质粒DNA的提取及浓度判定

1、质粒质粒DNA的提取及浓度检测的提取及浓度检测1.目的与要求 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。2. 相关知识及原理质粒质粒(Plasmid) (Plasmid) ：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链的遗传因子。是一种环状的双链DNADNA分子。分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。细胞中，在细菌细胞中最多。DNA超螺旋结构超螺旋结构细菌质粒细菌质粒: 细菌质粒是用的最多的

2、质粒类细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从群，其大小从1Kb-200Kb，它们复，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。的同一组酶系。 严谨型：严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝； 松驰型：松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，份拷贝，如果用一定的药物

3、处理抑制寄主蛋白质的合成如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。才能达到更高拷贝数。质粒类型：质粒类型：载体载体(Vector)(Vector)：用于携带重组用于携带重组DNADNA，并且能够使外源，并且能够使外源DNADNA一起复制一起复制与表达的质粒与表达的质粒( (运载工具运载工具) )。具备的条件：具备的条件： 易于鉴定；易于鉴定； 在受体细胞中可以独立复制；在受体细胞中可以独立复制； 易于筛选；易于筛选；

4、易于导入受体细胞。易于导入受体细胞。1.1.抗性基因（抗性基因（Antibiotic resistance Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene, Kanamycine resistance gene)resistance gene)2.2.启始复制子（启始复制子（oriori, Origin of , Origin of replication)replication)；3.3.多克隆位点多克隆位点(MS

5、C, Multiple cloning (MSC, Multiple cloning site or polylinker)site or polylinker)；4.4.标记基因标记基因(Marker gene, such as (Marker gene, such as LacZ gene)LacZ gene)。载体的结构：载体的结构：InsertEcoRIXhoI1.9kbDNA DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致境会导致DNADNA的变性，如加热、极端的变性，如加热、极端pHpH值、值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环有机溶剂、尿

6、素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使境又可以使DNADNA复性。复性。原理：原理：SDSSDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDSSDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒破裂，从而使质粒DNADNA以及基因组以及基因组DNADNA从细胞从细胞中同时释放出来。释放出来的中同时释放出来。释放出来的DNADNA遇到强碱遇到强碱性（性（NaOHNaOH）环境，就会变性。然后，用酸性）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中

7、性，质粒乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNADNA将迅速复性，而基因组将迅速复性，而基因组DNADNA，由于分子巨，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒大，难以复性。离心后，质粒DNADNA将在上清将在上清中，而基因组中，而基因组DNADNA则与细胞碎片一起沉淀到则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNADNA从细菌中提取出来。从细菌中提取出来。细菌裂解的方法： 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。测定测定DNADNA浓度的方法主要有两种，即利

8、用分浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定光光度计法测定DNADNA的紫外光吸收值；第二的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于粗略检测粗略检测DNADNA浓度的方法是通过凝胶电泳，浓度的方法是通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。与标准分子量相比较。DNADNA浓度的测定：浓度的测定：紫外光吸收法：紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基因为组成核酸的碱基(G,A,T,C(G,A,T,C）在）在260nm260nm处处具有强吸收峰，所以通过测定具有强吸收峰，所以通过测

9、定260nm260nm的吸收的吸收峰即可对峰即可对DNADNA进行定量。但有时也会因为所进行定量。但有时也会因为所处溶液的处溶液的pHpH值不同而导致吸光系数的不同。值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性因此，一般在中性pHpH值左右的环境中进行值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。3. 材料与试剂材料与试剂材料材料:含有质粒含有质粒pCMV-Myc-T10的大肠杆菌的大肠杆菌DH5。pCMV-MycpCMV-Myc是一种哺乳细胞表达载体，它含有一个是一种哺乳细胞表达载体，它含有一个N N端端c-c-Myc Myc 尾，常用于免疫反

10、应的检测和蛋白纯化以及作为诱尾，常用于免疫反应的检测和蛋白纯化以及作为诱饵蛋白检测酵母双杂交结果。饵蛋白检测酵母双杂交结果。Suitable host strains: DH5a, HB101, and other general purpose strains.Selectable marker: plasmid confers resistance to ampicillin (100 mg/ml) to E. coli hosts.E. coli replication origin: pUCCopy number: 500 InsertEcoR1Xho11.9kbpCMV-Myc-T1

