域P、O区P区（即启动子区）一般是从I基因结束到mRNA转录起始位点下游5-10bp，而O区（即阻遏物结合区）位于-7+28位，该区的碱基序列有对称性，其对称轴在+11位碱基对。图6-16 不同操纵子启动区及O区相对位置的比较。6. 2. 4 lac操纵子中的其他问题1、lac基因产物数量上的比较在完全被诱导的细胞中，-半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶的拷贝数比例为1：0.5：0.2，这个比例在一定程度上反映了以-半乳糖苷作为唯一碳源时细胞的需要。不同的酶在数量上的差异是由于在翻译水平上受到调

15、节所致。lac mRNA可能与翻译过程中的核糖体相脱离，从而终止蛋白质链的翻译。因此，存在着从mRNA的5末端到3末端的蛋白质合成梯度。在lac mRNA分子内部，A基因比Z基因更易受内切酶作用发生降解，因此，在任何时候Z基因的完整拷贝数要比A基因多。2、操纵子的融合与基因工程pur操纵子在染色体上位于lac操纵子沿转录方向的下游，中间只隔了一个控制细胞对T6噬菌体敏感性的tsx基因。pur操纵子被“嫁接”到lac启动子上，形成融合基因。因为lac启动子是一个很强的启动子，通过它可以使较弱启动子的转录增强。6. 3 色氨酸操纵子与负控阻遏系统trp体系参与生物合成，它不受葡萄糖或cAMP-CR

16、P的调控。色氨酸的合成主要分5步完成，有7个基因参与整个合成过程（图6-17）。图6-17 细菌中色氨酸生物合成途径。trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶，trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，trpF编码异构酶，trpC编码吲哚甘油磷酸合酶，trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的和亚基。在许多细菌中，trpE和trpG，trpC和trpB分别融合成一个基因，产生具有双重功能的蛋白质。trpE基因是第一个被翻译的基因，与trpE紧邻的是启动子区和操纵区。前导区和弱化子区分别定名为trpL和trpa。trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远。后者位于大肠杆菌染色体

17、图上25分钟处，而前者则位于90分钟处。在位于65分钟处还有一个trpS（色氨酸tRNA合成酶），它与携带有色氨酸的tRNATrp共同参与trp操纵子的调控作用。6. 3. 1 trp操纵子的阻遏系统trpR基因突变常引起trp mRNA的永久型合成，该基因产物因此被称为辅阻遏蛋白（aporepressor）。除非培养基中有色氨酸，否则这个辅阻遏蛋白不会与操纵区结合。辅阻遏蛋白与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物，与操纵区结合并关闭trp mRNA转录。效应物分子色氨酸是trp操纵子所编码的生物合成途径的末端终产物。当培养基中色氨酸含量较高时，它与游离的辅阻遏蛋白相结合，并使之与操纵区DNA紧密结

18、合；当培养基中色氨酸供应不足时，辅阻遏物失去色氨酸并从操纵区上解离，trp操纵子去阻遏。6. 3. 2 弱化子与前导肽1、弱化子在trp mRNA 5 端有一个长162bp的mRNA片段被称为前导区，其中123150位碱基序列如果缺失，trp基因表达可提高6-10倍。mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录。这个区域被称为弱化子，该区mRNA可通过自我配对形成茎-环结构。2、前导肽分析前导序列发现，它包括起始密码子AUG和终止密码子UGA，能产生一个含有14个氨基酸的多肽，这个假设的多肽被称为前导肽。在

19、前导序列的第10和第11位上有相邻的两个色氨酸密码子。组氨酸操纵子含有7个相邻的组氨酸密码子，苯丙氨酸操纵子也有7个苯丙氨酸密码子，这些密码子参与了操纵子中的转录弱化机制。3、mRNA前导区的序列分析trp前导区的碱基序列已经全部测定，引人注目的是其中4个分别以1、2、3和4表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对，有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3方式互补配对。RNaseT1降解实验（此酶不能水解配对的RNA）表明，纯化的trp前导序列中确有1-2和3-4的配对方式，由此定位的3-4配对区正好位于终止密码子的识别区，当这个区域发生破坏自我配对的碱基突变时有利于转录的继续进行（图6-23

