硫酸化黄芪多糖对IBD疫苗接种雏鸡免疫水平的影响.docx

1、硫酸化黄茂多糖对IBD疫苗接种雏鸡免疫水平的影响施志玉，黄小燕，李大鹏，孙瑾承，鞠演，胡元亮收稿日期：2008-09-12基金项目：国家自然科学基金项目（30571360）；南京农业大学SRT计划项目（0704A23）。作者简介：施志玉（1986-），女，在读本科生。通讯作者。（南京农业大学动物医学院，江苏南京210095）摘要：200R14H龄雏鸡随机均分为9组，6个试验组分别肌肉注射高、低剂鱼的3种硫酸化黄芷多慵（sAPS）即sAPS、sAPS和sAPS,2个多糖对照组注射高、低剂量的未修饰黄茂多糖（APS）,无佐剂对照组注射等最生理盐水，每天1次，连续3d,第4天用鸡传染性法氏囊病（IB

2、D）疫苗免疫，2周后二免。分别于首次免疫后第7,14,21,28天翼静脉采血，用琼脂扩散法测定血清抗体效价；于首次免疫后第14,21,28和35天心脏采血测定T淋巴细胞增殖。结果表明，3种修饰多糖均能显著提高血清抗体效价，促进T淋巴细胞增殖，作用强于未修饰多糖,且有一定的量效关系，低剂量的效果优于高剂量。综合评价以sAPSeo的效果最好，可以作为新型免疫佐剂的候选。关键词：硫酸化黄芷多糖；雏鸡；血清抗体效价；淋巴细胞埴殖中图分类号：S853.7文献标识码：A文章编号：0529-5130（2009）02-0006-03Effectsofsulfatedastragaluspolysacchari

3、desonimmuneresponsesofchickensinoculatedwithIBDvaccineSHIZhi-yu,HUANGXiao-yan,LIDa-peng,SUNJin-cheng,JUYan,HUYuan-liang*(CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)Abstract:Theeffectsofsulfatedastragaluspolysaccharides(sAPSs)onimmuneresponseinthechickensinoculatedw

4、ithIBDvaccinewereinvestigated.Twohundred14-day-oldchickenswererandomlydividedinto9groups.ThechickensinsixexperimentgroupswereintramuscularlyinjectedwithhighandlowclosesofsAPS,sAPSandsAPS,respectively,whilethreecontrolgroups,highandlowdosesofnon-modifiedAPSandnoadjuvantgroup(physiologicalsaline)weres

5、et.Theabovegroupsweretreatedonceadayforthreesuccessivedays.Ondays4aftertreatmentthechickenswereinoculatedwithinfectiousbursaldisease(IBD)vaccineandre-inoculatedafter18days.Ondays7,14,21and28afterfirstvaccination,thebloodsampleswerecollectedfrombrachialveinfordeterminationofserumantibodybyagardiffusi

6、on.Ondays14,21,28and35afterfirstvaccination,thebloodsampleswerecollectedbycardiopunclurefordeterminationofperipheralTlymphocyteproliferation.TheresultsshowedthatthreemodifiedsAPSscouldsignificantlyenhanceantibodytiterandpromotelymphocyteproliferationandpresentedadefinitedose-effectrelationship.Theim

7、muneregulationsofmodifiedsAPSswerebetterthanthoseofnon-modifiedAPS.Ingeneralevaluation,theefficacyofsAPSwasthebestandwouldbeexpectedasacandidateofnewimmuneadjuvant.Keywords：sulfatedastragaluspolysaccharide；chicken；serumantibodytiter；lymphocyteproliferation黄芷多糖（astragaluspolydsaccharide,APS）是中药黄芷的主要有

8、效成分，具有多方面的活性，尤其是具有广泛的免疫增强作用，能显著提高鸡新城疫和传染性腔上囊病疫苗的免疫效果。进一步的研究发现，黄茂多糖经硫酸化修饰以后，能进一步提高鸡新城疫疫苗的免疫效果。本试验测定了硫酸化黄芷多糖（sulfatedAPS,sAPS）对鸡传染性法氏囊病疫苗免疫应答的影响，旨在探讨硫酸化修饰提高黄芷多糖的佐剂活性的可能性，筛选出效果较好的sAPS,为研制新型免疫增强剂提供理论依据。1材料与方法1.1中药与试剂APS、sAPS物、sAPS%和sAPS凶，由中兽医学研究室提供，分别用PBS配制成高（8mg/mL）和低（4mg/mL）2种浓度，常规消毒备用。RPMI1640培养液为Gib

