免疫酶组织化学技术

1、第三章第三章 免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 酶酶-辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶 酶标记已知酶标记已知Ab(Ab(或或Ag) + Ag) + 组织细胞内相应的组织细胞内相应的Ag(Ag(或或Ab)Ab) 抗原抗体复合物抗原抗体复合物( (酶标酶标) ) 底物底物 有色沉淀有色沉淀 定位；定位； 图像分析仪半定量图像分析仪半定量免疫组化方法免疫组化方法v酶标抗体免疫组织化学酶标抗体免疫组织化学 直接法直接法 间接法间接法v非酶标抗体免疫组织化学非酶标抗体免疫组织化学 酶桥法酶桥法 PAPPAP法、法、APAAPAPAAP法法 一

2、、酶标抗体免疫组织化学染色法一、酶标抗体免疫组织化学染色法（一）原理（一）原理 直接法和间接法。直接法和间接法。 直接法直接法- 是将酶标记在第一抗体上是将酶标记在第一抗体上, ,直接检测细胞内特异性抗原。直接检测细胞内特异性抗原。 间接法间接法-两步法两步法 一抗：是细胞组织内抗原的特异性抗体；一抗：是细胞组织内抗原的特异性抗体； 二抗：是抗一抗的抗体二抗：是抗一抗的抗体, ,并且已用酶标记。并且已用酶标记。 ( (注意注意: :第二抗体与第一抗体须是不同种属动物制备的第二抗体与第一抗体须是不同种属动物制备的, ,因因为第二抗体往往是用第一种动物的为第二抗体往往是用第一种动物的IgGIgG所

3、制备。所制备。) )原理：原理：将酶直接标记在一抗上，将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。然后直接与相应抗原特异地结合。形成形成复合物，最后复合物，最后用底物显色剂显色。用底物显色剂显色。 优点：优点：简便、快速、特异性强，简便、快速、特异性强，非特异性背景反应低。非特异性背景反应低。 缺点：缺点：浪费抗体、敏感性极低。浪费抗体、敏感性极低。依靠化学连接（共价键）对酶及依靠化学连接（共价键）对酶及抗体活性有影响。抗体活性有影响。每种抗原必须分别用其抗体的酶每种抗原必须分别用其抗体的酶标记物。标记物。酶标抗体法酶标抗体法- -直接法直接法酶标抗体法酶标抗体法- -间接法间接法原理

4、：原理：将酶标记在二抗上，先将将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合，形成抗一抗与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗原抗体复合物，再用二抗( (酶标抗酶标抗体体) )与复合物中的特异抗体结合，与复合物中的特异抗体结合，形成形成复合物，复合物，最后用底物显色剂显色。最后用底物显色剂显色。 优点：优点：只需一种酶标抗体即可只需一种酶标抗体即可 。 缺点：缺点：敏感性低，但优于直接法。敏感性低，但优于直接法。依靠化学连接对酶及抗体活性有依靠化学连接对酶及抗体活性有影响。影响。v 免疫酶组织化学方法最终的生成物是带有酶标记免疫酶组织化学方法最终的生成物是带有酶标记的抗原抗体复合物，再依据

5、酶与底物作用生成不溶的抗原抗体复合物，再依据酶与底物作用生成不溶性的有色产物沉积在抗原抗体反应原位，并借此确性的有色产物沉积在抗原抗体反应原位，并借此确定该抗原的性质、存在的部位和含量。定该抗原的性质、存在的部位和含量。v 酶酶 + + 底物底物=不溶性的色素不溶性的色素标记酶标记酶: : 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 (HRP)(HRP) 碱性磷酸酶碱性磷酸酶(ALP)(ALP) 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶(GOD)(GOD) -D- -D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶v 显色反应显色反应 : 1 1 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 HRPHRP：显色：显色：产物棕褐色产物棕褐色 HRPHRP与与底物过

6、氧化氢和底物过氧化氢和DABDAB作用产物棕褐色，有嗜锇性。作用产物棕褐色，有嗜锇性。DABDAB性质：性质： 电子供体，较敏感，室温时较稳定，显色后切片可长期电子供体，较敏感，室温时较稳定，显色后切片可长期保存。可致癌，可将保存。可致癌，可将DABDAB制成制成1010倍浓度储存液，分装后倍浓度储存液，分装后-20-20贮存。贮存。注意事项：注意事项：孵育时间和配置方式易产生背景着色孵育时间和配置方式易产生背景着色浓缩的浓缩的DABDAB按照说明书；注意校正蒸馏水的按照说明书；注意校正蒸馏水的PHPH值；值；粉剂粉剂DAB-DAB-溶解时滤去不溶性颗粒；溶解时滤去不溶性颗粒；现用现配现用现配

