创新课题实践报告汇总

1、精选优质文档-倾情为你奉上课外科研创新实践总结1 对科研课题的认识微生物发酵法生产L-鸟氨酸，实际上就是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，选育出营养缺陷型并带有某些结构类似物抗性标记的突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏作用，从而达到过量积累L-鸟氨酸的目的。再通过优化发酵工艺，使L-鸟氨酸产量达到最大值。1.1对鸟氨酸的理化性质及生物功能的认识L-鸟氨酸难以结晶，通常是浆状物。易溶于水、乙醇，微溶于乙醚。能够电离成为两性兼性离子，能够和酸和碱发生特性反应，能和甲醛、茚三酮等发生反应。通常作为试剂使用的是其单盐酸盐，L-鸟氨酸单盐酸盐易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、乙醚 。L- 鸟氨

2、酸存在于生物体多种组织和细胞中，具有生物活性，在生物体代谢中起到重要作用。鸟氨酸在医学和食品工业中起到重要的作用。是尿素生成的中间产物，精氨酸、瓜氨酸等多种氨基酸代谢的前提物质，主要参与产尿素的鸟氨酸循环中，对体内集聚的氨具有解毒作用，因而鸟氨酸对人体肝脏细胞具有重大意义。在近代医药行业，L- 鸟氨酸除用于制备保肝、护肝、治疗肝病、 抗疲劳、抗虚弱等各种复方氨基酸输液外，还常和精氨酸一起用于配制恢复疲劳的发泡饮料。L-鸟氨酸因其多功能的保健作用而引起世人的特别关注。1.2对鸟氨酸生产的认识生产鸟氨酸的方法有提取法，化学法，微生物法和酶法4种方法。其中提取法制备成本高，提取工艺繁琐；化学法中合成

3、收率低，有机物合成过程中会产生致癌物，还会合成手性分子，拆分工艺难度大；酶法是精氨酸在精氨酸酶的作用下，生成L-鸟氨酸，此法产品纯度高，但价格昂贵，精氨酸及精氨酸酶均不易获得，限于实验室制备。发酵法生产的鸟氨酸，全是L型，产品以鸟氨酸的盐酸盐形式存在。此法简便易行，只要选择合适的菌种，可以达到较高的产量，适用于工业化规模生产。1.3对L-鸟氨酸的生产菌株的认识目前，利用发酵法生产L-鸟氨酸的出发菌株主要有谷氨酸棒杆菌的精氨酸缺陷型突变株；乳酸发酵短杆菌、川崎短杆菌、柠檬酸节杆菌等的精氨酸缺陷型突变株；枯草杆菌、大肠杆菌、帕特介里编型杆菌的瓜氨酸缺陷性突变株；解烃棒杆菌和一种石蜡节杆菌的精氨酸缺

4、陷性突变株；洁白链霉菌的瓜氨酸和硫胺素双重缺陷型突变株。但是，用的最多的还是谷氨酸棒杆菌营养缺陷型菌株。L- 鸟氨酸的生产菌种多是通过菌种选育得到，选择合适的出发菌株，利用紫外线和亚硝基胍等诱变方法，筛选出L-鸟氨酸的高产菌种。生产菌大都是精氨酸或瓜氨酸的营养缺陷型的棒杆菌及短杆菌（因为鸟氨酸属于胞内氨基酸，菌体内鸟氨酸进一步合成精氨酸，要使其积累鸟氨酸，可以阻止鸟氨酸的下行合成途径，只要通过筛选瓜氨酸和精氨酸缺陷型菌株就能实现）。1.4关于L-鸟氨酸生产的研究1957年, Udaka利用谷氨酸棒杆菌的瓜氨酸缺陷型突变株来生产鸟氨酸, 在含限量要求物质精氨酸的培养基中培养, 成功地蓄积了大量的

5、鸟氨酸, 开创了应用营养突变株发酵生产氨基酸的方法。此后, Okumura和Shibuya等人在这方面也做了大量的工作, 总结出了具有精氨酸缺陷型及精氨酸氧肟酸盐抗性的谷氨酸棒杆菌以及具有精氨酸缺陷、 瓜氨酸缺陷和霉酚酸抗性等标记的柠檬酸节杆菌突变株在发酵法生产鸟氨酸工业上的应用。他们的研究成果几乎都以专利文献的形式发表，而在国内尚未有人做过这方面的研究。鸟氨酸的生产也以日本为主，生产厂家主要有味之素、田道制药和协和发酵等3家。目前，鸟氨酸仅在日本的市场规模就达15亿日元，且其需求量正在不断上升。但鸟氨酸的生产却极为不易，日本在80年代末也还在采用以精氨酸为原料，经碱法水解或利用精氨酸酶水解得

6、到鸟氨酸。1988年, Katsumata Ryoichi, Yokoi Haruhiko 等将编码N-乙酰谷氨酸激酶、N-乙酰谷氨酸- -半醛脱氢酶等酶基因片段从质粒 PE Arg 1 中切割下来, 再将其连接到 PE Arg 2 质粒中，导入这种重组质粒的谷氨酸棒杆菌产鸟氨酸可以达到21 g/ dL。2课题研究目的与意义2.1目的鸟氨酸生产菌株对L-鸟氨酸产量的大量积累主要包括以下两个方面：一方面，从微生物代谢机理角度考虑，解除代谢机制中的反馈抑制与反馈阻遏，可使制备过程向着鸟氨酸高产的方向进行；另一方面，从鸟氨酸积累的发酵环境考虑，优化突变菌株发酵时的培养条件，如培养基组分及浓度，碳氮源

