海大1号”长牡蛎新品种四倍体的诱导及单体牡蛎培育模式的优化研究生物学专业

1、“海大1号”长牡蛎新品种四倍体的诱导及单体牡蛎培育模式的优化研究摘要 前言 牡蛎又称海蛎子，蚝等，是一种世界性分布性的贝类，在大多数海域都有分布，牡蛎营养丰富肉质细嫩被赞誉为“海中牛奶”，牡蛎富含蛋白质、胆固醇、钙、铁维生素等营养成分，深受人们的喜爱，是重要的养殖贝类，我国具有广阔的海上疆域，拥有长达18000km的海岸线，广阔的海区条件和丰富的饵料使我国的贝类资源丰富，并为我国贝类养殖业的发展提供了良好的条件，我国的牡蛎养殖业可以追溯到宋代的插竹养殖，经过多年的发展牡蛎养殖已成为是我国养殖业的重要组成部分，我国的牡蛎养殖业发展已经较为成熟，自然海区的半人工采苗和工厂化室内人工育苗为牡蛎养殖业

2、提供了充足的苗种供应，筏式养殖滩涂播养等养成技术保证了成体牡蛎的供应，消费者的认同保证了牡蛎的销路，牡蛎养殖业创造了巨大的经济效益和社会效益，但是随着养殖业的蓬勃发展，种质衰退、海区自然资源减少、养殖海区污染，引种混乱，发展路线低端牡蛎单位价值较低等问题日益凸显，制约了我国牡蛎养殖业的发展。培育出生长更快，风味更好，抗逆能力更强的养殖新品种成为解决上述问题的理想方法。2014年3月24日，农业部公布了第五届全国水产原种和良种审定委员会审定通过的15个水产新品种，由中国海洋大学水产学院贝类遗传育种研究室培育的长牡蛎“海大1号” 获得了水产新品种证书。长牡蛎“海大1号”是我国培育的第一个牡蛎新品种

3、，填补了我国牡蛎良种培育的空白，对实现海水养殖良种化，推动牡蛎养殖业持续、稳定、健康发展将起到重要促进作用。 “海大1号”是来以从山东乳山海区养殖的长牡蛎为基础群体，使用群体选育的方法经过连续6代选育而成的，主要的选育指标是生长速度和壳形，该新品种具有生长速度快、壳型规则等特点，在相同的养殖条件下，15月龄平均壳高比普通长牡蛎苗种提高16.2%，总湿重提高24.6%，出肉率提高18.7%，壳形较美观，整齐度明显的高于普通商品长牡蛎，由于其生长快、个体大、壳形规则的特点，一经推广就被养殖户广泛接受，创造了良好的经济效益。但是在繁殖季节，由于牡蛎的性成熟及精卵的排放会导致牡蛎的生长停滞，肉质下降等

4、问题，在繁殖过后，又会因为体质虚弱导致大量死亡，影响了牡蛎在繁殖季节的口味和产品供应，而由于三倍体牡蛎的育性差，不会出现类似的情况（王昭萍等，2000；曾志南等，1999；），可以弥补传统二倍体牡蛎养殖过程中在繁殖期出现的问题，同时三倍体牡蛎生长速度较快，个体较大可以缩短养殖周期具有较高的经济价值（王昭萍等，1998；胡庆明等，1997；曾志南等，1999 Allen S K and Downing S L；Stanley J G et al 1984；Davis J P，1989），目前可以通过多种理化方法直接诱导牡蛎三倍体，常采用的化学诱导剂有6-二甲基氨基嘌呤、细胞松弛素B、咖啡因等，或

5、者使用温度休克法或水静压等物理方法诱导，但是大多数方法三倍体诱导率无法达到100%，而且直接诱导获得三倍体的方法不稳定，诱导过程易受到外界环境以及操作者水平的影响,各种理化处理方法还会对受精卵的存活产生影响，影响幼虫的孵化。而且三倍体牡蛎不能进行自群繁殖，想要获得三倍体苗种需要进行重复操作，工作量较大。对此理想的解决方法就培育出四倍体牡蛎，理论上四倍体牡蛎和正常的二倍体牡蛎杂交可以获得100%的三倍体后代（Guo X et al，1996；阙华勇等，2003王昭萍等，2004），而且四倍体牡蛎可以正常繁殖,可以建立稳定的四倍体群体（施坤涛等，2006）,可以更加简单有效的获得三倍体，有利于三倍

6、体贝类的产业化推广。由于养殖环境、品质等因素, 我国的牡蛎价格相对较低, 仅为国际市场价格20%左右，为了提高牡蛎的经济价值，人们逐渐开始关注单体牡蛎的养殖，单体牡蛎具有形状规则，大小均匀，方便收获、加工和运输的优点，而且单体牡蛎可以充分的利用水体，方便控制养殖密度，目前,国际上发达国家的牡蛎养殖主要采用单体牡蛎养殖的方式, 而我国单体牡蛎的研究起步相对较晚，单体牡蛎发展较为缓慢，单体苗种的供应和配套的养殖设施和技术都不甚完善。本次实验将以“海大1号”长牡蛎新品种为研究对象，通过多种方式，探讨“海大1号”长牡蛎新品种四倍体的诱导方式，为海大1号长牡蛎新品种的多倍体育种提供理论依据，同时实验以肾

7、上腺素诱导获得的对海大1号长牡蛎新品种单体牡蛎稚贝为实验材料，从培育密度、水循环方式等方面入手寻找一种适宜的单体养成模式，提高单体牡蛎稚贝的存活率和生长速度。第一章文献综述第一节 “海大1号”长牡蛎新品种四倍体的诱导1 贝类育种的研究现状 为了创造更高的经济效益，解决牡蛎养殖业中暴露出来的一系列问题，科研工作者一直致力于具有优良性状的新品种的培育和推广，目前常见的新品种培育手段有选择育种技术、杂交育种技术、雌核发育育种技术、雄核发育育种技术、多倍体育种技术等。 选择育种技术：选择育种又称系统育种，是一种最基本的育种方法，通过对原始品种进行有目的有计划的反复淘汰选择，选择出性状可以稳定遗传的符合