20、）。4、转录弱化作用培养基中色氨酸浓度低，负载有色氨酸的tRNATrp就少，翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp密码子处），前导区2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，转录继续进行。培养基中色氨酸浓度高，核糖体顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前就到达2区，3-4区自由配对形成茎-环状终止子结构，转录停止。所以，弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。图6-24 trp操纵子前导序列的变构与转录的弱化。一般认为，阻遏物从有活性向无活性的转变速度较慢，需要有一个能更快地做出反应的系统，以保持培

21、养基中适当的色氨酸水平。弱化子能较快地通过抗终止的方法来增加trp基因表达，迅速提高内源色氨酸浓度。那么，为什么还要有阻遏体系呢？阻遏物的作用是在有大量外源色氨酸存在时，阻止非必需的先导mRNA的合成，它使这个合成系统更加经济。6. 4 其他操纵子6. 4. 1 半乳糖操纵子大 肠 杆 菌 半 乳 糖 操 纵 子 （ galactoseoperon）在大肠杆菌遗传图上位于17分钟处，包括3个结构基因：异构酶（UDP-galactose-4-epimerase，galE），半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶（galactose transferase，galT），半乳糖激酶（galactose kin

22、ase，galK），使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸。半乳糖操纵子的调节基因是galR，位于遗传图上55分钟处。与 lac 操 纵 子 所 不 同 的 是 ， galR 与galE、T、K及操纵区O等的距离都很远，而galR产物对galO的作用与lacI-lacO的作用相同。在galR-和galOc突变体中，E、T、K基因得到永久性表达，gal操纵子的诱导物主要是半乳糖。gal操纵子有两个特点：它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开始转录；它有两个O区，一个在P区上游-67-73，另一个在结构基因galE内部。1、cAMP-CRP对gal启动子的作用有些细胞株能在不含葡萄糖的培养基中高水

23、平合成半乳糖代谢酶类（gal结构基因高效表达），在另一类细胞株中，没有葡萄糖，gal基因不表达。在gal操纵子P-O区有两个相距仅为5bp的启动子，gal操纵子可以从两个启动子分别起始基因转录，每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2。从S1起始的转录只有在无葡萄糖时才能顺利进行，RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖、CRP和较高浓度的cAMP。当腺苷环化酶突变（cya-）或cAMP受体蛋白突变（crp-）时，gal操纵子不能从S1起始转录。当有cAMP-CRP时，转录从S1开始；当无cAMP-CRP时，转录从S2开始。2、双启动子的生理功能为什么gal操纵子需要两个转录起始位点呢？因

24、为半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大肠杆菌细胞壁合成的前体，细胞必须随时合成差向异构酶，以保证尿苷二磷酸的供应。在没有外源半乳糖的情况下，细胞通过半乳糖差向异构酶（galactose epimerase，galE基因产物）的作用由UDP-葡萄糖合成UDPgal。如果只有S1一个启动子，由于这个启动子的活性依赖于cAMP-CRP，当培养基中有葡萄糖存在时就不能合成异构酶。如果S2是唯一的启动子，那么，即使有葡萄糖存在，半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态，能量被浪费。6. 4. 2 阿拉伯糖操纵子araB、araA和araD基因参与阿拉伯糖

25、的降解，它们是一个基因簇，简写为araBAD。araB基因编码核酮糖激酶，araA编码L-阿拉伯糖异构酶，araD编码L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶。 araE和araF负责将阿拉伯糖运入细胞内，它们位于远离这个基因簇的地方，分别编码一个膜蛋白和一个位于细胞壁与细胞膜之间的阿拉伯糖结合蛋白。araBAD具有复合启动子区域，两个操纵区（O1，O2）和一个调节基因araC。在lac和gal操纵子中，阻遏蛋白只能作为负调节因子，而cAMP-CRP蛋白只能是正调节因子。 AraC蛋白同时显示正、负调节因子的功能。araBAD和araC基因的转录是分别在两条链上以相反的方向进行的，araBAD基因

