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文档简介
1、春季传染病病原菌的生长、繁殖模拟1、细菌的生长与繁殖 1105-李思琦2、细菌的生长曲线 1105-刘欢3、微生物的代谢 1106-刘晓甜 就一般意义而言,一个 微生物个体 应具备生长和繁殖的全能性。单细胞微生物如细菌、酵母菌等,一个细胞就是一个个体。一、 微生物的个体生长与繁殖(一) 细菌的个体生长与繁殖 细菌一般以简单的二分裂法进行无性繁殖,个别细菌如结核杆菌偶有分枝繁殖的方式。在适宜条件下,多数细菌繁殖速度极快,分裂一次需时仅2030分钟。细菌分裂时,菌细首先增大,染色体复制。(二)细菌拟核 DNA 的复制与分离 细菌的拟核( nucleoid )是一个环形的双链 DNA 分子,该 DN
2、A 分子也称为细菌染色体( bacterial chromosome )。 (如图A)大肠杆菌在细胞生长过程中,其双链环形 DNA 分子的复制在一个特定的位置上起始,该位置称为复制原点,也称复制起点。复制原点是一约由 300 个碱基组成的特异序列,它能被特异的起始蛋白所识别; DNA 复制从原点开始,向两个相反的方向延伸,最终形成两个子染色体 DNA 分子。 随后,细胞分裂形成的两个子代细胞中,分别含有一个遗传信息完整的拟核。 (如图B)根据研究结果推测,细菌染色体 DNA 的复制原点附着在细胞质膜的特定部位,在细胞生长中,随着细胞膜的增长延伸,将两个子 DNA 分子拉向细胞两极,最终完成细胞
3、分裂。大肠杆菌在适宜的生长环境中进行快速生长时,在 DNA 分子上往往出现前一次的复制还未完成,而子 DNA 链上的复制原点又开始了新的复制,因而在 DNA 分子上可出现多个复制叉现象导致一个细胞中常常含有多个 DNA 分子,以适应细胞快速生长与繁殖的需要。一般在生长终止的细胞中含有一个拟核DNA分子。 图 5-1 细菌染色体 DNA 的复制(三)细菌细胞壁的合成与扩增(三)细菌细胞壁的合成与扩增 实验表明,所有种的细菌并非用同一种方式合成与扩增细胞壁。酿脓链球菌( Streptococcus pyogenes )细胞壁的扩增位置与方式至今已研究得较为清楚。先提取酿脓链球菌的细胞壁成分作抗原,
4、获得相应的能与细胞壁起结合反应的抗体,用荧光色素标记该抗体。然后,将酿脓链球菌细胞置于含有此种已标记抗体的培养基中培养,酿脓链球菌细胞壁一旦被带有荧光色素的抗体所结合,就能在荧光显微镜下显示荧光而被分辨;再把带有荧光的酿脓链球菌细胞转移至不含上述荧光抗体的培养基中培养,随着酿脓链球菌细胞的生长,细胞上无荧光部分即为新合成与扩增的细胞壁区域(图 5-2 )。从图 5-2 中培养 30 分钟的球菌细胞可见,新合成的细胞壁成分被运送和添加在球菌壁中部称为壁带( wall bands )的赤道位置上,新合成的细胞壁向两边延伸,并随生长的继续,在球菌壁中部出现内陷,逐渐形成横隔( septum ),最后
5、子细胞分离。 图 5 2 S treptococcus pyogenes 细胞壁的合成延伸 (引自 Robert F. Boyd , 1984 , p337 )图 5 3 细胞壁生长区与扩增方向 (引自 Michael T. Madigan , 2003 ,第 141 页)细菌可以以无性或者遗传重组两种方式繁殖,最主要的方式是以二分裂法这种无性繁殖的方式:一个细菌细胞细胞壁横向分裂,形成两个子代细胞。并且单个细胞也会通过如下几种方式发生遗传变异:突变(细胞自身的遗传密码发生随机改变),转化(无修饰的DNA从一个细菌转移到溶液中另一个细菌中),转染(病毒的或细菌的DNA,或者两者的DNA,通过噬
6、菌体转移到另一个细菌中),细菌接合(一个细菌的DNA通过两细菌间形成的特殊的蛋白质结构,接合菌毛,转移到另一个细菌)。细菌可以通过这些方式获得DNA,然后进行分裂,将重组的基因组传给后代。许多细菌都含有包含染色体外DNA的质粒。 细菌的繁殖 处于有利环境中时,细菌可以形成肉眼可见的集合体,例如菌簇。 细菌以二分裂的方式繁殖,某些细菌处于不利的环境,或耗尽营养时,形成内生孢子,又称芽孢,是对不良环境有强抵抗力的休眠体,由于芽孢在细菌细胞内形成,故常称为内生孢子。 芽孢的生命力非常顽强,有些湖底沉积土中的芽孢杆菌经500-1000年后仍有活力,肉毒梭菌的芽孢在pH 7.0时能耐受100煮沸5-9.