8、人们需要的新品种，是以现有品种在繁殖过程中的自然变异作为原始材料的育种方法。在贝类选择育种研究方面选择的目标大都是选择出生长快速、规格大、抗逆性强、外形美观的品种。我国比较成功的选择育种的案例主要有包振民等选育出的栉孔扇贝新品种“蓬莱红”，李琪教授选育的长牡蛎新品种“海大1号”等。杂交育种技术：杂交育种指不同种群、不同基因型个体间进行杂交，并对其杂种后代进行培育和选择最终育成新品种的方法。杂交育种是一种经典的育种方法，其应用非常广泛，在农作物方面全球约有90%的育种是杂交育种近年来国内外的专家做了大量的工作，取得了一定成果，1995年Heath研究发现虾夷扇贝和西北盘扇贝的杂交后代的抗派金氏虫

9、病能力较强，吕豪开展了大连湾牡蛎和太平洋牡蛎杂交的实验，实验结果证明两种牡蛎间的杂交是可行的（吕豪等，1994）。雌核发育育种技术：雌核发育是指用遗传失活的精子激活卵，卵仅靠雌核发育成胚胎的现象，精子并不参与合子的形成，因为这种胚胎只有正常个体一半的染色体，所以胚胎并不能正常存活，但通过抑制极体的释放或者抑制卵裂的方法等可以使细胞核核恢复到正常的染色体，从而可以正常的存活，雌核发育技术中主要使用紫外线照射使精子的遗传物质失活，通过雌核发育得到的二倍体是纯合的，有利于快速的建立高度纯合的品系，因此受到了科学家的关注。雌核发育育种技术在鲶鱼、罗非鱼、真鲷等经济鱼类中取得了成功，在贝类中雌核发育的研

10、究相对滞后，但也取得了一些成果，李琪等成功诱导出了太平洋牡蛎雌核发育二倍体。但是人工诱导牡蛎雌核发育得到的幼虫存活率较低，培养至成体的难度较大。雄核发育育种技术：与雌核发育相似，雄核发育是卵子失去遗传活性仅靠精子的遗传物质进行发育的方式，诱导后可以通过抑制第一次卵裂获得可存活的二倍体个体，也可以通过两个精子融合获得二倍体个体在贝类中，雄核发育的诱导研究已经在长牡蛎和栉孔扇贝中开展，但是没有获得可以成活的雄核发育二倍体。多倍体育种技术：多倍体通常指体细胞中含有三个或三个以上染色体组的生物个体，真核生物形成配子时进行减数分裂，得到四个染色体数目减半的配子，贝类的精子在排放时已经完成了整个减数分裂的

11、过程，但是卵子并没有完成整个减数分裂的过程，在排放时一般处于减数第一次分裂的前期或中期，在受精后才能继续进行减数分裂，最终才能受精，这一特殊现象为贝类的多倍体育种操作提供了可能性。 目前贝类多倍体育种的研究已经取得了很大的进展（Guo X and Allen S K，1994a；Guo X and Allen S K，1994b；Stanley J G et al，1981；Shen Y P et al，1993，Quillet E, Panelay P J et al，1986；Nell J A et al，1995；Mason K M et al，1988；Chaiton J A et a

12、l，1985； Komaru A and Wada K T，1989），诱导技术也日渐成熟，目前贝类三倍体主要通过各种理化学方法来抑制受精卵第二极体的释放获得，化学诱导方法主要是使用细胞松弛素B、6-二甲氨基嘌呤、咖啡因等化学诱导剂，常用的物理诱导方法有温度休克法和水静压化学方法，在太平洋牡蛎（王昭萍等，2000；Allen S K et al，1986；Yamamoto S et al，1988； Allen S K and Bushek D，1992，于瑞海等，2002a；于瑞海等2002b；于瑞海等，2003；Akashige S and Fushimi T，1992；隋锡林等1997；

13、田传远等，1998；田传远等，2000；田传远等，1999a；田传远等，1999b；田传远等，1999c；田传远等，1999d；王菊生等，1999；于瑞海等，1994；于瑞海等，2001）、美洲牡蛎（Stanley J G et al，1981）、近江牡蛎（杨春玲等，1981）、大连湾牡蛎（梁英等，1994）、栉孔扇贝（王清印和杨爱国，2000，王子臣等，1990；杨爱国等，2000）、虾夷扇贝（王昭萍等2009；常亚青等2001a；常亚青等2001b）僧帽牡蛎（曾志南等，1994）皱纹盘鲍（Arai K et al，1986；顾勇杰等2010）多等种贝类中这些诱导方式都有被研究，但是这些诱导

14、方式都存在一定的缺陷，而四倍体牡蛎和二倍体杂交可以产生三倍体，理论上讲这种方式可以获得100%的三倍体后代，而且操作简便易行，避免了使用理化处理对胚胎造成的不良影响，理论上讲可以为贝类三倍体产业化提供一条简便易行的途径，但是这种方法需要培育贝类四倍体，人们对贝类四倍体育种的研究比贝类三倍体的研究要晚,贝类四倍体的诱导难度也更大。1988年,Stephens等通首次过抑制太平洋牡蛎受精卵第一极体的释放获得了四倍体幼虫（Stephens L B and Downing S L，1988），而后国内外学者对太平洋牡蛎、美洲牡蛎（Supan J E et al，2000）、栉孔扇贝、近江牡蛎（Alle

15、n S K et al，2003；容寿柏等，1992）、虾夷扇贝、合浦珠母贝（孙振兴等，1998）、贻贝（蔡国雄，1996）、地中海贻贝、菲律宾蛤仔、皱纹盘鲍（孙振兴等，1998）、食用牡蛎（Gendreau S and Grizel H1990）等10余种贝类进行了四倍体育种研究，虽然在实验中都获得了四倍体胚胎或幼虫,但有四倍体成体存活的仅在栉孔扇贝、地中海贻贝、和菲律宾蛤仔中有报道（王昭萍等，2004）。1994年,Guo和Allen成功的获得了存活的四倍体太平洋牡蛎（Guo X and Allen S K，1994），他们对之前诱导四倍体失败的原因进行了分析，并尝试利用太平洋牡蛎三倍体的

