医学微生物学实验：实验9

1、实验九实验九病毒包涵体观察（示教）病毒CPE观察（示教）登革病毒的抗体检测（示教）病例六2总结 HIV感染初筛与确证实验（结果示教）流感病毒血凝试验（操作，每组一份）血凝抑制试验（示教）病毒病毒CPE（cytopathic effect ）CPE 有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变，称为细胞病变效应.常见变化：细胞融合、变圆、坏死、溶解、脱落Monolayer of intact Vero cells未形成蚀斑的正常细胞未形成蚀斑的正常细胞形成蚀斑的病变细胞形成蚀斑的病变细胞登革病毒蚀斑试验登革病毒蚀斑试验结果分析与用途结果计算:l计数空斑形成数，计算病毒空斑形成单位（PFU）；lPF

2、U/mL=稀释倍数该稀释度计数的平均空斑数/病毒液体积 用途：检查和准确滴定感染性病毒数量登革热病毒抗体检测登革热病毒抗体检测操作步骤l加10 L 全血/血清/血浆于环形孔l2 滴Buffer于方形孔l15 min读结果结果分析结果分析初次感染：IgM和质控区域出现粉红色条带再次感染：IgM，IgG和质控区域出现粉红色条带再次感染：IgG和质控区域出现粉红色条带阴性： 仅质控区域出现粉红色条带无效： 质控区域没有出现粉红色条带病例六病例六2讨论讨论入院后进行检查（含感染性疾病筛查），确诊为“带状疱疹”，同时也发现HIV-1抗体（ELISA）呈阳性，并经市疾控中心进行Western blot检测

3、证实为HIV-1感染。后追问病史，患者否认冶游史，但在2013年底发现丈夫为同性恋，并与之离异。经检测，患者目前CD4+ T淋巴细胞数目为214个/l，HIV-1病毒载量为5228拷贝/ml。 病例六病例六2讨论讨论讨论患者的治疗策略。 扩展讨论：HIV感染的途径有哪些？HIV感染的疾病分期有哪些？HIV感染发展到艾滋病期可能出现的症状有哪些？ 扩展讨论：试述HIV感染的治疗原则。 病例六病例六2分析分析抗病毒治疗、HAART治疗 可能症状：原因不明的持续不规则发热、慢性腹泻、体重减轻、机会性感染、机会性肿瘤、中枢神经系统病变、痴呆等HAART治疗HIV初筛初筛检测Ab方法： ELISA：双抗

4、原夹心法 明胶颗粒凝集法 快速检测方法：胶体硒法、胶体金法胶体硒法（免疫层析法）胶体硒法（免疫层析法）血清/血浆样品： 加50ul样品于反应堑中 1560min读取结果全血样品： 加50ul样品于反应堑中 样品吸收后加入一滴Chase缓冲液 1560min读取结果结果判断结果判断1.1.阳性阳性: : 病人条带病人条带 质控线质控线2.2.阴性阴性: : 一条红线一条红线( (质控线质控线) )3.3.无效无效: : 没有红线没有红线 或或 一条红线一条红线( (病人条带病人条带) )二条红线二条红线阴性阴性阳性阳性HIV确证试验确证试验（ WB法）法）1.1.电泳：电泳：HIV-蛋白成分分开

5、蛋白成分分开2.2.蛋白印迹在硝酸纤维膜蛋白印迹在硝酸纤维膜3.3.血清滴到硝酸纤维膜进行孵育，漂洗血清滴到硝酸纤维膜进行孵育，漂洗4.4.滴加酶标记的羊抗人滴加酶标记的羊抗人IgG进行孵育，漂洗进行孵育，漂洗5.5.加底物显色加底物显色6.6.观察结果：观察结果： 有抗体结合处出现紫蓝色条带有抗体结合处出现紫蓝色条带病毒学诊断病毒学诊断血清学试血清学试 验验检测病毒及检测病毒及 组分组分检测抗原检测抗原 检测核酸检测核酸 分离培养分离培养与鉴定与鉴定电镜检查电镜检查 病毒血凝试验病毒血凝试验病毒表面病毒表面的糖蛋白的糖蛋白 HAHARBCRBC表面的表面的糖蛋白受体糖蛋白受体凝集凝集原理：原

6、理：操操 作作19孔加生理盐水孔加生理盐水200l18孔倍比稀释流感病毒尿囊液孔倍比稀释流感病毒尿囊液200l91孔加入鸡红细胞孔加入鸡红细胞200l摇匀室温静置摇匀室温静置45min，观察结果，观察结果注意事项注意事项吹吸过程避免产生气泡；红细胞从最后加起；光滑台面上慢慢划圈摇匀，防止溅出；观察时减少移动；时间延长凝集的红细胞可能再解离。 结果分析结果分析l +l呈呈+凝集的最高病毒稀释度为病毒的红细凝集的最高病毒稀释度为病毒的红细胞凝集滴度（即胞凝集滴度（即一个血凝单位一个血凝单位）l粗略估计病毒颗粒的数量粗略估计病毒颗粒的数量（一个血凝单位（一个血凝单位106病毒颗粒病毒颗粒/ml）用途

7、和意义用途和意义检测某些病毒的存在滴定病毒血凝效价，粗略估计病毒颗粒的数量血凝抑制试验血凝抑制试验血凝抑制抗体血凝抑制抗体病毒的血凝素病毒的血凝素RBC中和中和不凝不凝集集某些病毒感染的辅助诊断某些病毒感染的辅助诊断原理：原理：生理盐水 加入量 稀释度方方 法法1 2 3 4 5 6 7 8 9 101:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.1病 人 血 清4U流感病毒液1%鸡红细胞 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.0

8、5 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05摇匀，置室温45min 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 弃去加液方向加液方向病毒对照RBC对照29孔加生理盐水孔加生理盐水50 l ，10孔加孔加100 l1孔加病人血清孔加病人血清50 l2孔加病人血清孔加病人血清50 l，28孔倍比稀释孔倍比稀释91孔加孔加4U病毒液病毒液50 l静置静置10min101孔加鸡红细胞孔加鸡红细胞静止静止45min，观察结果，观察结果操操 作作红细胞凝集抑制效价红细胞凝集抑制效价完全抑制红细胞凝集的最高血清稀释度用用 途途检测抗体的存在，滴定抗体效价， 用于某些病毒感染的辅助诊断。已知已知待测待测外毒素外毒素-抗毒素抗毒素破伤风毒素破伤风毒素破伤风毒素抗体破伤风毒素抗体小鼠小鼠抗抗o试验试验溶血素溶血素O-胶乳胶乳颗粒颗粒抗体抗体200IU，白色，白色凝集凝集RPR试验试验类脂质抗原类脂质抗原-炭炭粒粒梅毒螺旋体反应梅毒螺旋体反应素素黑色凝集黑色凝集可能感染可能感染肥达试验肥达试验伤寒副伤寒沙伤寒副伤寒沙门菌门菌O/H抗原抗原抗体抗体凝集凝集+效价，双份血清效价，双份血清粪标本玻片凝集粪标本玻片凝集多价血清抗体多价血清抗体致病菌菌