26、簇从启动子PBAD开始向右进行转录，而araC基因则是从Pc向左转录（图6-27）。图6-27 ara操纵子上游调控区序列与功能分析ara操纵子也是可诱导的，阿拉伯糖本身就是诱导物。在野生型操纵子中，只有阿拉伯糖存在时才转录出araBADmRNA，而有葡萄糖存在时则不转录。腺苷酸环化酶缺陷型和crp-突变株也不形成araBAD mRNA，说明从PBAD起始的转录过程也需要cAMP-CRP。AraC蛋白具有PBAD活性正、负调节因子的双重功能。Pr是起阻遏作用的形式，可与类操纵区位点相结合，而Pi是起诱导作用的形式，它通过与PBAD启动子结合进行调节。没有阿拉伯糖时，Pr形式占优势；一旦有阿拉伯

27、糖存在，它就能够与AraC蛋白结合，使平衡趋向于Pi形式。a.没有AraC蛋白时，由Pc启动子起始araC基因转录；b.葡萄糖水平较高时，AraC蛋白与操纵区O2以及ara I上半区相结合，形成DNA回转结构，araBAD基因不表达；c.有阿拉伯糖但无葡萄糖存在时，AraC与阿拉伯糖相结合，变构成为激活蛋白，与araO1和araI区相结合，在CRP-cAMP的共同作用下起始结构基因表达。a.培养基含有葡萄糖，cAMP-CRP没有与操纵区位点相结合，AraC蛋白处于Pr形式并与操纵区A位点结合，RNA聚合酶不能与Pc结合，araC基因受到抑制，整个系统几乎处于静止状态。b.没有葡萄糖糖，也没有阿

28、拉伯糖。因为没有诱导物，尽管有cAMP-CRP与操纵区位点相结合，AraC蛋白仍以Pr形式为主，无法与操纵区B位点相结合，无araBAD mRNA转录。c.无葡萄糖，有阿拉伯糖。大量araC基因产物以Pi形式存在，并分别与操纵区B、A位点相结合，在cAMP-CRP的共同作用下，araC和araBAD基因大量表达，操纵子充分激活。6. 4. 3 组氨酸操纵子组氨酸（histidine）能被降解成氨、谷氨酸和甲酰胺，参与基础能量代谢。与His降解代谢有关的两组酶类被称为hut酶（histidine utilizing enzyme），控制这些酶合成的操纵子被称为hutoperon。图6-30是组氨

29、酸降解的代谢途径，它由一个多重调节的操纵子控制，有两个启动子，两个操纵区及两个正调节蛋白。Hut操纵子共编码4种酶和一个阻遏物。4种酶分别由hutG、hutH、hutI及hutU基因编码，阻遏物则由hutC基因编码。在产气克氏菌中，以上基因构成两个转录单位，hutI、hutG、hutC和hutU、hutH分别被转录合成两条mRNA长链。（图6-31）。hut操纵子拥有两个不同的正调节因子，其中的一个参与促进RNA聚合酶与启动子区的结合。当细胞生长环境中碳、氮来源都受限制时，hut操纵子负责供给细胞碳和氮。hut操纵子的每一个启动子上都有cAMP-CRP结合位点。6. 4. 4 阻遏蛋白LexA

30、的降解与细菌中的SOS应答当细菌DNA遭到破坏时，细胞内会启动一个被称为SOS的诱导型DNA修复系统。参与SOS DNA修复系统的基因都受LexA阻遏蛋白的抑制，SOS体系的诱导表达过程中LexA阻遏蛋白被移开。图6-32 大肠杆菌中受LexA蛋白阻遏的SOSDNA损伤修复系统操纵子的表达调控模式。一般情况下，约有1000个RecA蛋白单体分散在每个细胞中。当DNA严重受损时，单链DNA缺口数量增加，RecA与这些缺口处单链DNA相结合，被激活成为蛋白酶，将LexA蛋白切割成没有阻遏和操纵区DNA结合活性的两个片段，导致SOS体系（包括recA基因）高效表达，DNA得到修复 。6. 4. 5