16、卵子与正常精子受精后抑制第一极体来诱导四倍体，最终获得了成功,并将四倍体与二倍体杂交生产全三倍体的方法应用于生产中。此后,利用这种方法又在合浦珠母贝和美洲牡蛎（Guo X et al，2002）中培育出存活的四倍体。2贝类多倍体育种原理 一般情况下，贝类都是二倍体生物，既体细胞内包含有两个染色体组，而多倍体指体细胞中含有多个染色体组的个体，通常使用物理或者化学方法改变正常二倍体受精卵的染色体组数目，经过发育后获得多倍体。贝类的精子在排放时己经完成了整个减数分裂过程,而卵子在排放时一般停止在第一次减数分裂的前期或中期，并没有完全完成减数分裂,只有在受精后才会完成剩余的减数分裂过程，完成两个极体的

17、释放、雌雄原核的融合，然后进入第一次有丝分裂阶段，正是卵子的这种独特的减数分裂过程为贝类多倍体育种操作提供了有利的时机和条件。基于贝类独特的减数分裂过程人们可以方便的通过抑制极体的释放来影响受精卵体内染色体的行为方式获得贝类多倍体，除抑制极体的释放外还可以通过各种理化手段抑制卵裂、细胞融合，人工雌核发育等方式影响细胞内的染色体数获得多倍体。2.1抑制受精卵第一极体的释放：抑制第一极体的释放会导致第二次减数分裂过程中染色体行为的复杂化，会产生三倍体、四倍体、非整倍体的个体，以太平洋牡蛎为例，抑制第一极体的的释放后，在随后的过程中染色体分离有以下几种方式：联合二级分离；随机三级分离；非混合三级分离

18、；独立二级分离。2.1.1联合二极分离：两组二分体联合成一体以二级分离的方式进行减数第二次分裂，20条染色单体以第二极体的形式被排出，另外20条染色单体保留在细胞核中。其结果是产生了MI三倍体18。2.1.2随机三极分离：染色体分离过程中会形成三个纺锤体，两组二分体合成一群后被随机的分成三组，每组6至7个，在第二次减数分裂中期三组二分体分布在三极纺锤体的三个分裂面上，随后进入减数第二次分裂后期，至末期时每一极都接受来自相邻两组的二分体分离出来的染色单体，最后最靠近卵子边缘的染色体组作为第二极体排出，导致了非整倍体的产生18。2.1.3非混合三级分离：分裂过程中形成三个纺锤体，两组二分体在进入三

19、极分离之前不结合或者重叠，其中一组二分体等分到两个靠近边缘的分裂面中另外一组二分体位于靠近内侧的分裂面中仍然保持在一起，其中一套染色单体可能移动到边缘一极作为第二极体被排出，其余的母本染色体和父本染色体结合而形成四倍体18。2.1.4独立二级分离：分裂过程中形成四极纺锤体，两组二分体各自以二极分离方式独立进入第二次减数分裂，到第二次减数分裂末期时所有染色体被均分到四个极，然后排出不定数目的染色体作为第二极体，将会导致二倍体、三倍体、四倍体的产生18。2.2抑制受精卵第二极体的释放：抑制受精卵第二极体的释放后，染色体的行为相对简单，可以使受精卵保留一组额外的染色体，产生三倍体个体。2.3抑制卵裂

20、：使用理化方法抑制受精卵的卵裂，使已经完成染色体加倍的细胞不能分裂，从而产生多倍体贝类。2.4细胞融合：使用物理或化学物质对细胞进行处理，使其细胞膜融合成为一个细胞，最终会产生多倍体贝类，通常以聚乙二醇作为细胞融合剂，或者通过电脉冲等方式诱导细胞融合。2.5人工雌核发育：雌核发育是指用遗传失活的精子激活卵，卵仅靠雌核发育成胚胎的现象，精子并不参与合子的形成，因为这种胚胎只有正常个体一半的染色体，所以胚胎并不能正常存活，但是可以将其和其他化学方式结合，通过抑制极体的释放或者抑制卵裂的方法使获得多倍体贝类，通常使用紫外线、Y射线辐射处理或甲苯胺兰、乙烯脲、二甲基硫酸盐等化学物质处理使精子染色体失活

21、。3贝类多倍体常用诱导方法贝类多倍体的诱导研究主要集中在如何获得三倍体和四倍体两方面，通过各种理化方法干预受精卵的发育过程从而获得预期的效果。贝类三倍体诱导的研究已经相对成熟，而对于诱导四倍体的研究起步相对较晚。3.1贝类三倍体的诱导方法：3.1.1化学方法：采用能够抑制分裂的化学物质来干预细胞分裂的过程，从而获得预期的效果，常用的化学药品有细胞松弛素B，6-二甲氨基嘌呤，咖啡因等。细胞松弛素B（CB）：真菌的代谢产物，一般认为细胞松弛素B可以特异性的破坏微丝，抑制细胞的分裂，一般认为细胞松弛素B的有效的使用浓度是0.5-1.0mg/L，处理时间一般为10-15min，一般溶解到0.1%的二甲

22、亚砜中使用，虽然细胞松弛素B可以有效的诱导贝类三倍体但是因为其是剧毒物质有一定的致癌性所以在生产上已经禁止使用。6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）：嘌呤霉素的类似物，是一种蛋白质磷酸化抑制剂，可以作用于特定的激酶，破坏微管的聚合中心，使微管无法形成。一般认为6-DMAP的适宜浓度范围为300-450umol/L，处理持续时间10-20min，因为6-二甲基氨基嘌呤毒性较低且易溶于水，被认为是能够替代细胞松弛素B的诱导剂。咖啡因：细胞分裂过程中构成纺锤丝的微管对Ca2+浓度非常敏感Ca2+浓度极低或者高于10-3时会引起微管二聚体的解聚，阻止分裂。一般认为咖啡因的有效浓度为5-15mmol/L,

23、处理时间10-15min。秋水仙素：秋水仙素不会影响合子或细胞内染色体的复制和分离,但是它可以抑制微管的组装过程,并且会使已有的微管解聚,这样就阻止了分裂过程中新纺锤体的形成并破坏己经形成的纺锤体,使得细胞的染色体加倍而不分离从而获得多倍体。3.1.2物理方法：常用的物理方法包括温度休克法和水静压法，近年来王昭萍等又发现了采用渗透压诱导同样可以诱导产生多倍体。温度休克法：温度休克包括冷休克和热休克两种，温度休克可以引起细胞内酶构型的变化，从而影响酶促反映的进行，使分裂过程中形成纺锤丝所需要的ATP供应途径受阻，影响细胞的分裂,由于温度休克法成本较低、操作相对简单,经常被用于多倍体的诱导。水静压