7、5小时。芽孢由内及外有以下几部分组成: 1芽孢原生质(spore protoplast,核心core):含浓缩的原生质。 2内膜(inner membrane):由原来繁殖型细菌的细胞膜形成,包围芽孢原生质。还有细模质。 3芽孢壁(spore wall):由繁殖型细菌的肽聚糖组成,包围内膜。发芽后成为细菌的细胞壁。 4皮质(cortex):是芽孢包膜中最厚的一层,由肽聚糖组成,但结构不同于细胞壁的肽聚糖,交联少,多糖支架中为胞壁酐而不是胞壁酸,四肽侧链由L-Ala组成。 5外膜(outer membrane):也是由细菌细胞膜形成的。 6外壳(coat):芽孢壳,质地坚韧致密,由类角蛋白组成(
8、keratinlike protein),含有大量二硫键,具疏水性特征。 7外壁(exosporium):芽孢外衣,是芽孢的最外层,由脂蛋白及碳水化合物(糖类)组成,结构疏松。 细菌的生长曲线 定量定量描述液体培养基中微生物描述液体培养基中微生物群体生长规律群体生长规律的实验曲的实验曲线,称为生长曲线线,称为生长曲线(growth curve)。 在微生物学中提到的在微生物学中提到的“生长生长”,均指群体生长。,均指群体生长。根据微生物的生长速率常数(growthrateconstant),即每小时的分裂次数(R)的不同,一般可把典型生长曲线粗分为迟缓期迟缓期、指数生长期指数生长期、稳定生稳定
9、生长期长期和和衰亡期衰亡期等4个时期 。 1.迟缓期迟缓期(Lag phase)又称又称停滞期、停滞期、延滞期延滞期、调整期调整期和和适应期适应期。指少量单细胞微生物接种到。指少量单细胞微生物接种到新鲜培养基后,在开始培养的一段时间内细胞数目不立即增加,或增加很新鲜培养基后,在开始培养的一段时间内细胞数目不立即增加,或增加很少,生长速度接近于零的一段时期少,生长速度接近于零的一段时期代谢系统是正在适应新环境。代谢系统是正在适应新环境。 迟缓期的特点迟缓期的特点 生长速率常数为零生长速率常数为零 细胞形态变大或增长,许多杆菌可长成丝状细胞形态变大或增长,许多杆菌可长成丝状 细胞内细胞内RNARN
10、A尤其是尤其是rRNArRNA含量增高,原生质呈嗜碱性;含量增高,原生质呈嗜碱性; 合成代谢十分活跃,核糖体、酶类和合成代谢十分活跃,核糖体、酶类和ATPATP合成加速,易产生各种诱导酶;合成加速,易产生各种诱导酶; 对外界不良条件如对外界不良条件如NaCINaCI溶液浓度、温度和抗生素等理化因素反应敏感。溶液浓度、温度和抗生素等理化因素反应敏感。细胞处于活跃生长中,只是分裂迟缓。细胞处于活跃生长中,只是分裂迟缓。在此阶段后期,少数细胞开始分裂,曲线略有上升在此阶段后期,少数细胞开始分裂,曲线略有上升2.对数生长期对数生长期又称又称指数生长期指数生长期(Exponential phase)。指
11、)。指在生长曲线在生长曲线中,紧接着迟缓期的一段细胞数以几何级数中,紧接着迟缓期的一段细胞数以几何级数增长的时期增长的时期 。特点特点 生长速率常数生长速率常数R R最大,因而细胞每分裂一次所需的时间最大,因而细胞每分裂一次所需的时间代时代时(generation time ,G G,又称,又称世代时间世代时间或或增代时间增代时间)或原生质增加一倍所需的或原生质增加一倍所需的倍增时间倍增时间(doubling time)最短;)最短; 细胞进行细胞进行平衡生长平衡生长(balanced growth),菌体各部分的成),菌体各部分的成分十分均匀分十分均匀; 酶系活跃,代谢旺盛;酶系活跃,代谢旺