31、二组分调控系统和信号转导最简单的细胞信号系统称为二组分系统（two-component systems），由二种不同的蛋白质组成：即位于细胞质膜上的传感蛋白（sensor protein）及位于细胞 质 中 的 应 答 调 节 蛋 白 （ responseregulator protein）。图6-33 细菌中参与信号转导的二组分调控系统传感激酶常在与膜外环境的信号反应过程中被磷酸化，再将其磷酰基团转移到应答调节蛋白上，磷酸化的应答调节蛋白即成为阻遏或诱导蛋白，通过对操纵子的阻遏或激活作用调控下游基因表达。6. 4. 6 多启动子调控的操纵子1、rRNA操纵子大肠杆菌rRNA操纵子（rrnE）

32、上有两个启动子P1和P2。在对数生长期，P1起始的转录产物比P2起始的产物多35倍。当细菌处于紧急状态，细胞中ppGpp浓度增加，P1的作用被抑制。因为rRNA是细胞中蛋白质合成机器核糖体的重要组成部分，不能完全停止供应，由P2起始rrnE基因转录。2、核糖体蛋白S1操纵子核糖体蛋白SI操纵子（rpsA）也受应急反应调节。rpsA有4个启动子，P1、P2是强启动子，平时主要依靠它们来启动基因的表达，合成S1蛋白。P3、P4是弱启动子，只有在紧急情况下，P1、P2启动子受ppGpp的抑制，由P3、P4起始合成的S1蛋白维持了生命的最低需要。3、DnaQ蛋白操纵子DnaQ蛋白是DNA聚合酶全酶的亚

33、基。在细胞中RNA聚合酶活性较低时，操纵子的转录由弱启动子P2控制；而RNA聚合酶活性较高时，就开始利用强启动子P1。也就是说，在细胞生命活动比较缓慢时， DnaQ蛋白的合成靠弱启动子P2来维持。当细胞增殖速度加快，RNA聚合酶活性升高时，P1就被激活。6. 5 固氮基因调控氮是所有生物的基本组成成分，蛋白质、核酸及许多小分子代谢产物都是含氮化合物。地球上的动植物共含氮约1.51010吨，而每年通过硝化细菌以气态氮的形式释放到大气中的氮就有21085108吨，全世界氮肥厂每年生产的化肥仅含氮约108吨。如果没有生物固氮，生命很快就不复存在了。6. 5. 1 根瘤的产生根瘤菌在豆科植物根际的生长

34、以及与寄主植物根毛幼嫩部位的接触是感染发生的第一步。通常情况下，根瘤菌特定小种的寄主范围都是很狭窄的，如Rhizobium trifolii主要感染三叶草，R. phaseoli主要感染菜豆，R. Leguminosarum主要感染豌豆。表6-5 感染各种植物的不同根瘤菌主要类群苜蓿类三叶草类豌豆类菜豆类羽扇豆类大豆类豇豆类根瘤菌名R. melilotiR. trifoliiR.leguminosarumR. phaseoliB. lupiniB. japonicumCowpearhizobia寄主植物苜蓿三叶草豌豆、某些菜豆及扁豆菜豆羽扇豆大豆花生、豇豆、金合欢属6. 5. 2 固氮酶固氮酶

35、所催化的反应：8e-N2+8H+32ATP-2NH3+H2+32ADP+32Pi这个反应包括两个组分：组分I由两个5.0104的亚基和两个6.0104的亚基组成，由nifD和nifK基因编码。含有4个4Fe-4S连接桥和两个铁-钼辅助因子（FeMoCo），常被称为铁钼蛋白（FeMo-protein）。组分II由两个完全相同的相对分子质量各为3.0104的亚基所组成，由nifH基因编码，常被称为铁蛋白（Fe-protein）。组分II只有一个4Fe-4S连接桥，位于两个亚基之间，一次只可送出一个电子，是生物固氮反应中的“瓶颈”。FeMoCo含有1摩尔 Mo，6摩尔Fe，8摩尔S，可能位于酶-底结