24、：使用液压机等加压设备对处理对象施压，可以阻碍纺锤体微管和微丝的形成，抑制细胞的分裂。低渗诱导：是近年来提出的诱导多倍的方法，通过将处理对象放置到低渗环境中的方法抑制细胞的分裂，王昭萍等认为低渗可能会引起能量代谢的紊乱，影响微管微丝的形成，可以组织极体的释放从而形成多倍体。姜卫国等诱导合浦珠母贝多倍体的研究表明，在实验所设的范围内，使用细胞松弛素B诱导三倍体适宜的处理时间为15min左右，适宜的处理浓度为1.2-2.0mg/L，各个实验组的结果表明在水温27.9-29.9的环境下，受精后3min使用浓度为1.2-2.0mg/L细胞松弛素B处理受精卵15min时可以获得的三倍体率为40.4-47

25、.2%，但是处理后的受精卵孵化率较低，低于8%，在水温为28的环境中在受精后17min进行诱导时，使用1.2mg/L的细胞松弛素B诱导15min就可以获得76.8%的三倍体率（姜卫国等，1987）。李永仁等在使用细胞松弛素B抑制第二极体释放从而获得菲律宾蛤仔三倍体的实验中发现：0.5mg/L与0.75mg/L细胞松弛素诱导率较高，分别达到89.4%和89.2%，实验过程中以极体释放的比率为参考确定诱导时机和时间，在对照组受精卵出现第一极体的比例达50%时加入细胞松弛素B处理，处理至对照组出现第二极体的受精卵比例达到50%止，实验发现细胞松弛素B浓度和胚胎发育速度呈负相关，与各发育阶段的畸形率呈

26、正相关，综合考虑下认为0.5mg/L是诱导菲律宾蛤仔三倍体的适宜浓度。林岳光等人研究发现使用0.5mg/L的细胞松弛素B抑制华贵栉孔扇贝第一极体的释放时可以获得44.1%的三倍体，而抑制第二极体的释放可以获得90.2%的三倍体。杨蕙平等使用细胞松弛素B诱导虾夷扇贝多倍体的研究表明在0.6mg/L的细胞松弛素的作用下，通过抑制第一极体获得了3.96%的三倍体，同时抑制第一极体和第二极体的释放获得的三倍体率为2.42%，实验过程中出现了大量的五倍体和非整倍体。秦艳平等对香港巨牡蛎的研究表明在温度2830 ，盐度为15-25，受精卵密度为2×108时，采用0.5 mg/L的CB在受精后15

27、18 min处理，诱导持续时间为20 min，可产生100%三倍体。李霞等人对细胞松弛素B，咖啡因，6-二甲基氨基嘌呤诱导皱纹盘鲍多倍的机理进行了研究，实验中使用的药物浓度分别为细胞松弛素0.5mg/L，6-二甲基氨基嘌呤90umol/L，咖啡因50mmol，诱导时间分别为20min、15min、10min，在染色观察诱导处理后染色体行为的过程中发现了联合二级分离、独立二级分离等分离方式，可以诱导产生三倍体。容寿柏等人分别使用冷热休克的方法诱导获得了近江牡蛎的三倍体，其中低温休克温度为10，高温休克温度为35，在受精后25min开始诱导，诱导处理20min，获得的三倍体率分别为69%和64%，

28、严正凛等利用冷休克规模化诱导杂色鲍三倍体时，在受精后15min后处理，处理温度为13.5-14，处理持续时间为10至15min，这些组合中获得稚贝在两年的检测中三倍体率分别为51.7%和70%，诱导九孔鲍时使用的组合为处理时间13.5min，处理温度为13-13.5处理持续时间为15-18min，稚贝阶段两年的三倍体率分别为54.5%和63.3%，田传远等采用低温休克诱导太平洋牡蛎三倍体时发现，采用4-5的处理温度，在授精15min之后处理15min可以获得较好的诱导效果，三倍体诱导率为36.8% Arai K 等对皱纹盘鲍的研究表明，在受精之后12min或者32min使用3冷休克诱导处理15

29、min或者使用35诱导处理15min都可以抑制第一极体或者第二极体的释放获得三倍体，或者在受精后7min或22min后使用200kg/cm2的压力抑制极体的释放也可以获得三倍体。 3.2贝类四倍体的诱导方法：贝类四倍体诱导所用的方法和三倍体诱导的原理大致相同，都是通过各种理化手段改变受精卵内的染色体数，然后经过胚胎发育获得四倍体个体。在初始研究阶段人们试图通过直接通过抑制第一极体、同时抑制两个极体的释放、抑制第一次卵裂、细胞融合和人工雌核发育等方法由二倍体贝类直接诱导获得四倍体贝类,这些方法都能诱导出四倍体的胚胎或者幼虫但是培育出存活的四倍体少有报道18。1988年Stephers等首次使用1

30、mg/L的细胞松弛素B诱导太平洋牡蛎四倍体获得了四倍体幼虫，诱导率达91%。Scarpa等在地中海贻贝受精后7min到35min的时段内使用1mg/L的细胞松弛素B进行处理，同时抑制了第一极体和第二极体的释放获得了18%的四倍体，并且在一个月之后的检测中仍检测到了四倍体。Gendreau等在诱导欧洲食用牡蛎四倍体时，使用细胞松弛素浓度为1mg/L，处理时间为20min，分别选在受精后5min及260min进行诱导处理，分别的获得了40%和53%的四倍体率。田传远等在使用6-二甲基氨基嘌呤诱导太平洋牡蛎四倍体的过程中发现，人工授精20min后，使用450umol/L的6-二甲基氨基嘌呤处理10m