12、盛;稳定生长期稳定生长期( stationary phase)又称又称恒定期或最高生长期恒定期或最高生长期。其特点是生长速率常数其特点是生长速率常数R等于等于0,即处于,即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等,或正生长与负生长相等的动态衡新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等,或正生长与负生长相等的动态衡之中。之中。进入稳定期,细胞重要的分化调节阶段,进入稳定期,细胞重要的分化调节阶段,细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物内含物;芽孢杆菌一般在这时开始芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢形成芽孢或或建立自然感受态建立自然感受态等;等;有的微生物在稳定期时还开始合成
13、抗生素等有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产物次生代谢产物(secondary metabolites)稳定期产物稳定期产物(idiolites)。)。稳定生长期到来的原因稳定生长期到来的原因 营养物尤其是生长限制因子的耗尽;营养物尤其是生长限制因子的耗尽; 营养物的比例失调,例如营养物的比例失调,例如CN比值不合适等;比值不合适等; 酸、醇、毒素或酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积;等有害代谢产物的累积; pH、氧化还原势等理化条件越来越不适宜等、氧化还原势等理化条件越来越不适宜等。(四)(四)衰亡期衰亡期( decline phase或或death phase)在衰亡期
14、中,个体死亡的速度超过新生的速度,整个群体呈现负在衰亡期中,个体死亡的速度超过新生的速度,整个群体呈现负生长状态(生长状态(R为负值)。为负值)。产生衰亡期的原因产生衰亡期的原因外界环境对继续生长越来越不利,外界环境对继续生长越来越不利,Eg.Eg.营养物质耗尽和有毒代谢产物营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累等,的大量积累等,从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢,继而从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢,继而导致菌体死亡。导致菌体死亡。该时期死亡的细菌以对数方式增加,但在衰亡期的后期,由于部分细该时期死亡的细菌以对数方式增加,但在衰亡期的后期,由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率
15、降低,仍有部分活菌存在。菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低,仍有部分活菌存在。 通过对微生物生长曲线的分析,可见: 微生物在对数生长期生长速率最快。 营养物的消耗,代谢产物的积累,以及因此引起的培养条件的变化,是限制培养液中微生物继续快速增殖的主要原因。 用生活力旺盛的对数生长期细胞接种,可以缩短延迟期,加速进入对数生长期。 补充营养物,调节因生长而改变了环境 pH 、氧化还原电位,排除培养环境中的有害代谢产物,可延长对数生长期,提高培养液菌体浓度与有用代谢产物的产量。 对数生长期以菌体生长为主,稳定生长期以代谢产物合成与积累为主。 根据发酵目的的不同,确定在微生物发酵的不同时期进行收获。微生
