NS398对肝细胞癌VEGF、MMP9表达的调节(一)

1、NS?398对肝细胞癌VEGFMMP?荣达的调节（1）【摘要】目的探讨NS?398对肝细胞癌血管生成和侵袭的调节作用。方法NS?39眄0、25、50、75、100mol/L5个浓度组，每个浓度组选取24h、48h、72h三个作用时间点进行检测。采用RT?PCR口流式细胞技术，观察NS?398对人肝癌SMMC?77和胞株VEGFMMP?9t达的影响。结果NS?398对SMMC?7721胞有明显的生长抑制作用。与对照组相比，NS?398能显著抑制SMMC?77冽胞COX?2VEGFMMP?9fi因和蛋白表达，并呈显著的剂量和时间依赖性关系（PV0.001）。结论NS?398能显著抑制SMMC?77

2、洲细胞癌中VEGFMMP?9mRNAS白的表达。【关键词】肝细胞癌NS?398血管内皮生长因子MMP?90引言环氧合酶?2（Cyclooxygenase?2,COX?2不但与月中瘤血管生成有关1,还可通过改变肿瘤细胞的侵袭性和粘附性来抑制肿瘤生长2。我们以前实验表明肝细胞癌组织中COX?2fVEGFMMP?9t白表达和月中瘤微血管密度（Microvesseldensity,MVD之间呈正相关3,本实验研究COX?2t异性抑制剂JNS?398X寸肝癌SMMC?77冽胞株VEGFMMP?褰达的影响，初步探讨NS?398对肝细胞癌血管生成和侵袭的作用。1 材料与方法1.1 细胞培养和药物干预方案SM

3、MC?7721胞分别用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在含5%CO237培养箱中培养。培养液中分别含有青霉素、链霉素100U/ml。将对数生长期的细胞接种于96孔培养板，待细胞贴壁后加入NS?398NS?398a0、25、50、75、100mol/L5个浓度组，每个浓度组选取24h、48h、72h三个时间点。每个实验组重复6孔。1.2 主要试剂NS?398!勾自sigma公司。一抗山羊抗人COX?密克隆抗体，鼠抗人VEGF单克隆抗体，兔抗人MMP?卵克隆抗体均为SantaCruz产品，Trizol试剂（美国GibcoBRL公司）。PCRZ（美国PE公司PE?960Cffi）,流式细胞仪

4、（美国B?C公司Epics?XLII型）1.3 RT?PCR检测COX?2VEGFMMP?9mRNA表达按照Trizol试剂说明书逐步提取细胞总mRNACOX?我应条件为：94C变性30s；63c复性30s；72c延伸30s。VEGFE应条件为：94C变性30s；63c复性30s；72c延伸30soMMP?蚊应条件为：94c变性30s；63c复性30s；72c延伸30so进行35个循环后进一步延伸72c5min。COX?见物序歹U:上游为5'?AATGAGTACCGAAAATTC?3下游为5'?CATCTAGTCCGGAGCGGGAAG23扩增片段大小为420bp。VEG对物序

5、歹h上游为5'?TTGCCTTGCTGCTCTACCTC?，下游为35?AAATGCTTTCTCCGCTCTGA?3',扩增片段大小为418bp。MMP?9n物序列：上游：5'?TTGCCTTGCTGCTCTACCTC?3,下游：5'?AAATGCTTTCTCCGCTCTGA?3，扩增片段大小为120bpo所有引物均由上海生工公司合成，选取B?actin为内参照，取10仙lPCR产物用1.2%的普通琼脂糖凝胶电泳后，凝胶电泳成像系统观测成像情况。1.4 流式细胞仪定量检测COX?2VEGFMMP?9勺表达采用间接免疫荧光标记方法。每份样品加入第一和第二抗体工作液

6、各100屋。设有PBS代替一抗和二抗的阴性对照，只加一抗和二抗的阳性对照。以荧光指数（FI）表示相对含量，FI=（样品蛋白表达荧光强度?正常样品的荧光强度）/正常样品的荧光强度。1.5 MTT法检测细胞增殖抑制情况在96孔培养板中分别加入25、50、75、100仙mol/LNS?398,继续孵育24、48、72h后每孔加入MTT容液（5mg/ml）20仙l,37c继续孵育45h,吸弃孔内培养上清液。每孔加入150屋DMSQ振荡10min。用酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度（A）。每组取3次实验平均值，计算细胞抑瘤率：抑瘤率=（对照组A实当组A）/（又1照组A空白组A）X100%1.6 统计

7、学检验应用SPSS10.0统计软件进行统计学分析，组间显著性检验采用析因设计方差分析，P<0.05为差异有显著性。2 结果2.1 NS?398对SMMC?7721胞生长的影响MTTt测定结果显示，NS?398对SMMC?7721胞有明显的抑制生长作用,并呈剂量依赖性和时间依赖性（P<0.001）,见图1。2.2 NS?398对SMMC?7721胞COX?2fe达的影响RT?PCR口FCM吉果表明，NS?398能显著抑制SMMC?7721胞COX?2s因和蛋白表达，并呈显著的剂量和时间依赖性关系（P<0.001）。图1NS?398对SMMC?7721胞生长的抑制作用（略）2.3

8、 NS?398对SMMC?7721胞VEGFMMP?褰达的影响NS?398tg显著抑制SMMC?7721胞VEGFMMP?96I3和蛋白表达，并呈显著的剂量和时间依赖性关系（P<0.001）,见表1、2。表1NS?398对SMMC?7721胞COX?2VEGFMMP?9t白表达的影响（略）表2NS?398对SMMC?7721胞COX?2VEGFMMP?9mRNA达的影响（略）3 讨论COX?渐近被证实具有促进月中瘤生长作用，可影响月中瘤细胞增殖、分化和凋亡，最近还发现COX?M通过刺激月中瘤血管生成、促进细胞侵袭和转移能力来促进肿瘤发生和发展。血管生成是肿瘤发生、发展过程中的重要步骤，与

9、肿瘤的生物学行为及预后有关。VEGF®月中瘤血管生成和侵袭转移过程中的关键因素，其通过特异性受体Flk?1、Flt?1和Flt?4选择性作用于内皮细胞发挥作用。MMP?91基质金属蛋白酶家族中的重要成员，其过度表达与肝细胞癌血管生成和侵袭转移密切相关。已有研究表明COX?2ft肝细胞癌中高表达，但对COX?2to中瘤血管生成的研究较少。Tsujii等1研究发现，转染COX?28因可以使培养的结肠癌细胞株在过度表达COX?2勺同时，促使VEGFTGF?3和bFGF等月中瘤血管生成因子的分泌，并促进联合培养的人脐静脉内皮细胞株在I型胶原凝胶中增殖、变形、向肿瘤细胞迁移和形成网状的内皮细胞索。Liu等4进一步进行体内研究,结果显示选择性COX?2卬制剂能显著抑制前列腺癌血管生成。Tsujii等5将COX?2s因转染入人结肠癌细胞株，发现该转染细胞具有更强的侵袭能力，同时可以被COX?24择性抑制剂阻断。进一步研究发现，这种侵袭能力的增强与MMP?2勺活化及MMP?的表达增加有