31、in后可获得40%的四倍体诱导率。常亚青等在研究虾夷扇贝四倍体的过程中使用了多种化学物质进行实验，实验采用观察正常受精卵发育情况的方法确定诱导时机及诱导时间，实验发现使用细胞松弛素B、A-二甲基氨基嘌呤秋水仙素抑制第一次卵裂诱发四倍体的比例低于25%,使用细胞松弛素B在抑制第一极体可有效的产生四体，在12时在授精后20-22min开始处理在62-67min终止处理可以获得56.5%的四倍体率。杨蕙萍等使用细胞松弛素B诱导栉孔扇贝四倍体时发现在20的条件下，卵子受精后10min，分别诱导10min、20min抑制第一极体的排出获得的四倍体率为39.75%和30.24%，在授精后1h分别处理10、

32、15、20、25min以抑制第一次有丝分裂获得的四倍体率分别为21.36%、27.57%、28.41%、29.35%，Ximing Guo等使用0.5mg/L的肾上腺素诱导美洲牡蛎四倍体时，从受精后10min开始处理，处理至受精后30min成功的获得了四倍体，容寿柏等人研究了使用温度休克抑制第一次卵裂来诱导近江牡蛎四倍体的方法，实验结果表明冷休克组的最佳诱导温度为10，热休克组以39为最佳，获得的早期胚胎的四倍体率分别为30%和28%，Guo等利用35-40的温度通过抑制第一次卵裂的方式成功的获得了45%的四倍体。Guo等使用聚乙二醇(PEG)为融合剂,利用细胞融合的方法诱导太平洋牡蛎四倍体,

33、结果表明:合子间融合的效果较好,但是四倍体比例较低，精子间融合效果不理想，2细胞分裂球间的融合产生了30%的四倍体,但是未能成活（Guo X and Hershberger WK，1988）。包振民等利用PEG和脂质体进行了皱纹盘鲍的合子融合实验,获得的四倍体率分别为25%和12%（包振民，1997）。Cdaoret等通过600v/cm的电脉冲诱导2细胞期的分裂球融合的方法在太平洋牡蛎中获得了20%的四倍体胚胎，在贻贝中获得了26%的四倍体胚胎（Cadoret J P，1992）。虽然直接利用二倍体产生四倍体的方法多有研究，但是极少有报道获得了成活的四倍体，推测是因为四倍体的核较大，正常二倍体

34、的卵子较小，在卵裂过程中细胞数目不足引起个体死亡(Guo，1994),因此人们开始研究使用三倍体来诱导四倍体的方法，因为三倍体的卵子体积较大，可能有利于四倍体的存活，通过这种方法Guo等尝试了利用三倍体产生的卵与正常精子受精后抑制其第一极体排放的新方法,成功的获得了存活的四倍体太平洋牡蛎，并且在其性腺发育成熟后，通过和正常的二倍体杂交获得了全三倍体后代，为三倍体的产业化发展提供了一种新途径，具有很高的应用价值(Guo1996)。4影响贝类多倍体诱导的因素贝类多倍体的诱导效果会受到多种因素的影响，一般来讲诱导处理的强度、时机和处理的时间最为重要。适宜的诱导条件应当满足诱导率较高，对生物的负面影响

35、小的条件。诱导处理强度：在使用化学方法诱导贝类多倍体的实验中，往往会出现在一定的范围内多倍体诱导率与使用诱导剂的浓度呈正相关的关系，在超过一定值后诱导率变化不大甚至出现降低的情况，而且现有的理化处理手段往往会对受精卵造成一定程度的损害，影响之后的生长发育过程。因此，应根据处理对象的不同、综合考虑多倍体诱导率和后续的生长发育情况和来确定出最佳处理强度诱导处理的时机：目前诱导贝类多倍体多是通过抑制PB1或者PB2的释放获取多倍体。因此对于处理时机的把握十分重要，受温度、性腺发育状况等因素的影响，受精卵排放极体的时间不尽相同，因此处理时机不能一概而论，为了优化处理时机的把握，Allen等提出了以第一

36、极体PB1或第二极体PB2出现的比率作为确定诱导时机的指标()。在多数经济牡蛎品种和扇贝经济品种在PB1出现30-50%是诱导可得最大三倍体率34-37；有的则在受精卵释放出第一个第二极体时处理可检测到三倍体诱导率最大。诱导处理时长：诱导时长需要能够保证受精卵获得充分的处理又需要降低处理条件对于受精卵造成的不良影响，不同种的贝类最适诱导时长不尽相同，根据以往研究，处理时长一般在15-20min最佳，也有实验中以对照组的发育情况的参照确定处理时长。此外配子的质量及受精卵发育的同步性也会对诱导效果产生影响，由于实验过程中卵子往往来自不同的母本，卵子的发育程度不尽相同，受精能力及受精后发育速度会存在

37、不同，会影响对处理时机的把控，为了避免这种情况在实验中应当尽量选取配子发育良好的实验材料，或者可以通过解剖获得精卵后使用5-羟色胺等进行促熟，然后再进行受精及诱导操作，用于诱导的化学试剂往往存在毒性，会对受精卵的发育造成一定的损害，造成孵化率低等问题。在诱导过程中造成的染色体数目和结构的异常变化(孙振兴等1998)也是造成多倍体胚胎存活能力差的原因。5倍性检测方法目前,在贝类多倍体诱导研究中,常使用染色体分析法和流式细胞术对实验对象进行倍性检测。染色体数目分析鉴定贝类是最直接可靠的方法，在检测倍性方面有广泛的应用，基本原理是对对贝类早期胚胎、担轮幼虫或幼贝的鳃组织等进行染色,压片或滴片后对其进

38、行观察计数，通过对比其与已知倍性的染色体数目的对比确定倍性组成（李慷均，2004），常用染色剂包括苏木精一铁明矾、乙酸一地衣红或Giemas染液等。流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速的测量并显示悬浮在液体中的细胞的一系列重要的生理、生化特征。使用流式细胞仪测定倍性的原理在于流式细胞仪可以检测出每个细胞的荧光强度，当由特异性的染料染色后的细胞经过仪器时，仪器可以使用激光或者紫外光激发细胞核上的荧光染料，因为DNA的含量存在差异所以荧光强度也存在差异，将我们得到的荧光强度和己知的二倍体细胞的荧光强度进行对比,就可以判断被检细胞群体的倍性组成。.第二节 单体牡蛎培育模式的优化 1