16、物生长曲线可以用于指导微生物发酵工程中的工艺条件优化以获得最大的经济效益。 通过对微生物生长曲线的分析,可见: 微生物在对数生长期生长速率最快。 营养物的消耗,代谢产物的积累,以及因此引起的培养条件的变化,是限制培养液中微生物继续快速增殖的主要原因。 用生活力旺盛的对数生长期细胞接种,可以缩短延迟期,加速进入对数生长期。 补充营养物,调节因生长而改变了环境 pH 、氧化还原电位,排除培养环境中的有害代谢产物,可延长对数生长期,提高培养液菌体浓度与有用代谢产物的产量。 对数生长期以菌体生长为主,稳定生长期以代谢产物合成与积累为主。 根据发酵目的的不同,确定在微生物发酵的不同时期进行收获。微生物生
17、长曲线可以用于指导微生物发酵工程中的工艺条件优化以获得最大的经济效益。本实验采用比浊法测定,由于细菌悬浊液的浓度与光密度(OD值)成正比,因此可以利用分光光度计测定菌悬浊液的光密度来推知菌液的浓度,并将所测的OD值与对应的培养时间作图,即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。实验流程如下:制备菌液制备菌液标记编号标记编号接种培养接种培养绘制生长绘制生长曲线曲线生长量生长量测定测定取大肠杆菌斜面菌种1支,接入牛肉膏蛋白胨培养液中(250ml/500ml),静置培养18h。 标记编号:取试管11个,分别编号为:空白、0、1、3、5、7、9、11、24、48、72h。 用2ml无菌吸管分别准确吸取2ml
18、菌液加入三角瓶中,于37下振荡培养。然后分别按对应时间从三角瓶中取出10ml菌液注入试管中,立即放冰箱中贮存,待培养结束时一同测定OD值。 将未接种的牛肉膏蛋白胨培养基(空白)倾倒入比色皿中,选用600nm波长分光光度计上调节零点,作为空白对照,并对不同时间培养液从0 h起依次进行测定,对浓度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定,使其OD值在0.20.8以内,经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数,才是培养液实际的OD值。 以培养时间为横坐标,以OD值为纵坐标绘制生长曲线。微生物的代谢微生物的代谢 代谢(代谢(metalsolism)是细胞内发生的各种化学反应的总称,由分解代谢
19、)是细胞内发生的各种化学反应的总称,由分解代谢(catabolism)和合成代谢和合成代谢(anabolism)两个过程组成。两个过程组成。代谢是微生物表现生物活性的主要形式之一,是微生物学研究的重要领域之一,深入研究微生物代谢规律对揭示生命现象及其本质和开发利用微生物资源具有重要意义。分解代谢是指细胞将大分子物质降解成小分子物质,并在这个过程中产生能分解代谢是指细胞将大分子物质降解成小分子物质,并在这个过程中产生能量的过程。量的过程。一般可分为三个阶段:第一阶段是将蛋白质、多糖及脂类等大分子营养物质降解成氨基酸、单糖及脂肪酸等小分子物质;第二阶段是将第一阶段的分解产物进一步降解成更为简单的乙
20、酰辅酶A、丙酮酸等中间产物,在此阶段还可以产生一些ATP、NADH及FADH2等;第三阶段是通过三羧酸循环将第二阶段产生的乙酰辅酶A、丙酮酸等中间产物完全降解生成CO2,并产生ATP、NADH及FADH2。合成代谢是指细胞利用简单的小分子物质合成复杂大分子的过程,在这个过合成代谢是指细胞利用简单的小分子物质合成复杂大分子的过程,在这个过程中要消耗能量。程中要消耗能量。合成代谢所利用的小分子物质来源于分解代谢过程中产生的中间产物或环境中的小分子营养物质。无论是分解代谢还是合成代谢,代谢途径都是由一系列连续的酶促反应构成的,前一步反应的产物往往是后一步反应的底物。细胞通过各种方式有效地调节相关的代谢反应,从而保证整个代谢途径的协调性与完整
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