36、合活性中心附近。分离纯化的FeMoCo能被用来活化铁钼蛋白。研究认为，铁钼蛋白亚基第191位谷氨酰胺和第195位组氨酸附近，若分别用赖氨酸取代谷氨酰胺191，用天冬酰胺取代组氨酸195，铁钼蛋白的固氮活性明显下降。表6-6 几种不同突变体中的固氮酶活性比较株系突变核苷酸序列铁钼蛋白相对活性铁蛋白相对活性野生型CAGTCCCTGGCCACCACATC40.618.7DJ357nifDK：Kmr048.5DJ178-His195AsnCAGTCCCTGGCAACCACATC3.726.3DJ255-Gln191LysCGCGGCGTTTCCAAGTCCCTG1.439.56. 5. 3 与固氮有关

37、的基因及其调控实验证明，nifAL基因控制了整个固氮酶系统的表达和活性。若突变nifA基因，那么固氮酶和其他所有已知的nif基因产物都会消失。若再将野生型nifA基因用质粒DNA的形式导入上述突变株中，nif操纵子的功能就得到恢复。nifA和nifL基因产物分别是nif操纵子的正、负调控因子。当细胞内没有nifL蛋白质时，nifA基因产物足以激活其他nif基因的表达，甚至在有NH3和O2存在时也如此。Nif野生型克氏肺炎杆菌UNF928中固氮酶的活性完全被10mmol/L NH4+所抑制，而UNF714由于带有突变型nifAL基因，所以固氮酶活性为零。若将带有nifA质粒DNA正向表达载体pM

38、C73A导入UNF714中，不但能完全恢复野生型固氮酶活性，而且在10毫摩尔/升 NH4+中仍有15%30%的活性。表6-7 克氏肺炎杆菌固氮酶活性与nifA质粒的关系株系固氮酶活性 / 相对单位NH4+NH4+UNF928UNF714UNF714+pMC73AUNF714+pMC73BUNF1780(glnA100nif)UNF1780+pMC73AUNF1780+pMC73B10002300.10.051740.0050.0050270.10.075800.005有两组nif-突变体位于质粒上90分钟处，被称为ntrB和ntrC（ntr，nitrogenregulation，氮调控），另有

39、一组位于质粒上70分钟处，称为ntrA。nifA基因只有在ntrA、ntrC基因产物的共同作用下才能正常工作，激活nif操纵子群，而ntrC基因的活性是直接受NH3影响的。NH3浓度较高时，ntrC基因产物没有转录活性。分子生物学研究发现，细胞质内谷氨酰胺：-酮戊二酸的比值较低时，UMP就在glnD基因产物的作用下被转移到GlnB蛋白上，反之则从GlnB蛋白上脱去UMP。不带有UMP的GlnB蛋白能与NtrB产物相结合并导致NtrC基因产物去磷酸化，丧失启动nifAL基因转录的功能。当细胞内游离氨含量较低时，GlnB蛋白被尿苷化并与NtrB蛋白分离，使后者蛋白激酶的功能得到发挥，将NtrC蛋白磷酸化而激活nif操纵子系统（图6-38）。因为细胞内氧浓度一般都在数百微摩尔左右，而固氮酶只能在几十纳摩尔O2浓度下才能正常工作，固氮菌依靠Lb解决了这对矛盾，因为Lb对O2有极高的亲和力，它与大量自由O2相结合，既大大降低了自由O2浓度，又能将分子氧直接输送到呼吸链。表6-9 大豆根瘤细胞内氧浓度变化分析类菌体周膜空间含类菌体的寄主细胞质Lb含量Lb氧化程度氧吸附量自由氧浓度吸附氧/自由氧300mol/L0