11、04. 步骤A.质粒DNA的提取 碱裂解法碱裂解法溶液溶液1GET缓冲液：缓冲液： 50mmol/L葡萄糖，葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。溶液溶液20.2mol/L NaOH, 1%SDS溶液溶液3乙酸钾溶液乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸，冰醋酸， 28.5mL H2OTE缓冲液或水（缓冲液或水（+ 20m mg/ml RNase ）: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，乙醇，70乙醇乙醇注意：注意： 用移液器操作时，每一步

12、都要格用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液外小心，特别是在加入溶液II II 和和IIIIII后，一定不要剧烈振荡，以免后，一定不要剧烈振荡，以免切碎切碎DNA(DNA(包括质粒包括质粒DNADNA和基因组和基因组DNA)DNA)！1. 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，含有相应抗生素的液体培养基，37培养培养1216小时小时;2. 取液体培养液取液体培养液1.5-3ml于于Eppendorf管中，管中，10000r/min离心离心1min，去掉上清液，加入，去掉上清液，加入100m ml溶液溶液1

13、(GET) ，充分混匀放置，充分混匀放置3-5分钟分钟;3. 加入加入200m ml新配制的新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS（变性液），加盖颠倒（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上次使之混匀，冰上放置放置5min;质粒小量提取的方法（手工提取）：质粒小量提取的方法（手工提取）：4. 加入加入150 m m l乙酸钾溶液乙酸钾溶液(溶液溶液II)，加盖后颠倒，加盖后颠倒6-7次混匀，次混匀，冰上放置5min;5. 用台式高速离心机，用台式高速离心机，10000r/min离心离心7min，上，上清移入另一干净离心管，并加清移入另一干净离心管，并加1ml 100乙醇混乙醇混匀，匀，

14、12000r/min离心离心5min，弃去上清液，弃去上清液;6. 沉淀用沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次，乙醇清洗一次， 12000r/min离心离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥，除尽乙醇，室温自然干燥;7. 加入加入30-50m ml含有含有20m mg/ml RNase的灭菌蒸馏水的灭菌蒸馏水或或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使，使DNA充分溶解充分溶解(有时需要酚有时需要酚:氯仿抽提氯仿抽提);8. 将分离出的质粒将分离出的质粒DNA置于置于-20保存备用。保存备用。Bi

15、odevBiodev（博大泰克）质粒快速（博大泰克）质粒快速提取试剂盒（提取试剂盒（plasmid rapid plasmid rapid isolation kitisolation kit） 碱裂解法；离心柱结构；特殊硅基质吸附材料。碱裂解法；离心柱结构；特殊硅基质吸附材料。使用前按说明再溶液使用前按说明再溶液I中加入中加入RNase；向洗脱液；向洗脱液中按中按1:3的比例加入无水乙醇。的比例加入无水乙醇。操作步骤操作步骤1.1.收集收集1.51.53ml3ml菌液沉淀于菌液沉淀于1.5ml1.5ml离心管中。离心管中。加入加入100100m ml溶液溶液1 1，振荡至彻底悬浮。，振荡至彻

16、底悬浮。为了获得高质量的质粒为了获得高质量的质粒DNADNA，培养细菌的时，培养细菌的时间不宜过长，一般为间不宜过长，一般为1212小时；小时；细菌沉淀中加入溶液细菌沉淀中加入溶液1 1后，一定要彻底悬浮，后，一定要彻底悬浮，否则抽提质粒否则抽提质粒DNADNA的纯度及得率会大大降低的纯度及得率会大大降低2.2.加入加入150150m ml溶液溶液2 2，立即轻柔颠倒离心管数次，立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。随后将离心管随后将离心管冰上冰上放置放置1 12 2分钟分钟（时间勿（时间勿超）。超）。3.3. 加入加入150150