9、co公司产品，按说明书用三蒸水配制后过滤除菌，分装，4Y保存，临用前加小牛血清（杭州四季青生物制品厂）达10%和青霉素、链霉素各100U/mLo刀豆素球蛋白（ConA）,用RPMI1640培养液配制成0.025mg/mL,0.22pim微孔滤膜过滤除菌，分装，-20弋保存。四甲基偶氮哇蓝（MTT）,Amresco公司产品，用pH7.4的PBS配成5mg/mL,0.22fim微孔滤膜过滤，避光4Y保存。淋巴细胞分离液，上海恒信化学试剂有限公司产品，批号20001220o二甲亚砚（DMSO）,分析纯，苏州正兴化工研究院产品。IBD抗原由本实验室保存。1.2主要仪器DG-3022型酶联免疫检测仪，国

10、营华东电子管厂产品；CO?培养箱，美国Revc。公司生产；XSZ-D2型倒置显微镜，重庆光学仪器厂生产；75.2A型微量;振荡器，上海医用分析仪器厂生产；96孔细胞培养板，德国Nunclon公司生产。1.3动物分组及处理14日龄蛋公鸡200只，随机均分为9组。空白对照组不做任何处理；6个试验组分别肌肉注射两种浓度的sAPSq、sAPSqsAPS曲，2个多糖对照组注射两种浓度的APS,0.5mL/只，无佐剂对照组注射等量生理盐水，每天1次，连续3d,第4天用4羽份法氏囊病中等毒力活疫苗（NF8株，南京药械厂生产，批号0510637）滴鼻、点眼免疫，2周后二免。分别于首次免疫后第7（%）、14（服

11、）、21（DQ、28（D28）天每组随机抽取6只翼静脉采血，分离血清，测定血清抗体效价。于首次免疫后第14（D”）、21（D”）、28（D28）、35（D35）天每组随机抽取3只，心脏采血5mL/只，肝素抗凝，测定淋巴细胞增殖。1.4血清抗体效价测定用AGPT法56、在血凝板上，每孔先加40皿PBS液，然后每排的第1孔加入40pX待检血清，依次倍比稀释直至第6孔。在琼脂平板上，按七孔图进行打孔，标记，封底。中间孔加入40aL4单位法氏囊抗原，周围孔加入倍比稀释的血清，同时设阳性血清、阴性血清及空白孔对照。加样后于室温静置40min,移入湿盒内，37Y孵育72h后判定结果，以出现沉淀线的血清最大

12、稀释度为该血清的抗体效价。1.5淋巴细胞增殖测定用MTT法将抗凝血样用Hankk液稀释1倍，小心加在淋巴细胞分离液上层，2000r/min离心20min,吸取中间云雾状白细胞层，用无血清RPMI1640营养液洗2遍，1500r/min离心15min。细胞计数，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为2.5x"个/mL,加入到96孔细胞培养板中，80孔，每孔再加20皿ConA，每个样品重复4孔，然后置于39.5Y、5%CO2条件下培养44h,取出每孔加入MTT20皿，继续培养4h后，每孔加裂解液100皿，将细胞板置于微量震荡器上震荡5min使沉淀完全溶解，在酶联免疫仪上检测570nm处的

13、吸光（4570）值，作为T淋巴细胞增殖的指标。1.6数据分析数据以平均值土标准差表示，用SPSS软件进行Duncan's多重比较。2结果2.1血清抗体效价的动态变化首免后第7、14天，用琼脂扩散法测不出血清中IBD抗体效价。一免后21d（二免后7d）,sAPSJK剂量组的抗体效价显著高于APS的高、低剂量组和无佐剂对照组（P<0.05）,sAPS”低剂量组显著高于APS高剂量组和无佐剂对照组（P<0.05）,sAPS对低剂量组稍高于APS的高、低剂量组和无佐剂对照组；一免后28d（二免后14（1）,所有修饰多糖组的抗体效价均显著高于APS的高、低剂量组和无佐剂对照组（P&l

14、t;0.05）（表1）。表明3个修饰多糖在一定的剂量能提高显著雏鸡血清1BDV抗体效价,在一定时间点的作用强于APSOh高剂量（8mg/mL）；L低剂量（4m阿mL）。下同。表1血清IBDV抗体效价的动态变化log?组别1）2】sAPS40H2.5±0.500°5.4±0.244sAPSl4.3±0.62"5.6±0.244命sAPSjqh2.5±0.500'"5.3±0.478absAPSl2.7±0.478厦6.0土0.0008sAPSh2.3±0.667'4.8&