39、 双壳贝类附着变态的研究 贝类成体大多数营附着、固着、埋栖或匍匐等生活方式，而其幼虫营浮游生活，在形态生活方式等等方面与成体有很大区别，幼虫需经历一系列的发育阶段才能转变为成体，多数双壳贝类在发育过程中都要经过附着变态的过程，附着变态是双壳贝类从幼虫向成体转变的一个重要发育阶段。能否顺利附着变态对种群的数量有着巨大的影响，可以直接决定苗种生产的成败。研究贝类幼虫的附着变态过程及其机理有重要的应用价值，研究其机理有助于阐明他们的种群数量变动，同时可以借助诱导物诱导幼虫的附着变态，促进重要经济贝类增养殖的发展。 人们从分子水平，生理水平和生态水平三个不同的层次对于附着变态进行了研究。目前人们对一些

40、重要经济贝类的附着变态机理研究比较深入。目前,有关海洋无脊椎动物幼虫附着变态的模型3个:双调控模型；上行调节模型；脂肪酸调节模型。双调控模型以牡蛎为代表，Coon等认为牡蛎幼虫的附着变态是由多巴胺行为途径和肾上腺素行为途径两种方式控制着的。当外界条件适宜时，牡蛎幼虫会分泌多巴胺，从而激活行为途径，行为途径激活后牡蛎幼虫对外界环境的感觉更敏感，在外界环境适宜的情况下幼虫体内会分泌肾上腺素或去甲肾上腺素，肾上腺素或者去甲肾上腺素作用于靶组织诱导牡蛎幼虫的变态。上行调节模型以鲍鱼为代表，Baxter等认为红鲍的附着变态由形态发生途径和调控途径控制，在两种途径的影响下使得红鲍幼虫对外界环境变得敏感。其

41、中环磷酸腺苷（cAMP）作为形态发生途径的第二信使，能够激活蛋白激酶A，使细胞产生去极化，而调控途径以甘油二酯（DG）和磷脂酰肌醇（IP3）作为第二信使，通过激活蛋白激酶C使细胞产生去极化。脂肪酸途径以多毛类为代表，Jensen等人认为幼虫细胞内的由脂肪氧合酶分解不饱和脂肪酸产生的小分子物质是这一途径的第二信使，激活了细胞膜上的K+通道，从而使得幼虫变态（张涛，2000）。幼虫在发育到一定阶段后就具有了附着变态的能力，在适宜的环境中会寻找适宜的附着基完成附着变态。附着变态是一个复杂的过程，分为附着和变态两步，附着过程是选择合适的附着基的过程，是可逆的，而变态过程是形态变化过程，是不可逆的。幼虫

42、寻找适宜附着基的过程可分为3个阶段：1大范围探索阶段，幼虫主要是沿直线爬行，从一个地点转移到另一个地点；2小范围探索阶段， 探索步调缩短增加同时探索方向改变的频率；2检查阶段，在这个阶段，幼虫在很小范围内探索附着地点适宜情况，在它体长范围内旋转移动。幼虫变态后在形态生活习性上都会发生很大的变化，幼虫完成变态有三个主要标志：1形成含有钙质的次生壳2面盘萎缩退化，鳃形成开始用鳃呼吸摄食3生活习性发生改变，变态前幼虫多营浮游和匍匐生活，变态后转变为成体的生活方式主要营附着、固着、匍匐或埋栖生活（张涛，2000）。贝类附着变态会受到物理因素、化学因素等很多因素的影响，物理因素主要有盐度、温度、附着基、

43、溶解氧、流速、和光照等。化学因素主要包括金属阳离子、儿茶酚胺化合物、氨基酸类化合物、胆碱及其衍生物、影响细胞内环化腺苷酸的化合物五大类。幼虫本身的健康状况、同种个体的分泌物、微生物膜、饵料分泌物也可以影响幼虫的附着变态。对于影响贝类附着变态的研究有很多（杨智鹏等，2016；吴宝玲等，1999；李成华等2003），何义朝等发现墨西哥湾扇贝在度为28-30时具有最高的变态发生率，在温度23.4-27.5时，变态率无明显变化，在温度高于31时变态率急剧下降（何义朝等，1999），海湾扇贝适宜的变态盐度在23.8-26.8的范围之内（何义朝和张福绥，1990），对于不同附着基对毛蚶幼虫附着变态影响的研

44、究表明深色的附着基附着效果要优于相同材质的浅色附着基的效果，不同材料的附着基的幼虫附苗量也不同（高霄龙等，2013），于瑞海等的研究表明KCI可以影响海湾扇贝的附着变态，影响效果的溶液浓度及处理时间都相关， 30mmol/L的KCI溶液处理12h可以显著的促进海湾扇贝的附着变态（于瑞海等，2001）。对于羊鲍的研究也表明氨基丁酸（GABA）、氯化钾溶液都可以影响羊鲍的附着变态，经过浓度为10-4mol/L的GABA诱导72h后羊鲍的附着率和变态率分别可以达到26.27%和22.26%，而10-5mol/L的5-羟色胺诱导72h后，羊鲍附着率为20.73%变态率为20.18%，氯化钾溶液虽然对羊

45、鲍的变态没有促进作用但是可以促进羊鲍的附着过程（丁敬敬，2016），对西施舌附着变态的研究也证明了肾上腺素、氨基丁酸、左旋多巴、Ca2+可以影响到附着其变态过程（高如承和刘文彪，2006），对葡萄牙牡蛎的研究表明K+、Ca2+、Mg2+等金属阳离子可以影响到葡萄牙牡蛎的附着变态（祁剑飞，2013）。 2单体牡蛎的研究现状目前牡蛎育种及养殖过程中，普遍以扇贝壳作为附着基，使牡蛎幼虫固着在扇贝壳上，再将苗种转移至海区进行养成，在收获时需要将牡蛎从附着基上剥离下来，并将在生长过程中固着到一起的牡蛎分离开，这需要大量的劳动给牡蛎的收获带来了不便。而且数量较多的牡蛎固着在一起生长，导致其生长空间受到限制