17、m ml溶液溶液3 3，立即温和颠倒离心管数次，立即温和颠倒离心管数次，室温放置室温放置5 5分钟。分钟。12000rpm12000rpm离心离心1212分钟。分钟。要获得更好得质粒提取效果，请于步骤要获得更好得质粒提取效果，请于步骤2 2和步和步骤骤3 3后，冰上放置。后，冰上放置。4.4. 将将420420m ml结合缓冲液结合缓冲液加入加入离心柱离心柱中。然后将中。然后将步骤步骤3 3的上清的上清加入离心加入离心吸附柱中吸附柱中（尽量去除杂质），（尽量去除杂质），混匀。混匀。12000rpm12000rpm离心离心3030秒钟。倒掉废液收集管秒钟。倒掉废液收集管中得溶液。中得溶液。5.5

18、. 加入加入750750m ml洗涤缓冲液洗涤缓冲液于离心吸附柱中，于离心吸附柱中，12000rpm12000rpm离心离心1 1分钟。分钟。浓缩漂洗液配置成工作浓度时，一定要使用无浓缩漂洗液配置成工作浓度时，一定要使用无水乙醇，否则，吸附于硅基质材料上的水乙醇，否则，吸附于硅基质材料上的DNADNA可能可能被洗脱下来，影响回收效率。被洗脱下来，影响回收效率。6.6. A.A.重复步骤重复步骤5 5一次；一次；B.B.随后，再次于随后，再次于12000rpm12000rpm空空管离心管离心2 2分钟，尽量除去漂洗液。分钟，尽量除去漂洗液。洗涕时（即步骤洗涕时（即步骤5和和6）一定要尽量除去漂洗

19、液，）一定要尽量除去漂洗液，否则，漂洗液中得乙醇会抑制后续得各种酶促否则，漂洗液中得乙醇会抑制后续得各种酶促反应。必要时，可适当延长离心时间或者用反应。必要时，可适当延长离心时间或者用Tip头吸净。头吸净。如果含有较多得蛋白、盐类等杂质，可多洗如果含有较多得蛋白、盐类等杂质，可多洗涤几次。涤几次。7. 小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管中。加入离心管中。加入50m ml洗脱缓冲液洗脱缓冲液，室温，室温放置放置5分钟后，分钟后，12000rpm离心离心1分钟。分钟。洗脱缓冲液一定要加入离心吸附柱中硅基质洗脱缓冲液一定要加入离心吸附柱中硅基

20、质材料得正中，以确保被吸附在硅基质材料中材料得正中，以确保被吸附在硅基质材料中得得DNA都能被洗脱下来。为提高回收效率，都能被洗脱下来。为提高回收效率，可适当加大洗脱液体积及洗脱次数。可适当加大洗脱液体积及洗脱次数。 为了充分除尽为了充分除尽RNARNA的污染，可在提取的质粒中的污染，可在提取的质粒中加入加入0.50.5m ml lRNaseARNaseA（10mg/ml10mg/ml）。这并不影响其）。这并不影响其他后续实验，所提取的质粒的纯度足以用来作他后续实验，所提取的质粒的纯度足以用来作为测序模板和其他酶促反应。为测序模板和其他酶促反应。 若提取的质粒大于若提取的质粒大于10Kb10K

21、b，在加入洗脱缓冲液后，在加入洗脱缓冲液后，可在可在7070水浴中放置水浴中放置3 35 5分钟，以确保质粒分钟，以确保质粒DNADNA的完全洗脱。的完全洗脱。B. 用分光光度计法定量用分光光度计法定量DNA1. 取取2m ml提取的质粒提取的质粒DNA，加入，加入98m ml蒸蒸馏水对待测馏水对待测DNA样品做样品做1:50(或更高或更高倍数的稀释倍数的稀释);2. 蒸馏水作为空白蒸馏水作为空白,在波长在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数处调节紫外分光光度计读数至零。至零。3.加入加入DNA稀释液，测定稀释液，测定260nm 及及280nm的吸收值。的吸收值。260nm 读数用于计算样品中读数用于计算样品中核酸的浓度，核酸的浓度，OD260值为值为1相当于约相当于约50m mg /ml双链双链DNA，33m mg /ml单链。可根据在单链。可根据在260nm以及在以及在280nm的读数的比值的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为的纯品，其比值为1.8，低于此值说，低于此值说明有蛋白质或其它