15、#177;0.750、sA%,4.7±0.333*5.2±0.374"APS2.0±0.00c3.3±0.250"APSl2.5±0.SOO1*1.7±0.333d无佐剂对照l.7±0.577v2.0±0.408d空白对照2.0±0.245。2.0±0.000d注：同列数据标注不同字母者表示差异显著(P<0.05)o2.2淋巴细胞增殖的动态变化首次免疫后14d,sAPS”高剂量、sAPS”低剂量、sAPS"低剂量、sAPS的高剂量、sAPS低剂量和APS低剂量

16、组的么7。值显著大于无佐剂对照组（P<0.05）,sAPS加低剂量和sAPS凶低剂量组显著大于APS的高、低剂量组（P<0.05）；免疫后21d,，入探加低剂量和sAPSe低剂虽组的4珈值显著大于无佐剂对照组和APS的高、低剂量组（P0.05）,sAPS低剂量组的a，。值显著大于无佐剂对照组和APS的高剂量组（P0.05）；免疫后28d,各多糖组的值均显著大于无佐剂对照组（尸<0.05）,sAPS低剂量组显著大于APS高、低剂量组（P<0.05）；免疫后35d,，入处卸高剂量和APS低剂量高剂量组的A,。值显著大于无佐剂对照组(PvO.05),(表2)。表明3个修饰多糖

17、在一定的时间点均能显著sAPSjo高剂量组显著大于APS低剂量组(P<0.05)促进雏鸡外周血T淋巴细胞增殖，作用强于APS。表2淋巴细胞增殖的动态变化以珈)组别DmD21DmD35sAPSqh0.316±0.076"0.214±0.081福0.331±0.084c0.183±0.084"sAPSy0.626±0.096*0.448±0.028ab0.444±0.0630.141±0.049sAPSh0.167±0.057*0.178±0.0650.501±0

18、.011"0.262±0.017asAPSjql0.263±0.067日0.548±0.030*0.394±0.013。0.153±O.045、sAPSqh0.218±0.052&0.132±0.019d0.488±0.098b0.195±0.081厦sAPSql0.434±0.018b0.342±0.015b0.592±0.0】8，0.184±0.048*APSh0.161±0.0380.194±0.0350.377±

19、;0.078*0.208±0.019,bAPSl0.266±0.0120.27±0.093*0.292±0.042c0.145±0.028。无佐剂对照0.Hl土0.017,0.21±0.033*0.185±0.055d0.163±0.071。空白对照0.149±0.043f0.123±0.035d0.151±0.010d0.152±0.045c3讨论已完成的研究证实，多糖的活性直接或间接地受到其分子结构的影响。不少多糖经过分子修饰后，其生物活性有一定的提高，甚至还增加了新的功

20、能。本试验中抗体效价的测定结果表明，虽然修饰的和未修饰的APS组的抗体效价比无佐剂对照组均有所提高，但是各修饰多糖组的抗体效价多高于未修饰多糖组。这些结果证明，硫酸化修饰确实提高了黄芷多糖增强体液免疫的作用。T淋巴细胞增殖测定结果显示，8个多糖组在相同时间点的4洒值大多显著大于无佐剂对照组，表明修饰的或未修饰的APS均能显著增强细胞免疫。进一步比较修饰多糖和未修饰多糖组可见，硫酸化修饰确实提高了黄芷多糖增强细胞免疫的作用。综合比较3个修饰多糖的作用，sAPSw低剂量组的抗体效价显著大于无佐剂对照组的总数最多，在免疫后21d抗体效价最高，免疫后28d的缶7。值最大，表明sAPS®的效果

21、好。有报道认为，硫酸多糖的活性与其硫酸基取代度有很大关系，硫酸根含量在每个糖残基平均为1.52.0时最佳口°。本研究使用的3个硫酸化黄芷多糖中，以sAPSs的硫酸基取代度为最高(1.545),且刚好在1.52.0之间，所以其活性最强。从量效关系分析，3个修饰多糖低剂量组的抗体效价和由70峰值多高于高剂量组，抗体效价显著大于无佐剂对照组的总数也最多，表明硫酸化黄茂多糖的增强免疫作用有一定的量效关系，低剂量的效果优于高剂量。综上所述，硫酸化修饰能提高黄芷多糖的增强免疫活性，硫酸化黄芷多糖能增强鸡传染性法氏囊病疫苗的免疫效果，且有一定的量效关系，低剂量的效果优于高剂量。综合评价以sAPSs的活性最强，可以作为新型免疫佐剂的候选药。参考文献：1 沈美玲，翟世康，罗英德，等.黄芷多糖生物活性的初步研究J.中国中西医结合杂志，1984,4(7)：420.2 李宏全，段县平，马海利，等.黄茂多糖对鸡新城疫和传染性腔上囊病疫苗免