7、-保存时可产生氧化物沉积在切片上，形成斑点。保存时可产生氧化物沉积在切片上，形成斑点。 临用前加临用前加H H2 2O O2 21 1 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 HRPHRP：v2 2 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 ALPALP：v显色：产物蓝色或红色。显色：产物蓝色或红色。v以磷酸萘酚以磷酸萘酚AS-MXAS-MX为底物，被为底物，被ALPALP水解后生成萘酚水解后生成萘酚AS-MXAS-MX，再与孵育液内的坚牢蓝，再与孵育液内的坚牢蓝B B盐或坚牢红盐或坚牢红TRTR盐等盐等偶联生成不溶性染料偶联生成不溶性染料( (坚牢蓝或坚牢红坚牢蓝或坚牢红) )而成。而成。v优点：细胞和组织内的内源性碱性

8、磷酸酶很容易被优点：细胞和组织内的内源性碱性磷酸酶很容易被抑制和破坏，而不会产生内源性酶显色，从而提高抑制和破坏，而不会产生内源性酶显色，从而提高特异性。特异性。v缺点：显色弥散，不如过氧化物酶系统的清晰和明缺点：显色弥散，不如过氧化物酶系统的清晰和明确。确。v2 2 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 ALPALP：v显色：产物蓝色或红色。显色：产物蓝色或红色。v以磷酸萘酚以磷酸萘酚AS-MXAS-MX为底物，被为底物，被ALPALP水解后生成萘酚水解后生成萘酚AS-MXAS-MX，再与孵育液内的坚牢蓝，再与孵育液内的坚牢蓝B B盐或坚牢红盐或坚牢红TRTR盐等盐等偶联生成不溶性染料偶联生成不溶性染料(

9、(坚牢蓝或坚牢红坚牢蓝或坚牢红) )而成。而成。v优点：细胞和组织内的内源性碱性磷酸酶很容易被优点：细胞和组织内的内源性碱性磷酸酶很容易被抑制和破坏，而不会产生内源性酶显色，从而提高抑制和破坏，而不会产生内源性酶显色，从而提高特异性。特异性。v缺点：显色弥散，不如过氧化物酶系统的清晰和明缺点：显色弥散，不如过氧化物酶系统的清晰和明确。确。3 GOD(3 GOD(葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶) )： 以以-D-D-葡萄糖底物葡萄糖底物，被，被GODGOD氧化生成的氧化生成的H H2 2O O2 2，又作为，又作为HRPHRP的催化底物，最后仍可用的催化底物，最后仍可用DABDAB显色。显色。 适用于

10、两种酶的放大技术：适用于两种酶的放大技术： 即用即用GODGOD和和HRPHRP分别标记第二和第三抗体分别标记第二和第三抗体( (如第一抗体是如第一抗体是小鼠小鼠mAbmAb，第二抗体为，第二抗体为GODGOD标记的兔抗小鼠标记的兔抗小鼠IgGIgG，第三抗，第三抗体为体为HRPHRP标记的羊抗兔标记的羊抗兔IgG)IgG)，孵育液即含有葡萄糖，又，孵育液即含有葡萄糖，又含有含有DABDAB，此法可提高免疫染色的敏感性和特异性。，此法可提高免疫染色的敏感性和特异性。呈色反应注意要点：呈色反应注意要点： 底物浓度：底物浓度： 应够高，保证最大反应速度应够高，保证最大反应速度; ; pH pH值：

11、值： 满足酶活性的最适满足酶活性的最适pHpH，常由缓冲液提供，常由缓冲液提供; ; 温度：温度： 室温即室温即18-2218-22，或，或3737； 时间时间： 显色反应时间应在镜下观察来控制，显色反应时间应在镜下观察来控制， 以特异性显色清晰而背景又无非特异性着色时即可以特异性显色清晰而背景又无非特异性着色时即可终止反应。终止反应。（二）染色程序（二）染色程序1 1 直接法（冰冻切片）直接法（冰冻切片）1 1）新鲜组织切片）新鲜组织切片, ,冷丙酮固定冷丙酮固定10min,10min,干燥后干燥后, ,入入PBSPBS。2 2）0.3H H2 2O O2 2 - -甲醇液处理甲醇液处理30

12、30, ,封闭内源性过氧化物酶封闭内源性过氧化物酶; ;3 3）0.0l molmolLPBSLPBS洗洗3 3次。次。4) 54) 5-10-10正常羊血清室温处理正常羊血清室温处理30min30min。5) 1:50-1:100 HRP-5) 1:50-1:100 HRP-标记抗体标记抗体, 37, 37孵育孵育6060或或44过夜。过夜。6) 6) 0.0l molmolL PBSL PBS洗洗3 3次。次。7) DAB7) DABH H2 2O O2 2显色显色( (新鲜配制新鲜配制) )。8) 8) 0.01molmolLPBSLPBS洗洗3 3次。次。9) 9) 梯度乙醇脱水，二甲