46、，牡蛎之间相互挤压导致其壳形不规则不美观，同时由于对食物空间等的竞争，使养殖牡蛎的生长速度不同，个体间的差异较大。而单体牡蛎在养殖过程中，可充分利用水体，在适宜的养殖密度下不存在对空间的竞争，个体能充分生长，壳形规则美观，对食物的竞争也比较小，可以充分发挥牡蛎的生长潜力，这些条件都利于提高牡蛎的经济效益，因此人们开始探索单体牡蛎的生产方法，目前常用的生产单体牡蛎的方法有：肾上腺素（EPI）或去甲肾上腺素（NE）处理法、颗粒固着基采苗法、先固着后脱基法三种。国外对于单体牡蛎的研究较早，1974年Hidu H等使用抛光大理石作为牡蛎附着基然后将附着的稚贝剥离下来形成单体（Hidu H et al，

47、1974），1981年Breber P.等对单体牡蛎的养成设备进行了研究（Breber P，1981），随着对双壳贝类附着变态机理的研究人们发现肾上腺素和去甲肾上腺素可以只诱导牡蛎幼虫变态而不诱导其附着，在1986年Steven L.Coon等研究了使用肾上腺素和去甲肾上腺素诱导生产太平洋牡蛎及美洲牡蛎单体苗种的方法（Coon S L. et al，1986；Coon, S. L,王昭萍,1989）。目前太平洋牡蛎、美洲牡蛎、欧洲牡蛎等品种的单体牡蛎养殖模式在欧洲和美洲已为一种常见的养殖方式（杨爱国等，1995），且市场对单体牡蛎的需求量较大，创造了很高的经济价值。而我国单体牡蛎的研究开始较晚

48、，1987年有报道从美国引进单体牡蛎在威海试养成功，我国也有养殖户将自然海区中固着到岩石上的牡蛎苗剥离后作为单体牡蛎进行养成，在乳山湾一带,人们将海边岩石上自然固着的褶牡蛎苗剥下,进行滩涂播养，播养的牡蛎生长速度快于自然状态下的牡蛎,但是剥离自然苗种需要大量的劳动力，而且在操作过程中容易对幼苗造成损伤，导致幼虫的死亡率较高（李石磊和常亚青，2007）。肾上腺素及去甲肾上腺素在牡蛎附着变态过程中的作用被发现后，我国科研工作者也逐步开始这方面的研究，1991年于瑞海探究了有关单体苗种的生产技术（于瑞海，1991），1992年王昭萍等研究了肾上腺素和去甲肾上腺素对褶牡蛎的诱导效果（王昭萍等，1992

49、），1993杨爱国等通过先附着后脱基，肾上腺素诱导两种方式获得了太平洋牡蛎单体（杨爱国等，1993）。对单体牡蛎的后期养成也有研究报道（王华青等，2013；李石磊等，2013；姚瑶等2016），如姚振刚等对太平洋牡蛎单体笼养高产技术进行了研究，成功摸索出了一套高产技术（姚振刚和刘颇贤，1998），对单体三倍体牡蛎的培育也多有报道和研究（于瑞海，2005；李奕雯，2013；王昭萍，2003；于瑞海，2006；于瑞海，2008），对葡萄牙牡蛎（陈亨，2016）、熊本牡蛎（王昌勃，2016）、近江牡蛎（丘广艳，2016）、香港巨牡蛎（陈洪发，2015）等不同品种牡蛎诱导单体研究也相继开展。目前我国单

50、体牡蛎还没有规模化的养殖，主要原因在单体牡蛎苗种的供应较少，而且单体牡蛎的育种养成和传统牡蛎的养成方式有很大的区别，单体牡蛎的中间培育技术还不成熟，在养殖过程中特别是在牡蛎个体较小时的死亡率较高，限制了单体苗种的数量，同时养殖户也缺乏相关的配套设施及养成经验。虽然诱导单体牡蛎的研究已经开展多年，但是多集中于将牡蛎诱导为单体这一过程，对后续的培育方法鲜有研究，因此探索一种适宜的养殖模式，实现单体牡蛎养殖的规模化，可以极大的促进牡蛎养殖业的发展，创造巨大的经济效益。3获取单体牡蛎的常用方法目前常用的单体牡蛎生产方法主要有：肾上腺素（EPI）和去甲肾上腺素（NE）处理法、颗粒固着基采苗法、先固着后脱

51、基法三种。 3.1肾上腺素去甲肾上腺素处理法：肾上腺素和去甲肾上腺素可以只诱导牡蛎幼虫变态而不诱导其附着，在牡蛎幼虫即将附着变态时使用一定浓度肾上腺素或者去甲肾上腺素诱导一定时间可以使牡蛎幼虫直接变态而无需附着，从而直接获得单体牡蛎。Steven L Coon 等的研究表明，肾上腺素和去甲肾上腺素诱导太平洋牡蛎和美洲牡蛎的最适浓度为10-4mol/L，处理1小时后幼虫变态率基本接近最大值，但是随着诱导时间延长至24小时，变态率还会有一定的升高，实验中使用肾上腺素诱导24小时幼虫变态率大于90%，同时实验发现去甲肾上腺素的效果比肾上腺素诱导的效果差一些，在Steven L Coon实验的基础上杨

52、爱国等人对肾上腺素诱导太平洋牡蛎单体的条件进行了进一步的实验，实验使用肾上腺素浓度梯度为5×10-6 mol/L，10×10-6 mol/L，20×10-6 mol/L，30×10-6 mol/L，诱导时间梯度设定为0.5h至2h在实验中发现在随着肾上腺素药物浓度由低到高牡蛎幼虫的不固着变态率也逐渐升高，而20×10-6 mol/L，30×10-6 mol/L组的不固着变态率基本相同，而对于处理时间的实验表明处理0.5h的不固着变态率明显较低，当处理时间延长至1h后不固着变态率有显著的增加，而处理1-2小时的效果基本相同，所以认为较适