7、，无机盐及生长因子等；发酵条件如温度、pH和溶氧水平及摇床发酵优化，可提高L-鸟氨酸产量。所以从这两方面出发，寻找最适合的发酵生产菌株及优化发酵工艺就是这次科研的目的。2.2意义近年来，由于氨基酸在医药、保健品、日用化工等方面有极其广泛的用途，尤其随着抗癌药物制剂、氨基酸营养制剂的飞速发展，对原料氨基酸的需求量日益增长，市场需求量不断增加。鉴于L-鸟氨酸的国内外市场的供需状况以及发展民族氨基酸产业的需求，微生物发酵法生产鸟氨酸的研究，具有重大的经济意义和理论意义。 3本课题研究情况3.1生产菌株的选育采用物理和化学因素诱发突变，这是提高菌种产量和性能的主要手段。选取合适的诱变条件，对菌液进行诱

8、变并吸取0.1 mL 的菌液涂布到抗性筛选培养基中。32下培养数天后将平板上的单菌落转入抗性筛选斜面培养基中继续培养，然后再分别摇瓶培养，测定鸟氨酸产量，选取鸟氨酸产量较高的突变株。3.2摇瓶发酵工艺的优化发酵条件包括发酵培养基的优化、培养温度、pH、通风量等。这些因素对微生物的生理及形态也有较大的影响，也直接影响发酵产物的生成。 3.2.1发酵培养基主要组成成分单因素实验选择不同碳源和氮源，选出最佳碳源和最佳氮源后进行正交优化实验，确定最优组合。3.2.2发酵培养基pH的选择通过设定不同的发酵初始pH梯度和CaCO3浓度梯度，对发酵液中谷氨酸棒杆菌含量的影响，从而探讨对L-鸟氨酸含量提高的影

9、响，得出最佳CaCO3浓度和pH值的最佳组合。3.2.3发酵培养温度的选择温度对发酵产酸的影响是多方面的，从酶反应动力学考虑，温度越高，反应速度越快，生长速度快，产物生成提前，但是，酶受热容易失活，温度越高，失活越快，菌体也越容易衰老。3.2.4发酵通风量的选择 鸟氨酸发酵属于好气性发酵，溶解氧对菌体生长和发酵产酸都有密切关系，所以发酵过程应保证通风，以满足菌体生长和产酸的需要。一定温度下溶氧是装液量和摇瓶转速的函数，若摇瓶转速固定，则装液量会直接影响培养液的情况；同样，如果装液量固定，则摇瓶转速就会成为影响培养液情况的主要因素。3.2.5发酵培养基中生物素的影响生物素生长因子的一种，在微生物

10、发酵过程中，生物素的含量对发酵产物的产量有很大影响。建立菌液中生物素含量的检测方法，进行生物素添加实验，考察生物素对鸟氨酸分泌的影响。4我的任务参与菌株的筛选纯化，对菌株进行活化检测活化培养基、种子培养基、发酵培养基的配制生物素含量的测定生物素鉴定培养基的配制：生物素鉴定用培养基：葡萄糖145g/L，硫酸镁0.65g/L，磷酸氢二钾1.6g/L，氯化钾0.3g/L，硫酸亚铁、硫酸锰各0.002g/L，pH7.0，121灭菌15min。生物素标准液的配制：精确称取一定量的标准生物素样品，加少量乙醇于50下溶解，加水稀释、定容，得到0.04µg/mL的生物素标准溶液，在121灭菌15mi

11、n，4保藏，备用。生物素标准曲线的绘制：取500mL无菌三角瓶，分装18mL鉴定用培养基、不同量的生物素标准溶液及0.4mL菌液。32、200r/min摇床培养12h，下摇床后摇匀，用可见分光光度计650nm处测定吸光率（A）。以生物素含量为横坐标，样品吸光率与空白吸光率之差为纵坐标，绘制生物素标准曲线。将样品吸光率减去空白的吸光率，即得实测的吸光率，根据回归函数计算X值。X×20×稀释倍数=生物素含量(µg/L)。L-鸟氨酸标准曲线的绘制：配制6MH3PO4；冰乙酸与6MH3PO4以1:3混匀；25mg/L的茚三酮溶液的配制：1.25g茚三酮加50ml混酸，在7

12、0溶解后转棕色瓶保存；L-鸟氨酸单盐标准溶液的配制（2µmol/L)；1ml L-鸟氨酸标准液与1ml茚三酮在100保温一个小时，取出立即降温后加入3ml冰乙酸，在512nm处测吸光值，配制不同浓度梯度的L-鸟氨酸单盐标准溶液。以不同浓度L-鸟氨酸单盐标准溶液为横坐标，一吸光值为纵坐标，绘制L-鸟氨酸标准曲线。样品中鸟氨酸的测定将发酵后离心得到的菌液测OD512。发酵液中生物素含量的测定将配置好的发酵液经离心后测OD650。生物素对鸟氨酸发酵的影响取250ml无菌三角瓶15个，以发酵液总体积为28ml，按种子液为2ml，生物素（0.32µg/ml)加入量分别为0、0.1、0

13、.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5，无菌水与生物素总体积为2ml，按总体积为28ml添加发酵液的量。发酵前期32、200r/min；发酵中期为 34、220r/min；发酵后期 34、250r/min。每4h取一次样，离心后去上清液测OD512值。5任务完成情况以完成菌株的筛选纯化、活化鉴定；鸟氨酸标准曲线的制备；实验大体完成了整个流程，但数据还不理想，还需要继续重复和改进。6收获与感悟增强自己查找资料、方案的能力；拓宽视野，了解到一些学科以外的知识。增强实际实验操作能力，虽然实验过程中有些是课堂实验课有操作过，但一般会有老师来指导，这次科研实验培养了自己独立操作能力、观察能力，对仪器和药品的使用上更加规范、安全性。提高对实验现象记录、整理的能力。平时课堂实验时也会有相关的实验记录