13、苯透明，封片。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。2 2 间接法间接法1) 1) 石蜡切片脱蜡至水；石蜡切片脱蜡至水； 冰冻切片冰冻切片 室温干燥室温干燥-丙酮固定丙酮固定-缓冲液漂洗溶去缓冲液漂洗溶去OCTOCT包埋剂包埋剂2) 2) 甲醇双氧水室温处理切片甲醇双氧水室温处理切片151530min,30min,封闭内源性过氧化物酶活性。封闭内源性过氧化物酶活性。3) PBS3) PBS漂洗漂洗4) 4) 0.11 1牛血清白蛋白牛血清白蛋白(BSA),(BSA),湿盒内室温孵育湿盒内室温孵育15152525, ,然后吸去孵育然后吸去孵育液液, ,不冲洗不冲洗. . 5% 5%1010正常兔血清正

14、常兔血清( (或山羊血清或山羊血清),),湿盒内室温孵育湿盒内室温孵育15152020然后吸去。然后吸去。5)5)滴加滴加PBSPBS适当稀释的第一抗体适当稀释的第一抗体, ,湿盒内孵育湿盒内孵育, ,或或44过夜过夜, ,或室温或室温2 24h4h。6) PBS6) PBS充分冲洗充分冲洗7) 7) 滴加适当稀释的酶标第二抗体滴加适当稀释的酶标第二抗体, ,湿盒孵育湿盒孵育45456060( (室温或室温或37)37)。8) PBS8) PBS漂洗漂洗(3(3次次, ,每次每次2-52-5) )。9)9)显色：显色： HRPHRP标记抗体（标记抗体（0.01- -0.1% H% H2 2O

15、O2 2 + + 0.01- -0.5DABDAB液）液） ALPALP标记抗体标记抗体（2mg2mg磷酸萘酚磷酸萘酚AS-MX+AS-MX+0.2mlml二甲基甲酰胺，用前加坚牢红二甲基甲酰胺，用前加坚牢红TRTR盐盐) )。 切片入此液切片入此液, ,室温室温10101515。 GODGOD标记抗体标记抗体（-D-D-葡萄糖葡萄糖67mg + 67mg + 硝基蓝四唑硝基蓝四唑6.7mg+6.7mg+吩嗪甲硫酸酯吩嗪甲硫酸酯0.107mgmg， 3737孵育孵育1h1h。10) 10) 流水中终止呈色反应；流水中终止呈色反应；11) 11) 复染细胞核（甲绿、苏木精）；复染细胞核（甲绿、苏

16、木精）；10s10s12) DAB12) DAB显色标本显色标本-树胶封固。树胶封固。 其它其它-水溶性介质水溶性介质( (如甘油明胶如甘油明胶) )封固。封固。13) 13) 镜检结果：按上法镜检结果：按上法HRPHRP阳性者呈棕色，阳性者呈棕色，ALPALP法阳性者呈红法阳性者呈红 色，色，GODGOD法阳性者呈蓝色。法阳性者呈蓝色。 二、非酶标抗体免疫组织化学染色法二、非酶标抗体免疫组织化学染色法 酶桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法酶桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法 PAPPAP( (一一) ) 酶桥法酶桥法1 1 原理：三种抗体原理：三种抗体一抗一抗二抗二抗-桥抗体桥抗体三抗三抗-抗酶抗酶

17、(HRP)(HRP)抗体抗体, , 酶酶(HRP)(HRP)与抗酶抗体结合与抗酶抗体结合, ,经底物的显色反应将抗原显示出来。经底物的显色反应将抗原显示出来。优点：优点：任何抗体均未被酶标记任何抗体均未被酶标记, ,酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合, , 避免因避免因共价结合对抗体和酶活性的影响共价结合对抗体和酶活性的影响, ,敏感性高敏感性高, , 可节约一抗。可节约一抗。需要同一种属动物制备一抗和抗酶抗体。需要同一种属动物制备一抗和抗酶抗体。非标记抗体酶法非标记抗体酶法 酶桥法酶桥法原理：原理：首先用酶免疫动物，制备首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗

18、酶抗体；效价高、特异性强的抗酶抗体；以二抗作桥，将抗酶抗体联结在以二抗作桥，将抗酶抗体联结在一抗上；一抗上； 再将酶结合在抗酶抗体再将酶结合在抗酶抗体上，形成上，形成复合物，最后用底物显色剂显色。复合物，最后用底物显色剂显色。 优点：优点：任何抗体均未被酶标记。任何抗体均未被酶标记。酶是通过免疫学原理与酶抗体结酶是通过免疫学原理与酶抗体结合的。避免了共价连接对抗体和合的。避免了共价连接对抗体和酶活性的损害，提高了方法的敏酶活性的损害，提高了方法的敏感性，而且节省一抗的用量。感性，而且节省一抗的用量。缺点：缺点：敏感性低，抗酶抗体不易敏感性低，抗酶抗体不易纯化。纯化。2 2 酶桥法染色程序酶桥法

19、染色程序同上述酶标抗体法。同上述酶标抗体法。 滴加滴加第一抗体第一抗体, ,于湿盒内于湿盒内44孵育孵育161624h24h。 PBSPBS洗洗2 2次，每次次，每次5 5( (可振摇可振摇) )。 加加第二抗体第二抗体( (桥抗体桥抗体),),湿盒内室温孵育湿盒内室温孵育30306060。 用用PBSPBS洗洗2 2次次, ,每次每次5 5。 加加抗酶抗酶(HRP)(HRP)抗体抗体, ,湿盒内室温孵育湿盒内室温孵育30306060。 用用PBSPBS洗洗2 2次次, ,每次每次5 5。 加加过氧化物酶过氧化物酶(HRP)(HRP)溶液溶液(70(70100g100gm1),m1),湿盒内室

20、温湿盒内室温 孵育孵育3030。 用用PBSPBS洗洗2 2次次, ,每次每次5 5。换。换TrisTris缓冲液洗缓冲液洗5 5。 显色反应及后处理同酶标记法。显色反应及后处理同酶标记法。 酶桥法的缺点：酶桥法的缺点： 抗酶抗体内存在低亲和力和高亲和力两类抗体；抗酶抗体内存在低亲和力和高亲和力两类抗体；低亲和力抗酶抗体低亲和力抗酶抗体-与酶结合力较弱，漂洗时易解离，与酶结合力较弱，漂洗时易解离，可使约可使约7070的酶丢失，因而降低了方法的敏感性；的酶丢失，因而降低了方法的敏感性；在抗酶抗体内，也含有在抗酶抗体内，也含有非特异性非特异性( (抗酶抗酶) )抗体抗体，因其抗，因其抗原性与抗酶抗

21、体相同，故也可与桥抗体结合，由于其未原性与抗酶抗体相同，故也可与桥抗体结合，由于其未与酶结合，也会影响细胞组织内抗原的显示。与酶结合，也会影响细胞组织内抗原的显示。( (二二) PAP) PAP法（过氧化物酶抗过氧化物酶法）法（过氧化物酶抗过氧化物酶法） PAPPAP复合物：复合物： 抗酶抗体抗酶抗体 + + 足量的酶足量的酶 = = 形成稳定的五角形复合物形成稳定的五角形复合物 ( (由三个过氧化物酶分子和二个抗酶抗体分子组成由三个过氧化物酶分子和二个抗酶抗体分子组成) ) 原理：三种抗体原理：三种抗体 PAPPAP复合物代替了酶桥法中的抗酶抗体。复合物代替了酶桥法中的抗酶抗体。 一抗一抗

22、二抗二抗-桥抗体桥抗体 PAPPAP复合物复合物 要求：要求： 抗酶抗体的动物种属应和制备第一抗体的动物相同。抗酶抗体的动物种属应和制备第一抗体的动物相同。 非标记抗体酶法非标记抗体酶法-PAP-PAP法法双双PAPPAP法法原理：原理：同酶桥法，只是把抗酶抗体同酶桥法，只是把抗酶抗体- -酶制成酶制成复合物（复合物（PAPPAP复合物），形成复合物），形成复合物。复合物。v优点：优点： PAPPAP复合物结构很稳定，冲洗时酶分子不会脱落，灵敏度高，比酶桥法复合物结构很稳定，冲洗时酶分子不会脱落，灵敏度高，比酶桥法高高2020倍；倍； PAPPAP是一种复合物，无游离免疫球蛋白存在，不易引起非特异性染色；是一种复合物，无游离免疫球蛋白存在，不易引起非特异性染色； 双双PAPPAP法：通过两次连接桥抗体和法：通过两次连接桥抗体和PAPPAP复合物，在抗原抗体复合物上结复合物，在抗原抗体复合物上结合了更多的酶分子，使敏感性大大增强，更适用于常规石蜡切片中微量和合了更多的酶分子，使敏感性大大增强，更适用于常规石蜡切片中微量和抗原性减弱的抗原检测。抗原性减弱的抗原检测。v缺点：缺点： PAPPAP复合物制备较复杂；复合物制备较复杂； 免疫染色步骤多、需时长；免疫染色步骤多、需时长； 由于由于PAPPAP复合物分子量较大，对