53、宜的肾上腺素浓度为20×10-6 mol/L而较适宜的处理时间为1h，同时通过进一步的分析认为如果药物浓度降低需适当的增加处理时间，随着药物浓度的增加诱导时间可以相应缩短，王昭萍对单体褶牡蛎的研究表明，肾上腺素和去甲肾上腺素诱导的最适浓度为10-4 mol/L，最适处理时间为3h，幼虫的的不固着变态率分别达到47.7%和46.6%，延长诱导时间不固着变态率增加的不明显，在诱导褶牡蛎不固着变态的实验中肾上腺素和去甲肾上腺素的诱导效果差异不明显，诱导过程对稚贝的生长发育没有明显的影响，王昌勃等对肾上腺素诱导熊本牡蛎单体的实验中发现，肾上腺素诱导的最适浓度为10-4mol/L最佳诱导时间为

54、1h，实验还探究了熊本牡蛎适宜的诱导密度，最佳诱导密度为1000ind/ml，同时研究发现肾上腺素诱导的浓度过高，诱导的时间过长会对稚贝的存活造成影响，陈亨等诱导葡萄牙及太平洋牡蛎单体时发现葡萄牙牡蛎对肾上腺素耐受性较强，最适宜诱导浓度为5×10-4mol/L，在此最适浓度下最佳处理时间为12h，对太平洋牡蛎的实验中发现肾上腺素浓度为5×10-5mol/L及 10-4mol/L两者诱导效果差异不显著，综合考虑认为适宜诱导浓度为5×10-4mol/L，在此浓度下最佳诱导时间为8h。3.2颗粒固着基采苗法：采用微细颗粒作为牡蛎幼虫的固着基，使每个颗粒上固着少一个牡蛎，

55、这样获得的牡蛎苗种还是单个的游离的。王昭萍等利用贝壳粉做为固着基获得单体时发现在0.15-0.35mm的颗粒固着基中，幼虫只固着与偏大的颗粒上，且单体率大100%，小于此范围的颗粒上未见有幼虫附着，而大于此范围颗粒上虽然幼虫固着较多，但存在同时固着两个稚贝的现象，Hidu等的研究也表明用0.30ram的颗粒做幼虫固着基较好，因此在使用颗粒固着基时应当选用与幼虫大小相仿的颗粒，可以使幼虫顺利的固着同时也避免多个幼虫附着到同一颗粒的情况。3.3先固着后脱基法：是使幼虫先固着后脱离固着基成为单体牡蛎的方法，1974年Hidu H等使用抛光大理石作为牡蛎附着基，然后将牡蛎剥离获得单体，我国部分地区也有

56、将天然生长的牡蛎剥离开作为单体养殖的记录，在牡蛎的人工育苗过程中也有采用合适的附着基进行固着后脱基处理获得单体的生产方式，材料要求适宜牡蛎幼虫附着变态，同时应有一定的光滑度或应易弯折以方便牡蛎单体的剥离，当牡蛎幼体生长到一定规格时进行再进行脱基处理，以减少脱基处理对牡蛎造成的损伤。杨爱国等使用聚丙烯扁条包装带编织成固着基供牡蛎附着并在后期进行脱基处理获得单体，实验发现幼虫在刚固着时或固着后不久不宜进行脱基处理，此时幼虫个体较小，次生壳薄且脆弱，脱基处理对幼虫的损害严重，当牡蛎生长至壳高达0.5cm时适宜进行脱基处理，王昭萍等探索过使用浅灰色塑料板、贝壳、波形瓦片等不同材料附着基然后获得单体褶牡

57、蛎的方式，对于贝壳等材质较硬且表面较粗糙的固着基而言脱基处理较为困难，对于塑料板，网片等较柔软的材料可以采用弯折揉搓的方法使牡蛎幼虫脱离固着基，但仍需待牡蛎壳长达1-2cm时进行，王昌勃等在熊本牡蛎单体苗种的发现使用灰色聚乙烯波纹板作为固着基时，幼虫易附着，剥离方便，获得的单体显著高于筛绢网，塑料薄膜，网衣等材料，是一种较理想的固着基。第二章“海大1号”四倍体的诱导 二倍体牡蛎虽然可以通过抑制第一极体释放、同时抑制两个极体释放、细胞融合、抑制细胞卵裂等多种方式诱导获得四倍体的胚胎或者幼虫，但是少有报道称获得存活的四倍体成体，而Guo等利用三倍体太平洋牡蛎的卵子和正常二倍体太平洋牡蛎精子受精后抑

58、制第一极体释放的方式首次获得了具有成活力的四倍体牡蛎，并且所获四倍体能够发育至性腺成熟具有繁殖力。因此本实验将使用“海大1号”三倍体牡蛎为材料进行四倍体的诱导。 Desrosiers 等使用新的诱导剂6-二甲基氨基嘌呤诱导获得了太平洋牡蛎三倍体（Desrosiers R R et al，1993），之后6-而甲氨基嘌呤逐渐成为诱导贝类多倍体的常用化学药物，它的毒性较低，对受精卵和胚胎造成的损伤相对较小，且易溶于水方便操作，被认为是能够替代细胞松弛素B的理想诱导剂；近年来王昭萍等发现低渗可以抑制极体的释放从而产生多倍体，低渗能够诱导贝类三倍体的产生以被多个实验证实，使用低渗诱导贝类多倍体操作方便

59、，成本低廉，可以避免传统诱导方式中化学药物对操作者的潜在威胁，是一种理想的手段。在本次实验中将对渗透压、6-二甲基氨基嘌呤诱导“海大1号”四倍体的效果进行探究，探寻它们适宜的诱导强度、诱导时机、诱导时间的组合以获得海大1号诱导四倍体的最佳条件。1实验材料和方法1.1实验材料与器材实验材料：实验于山东省莱州市长渔水产有限公司进行，实验用“海大1号”三倍体亲贝全部经流式细胞术确定倍性为三倍体，和 “海大1号” 二倍体亲贝一起在育苗车间内进行促熟培育，培育过程中进行投饵换水等日常管理，待性腺发育较好时待用实验器材与药品：6-二甲基氨基嘌呤，海盐，纯净水，盐度计，20L塑料桶，50ml、100ml、500ml、2000ml烧杯，吸管，胚胎皿，显微镜，500目筛绢，解剖刀，盖玻片，计时器等。 1.2试验方法1.2.1精卵的获取和授精卵子的获得：选取“海大1号”三倍体进行解剖，通过显微镜检查区分雌雄，镜检过程中需特别注意观察有无雌雄同体个体