猪轮状病毒油乳剂灭活疫苗的制备及免疫原性试验.docx

1、猪轮状病毒油乳剂灭活疫苗的制备及免疫原性试验史月明'，葛俊伟】，乔薪暧】，刘力威2,张冠群李一经I(1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030；2.黑龙江省曾医研究所，黑龙江齐齐哈尔161006)中图分类号：S852.65+9.4丈献标识玛：B文章编号：0529-6005(2010)080027-02猪轮状病毒(porcinerotavirus)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)、轮状病毒属(Rotavirus)，是引起仔猪发生急性胃肠道传染病的重要病原，自1975年Woode和Bridge首次从猪体分离出猪轮状病毒以后，世界各国均有不同程度的猪轮状病毒感染报道。在我国

2、猪轮状病毒感染亦十分普遍，李国平等在调杏中发现仔猪110H龄阳性率42.4%66%,10日龄到断奶阳性率83.2%91.7%,断奶后阳性率为63.2%72%。临床症状主要表现为恶心、呕吐、腹泻，成年猪一般呈隐性感染。鉴于猪轮状病能感染普遍,危害大，对猪进行疫苗接种预防猪轮状病毒感染具有重要意义。收日耕200907-07基金项目：“卜一五”国家科技支押项目(2006BAD06A07)；黑龙江省“十一五”攻关项目(GA06B202-4)作者简介：史月明(1983-),女，硕士.从事预防善明学研究通讯作者：李一经，E-mail»yijingliYAYyXMK>«>&l

3、t;AV为垂要，首先考虑到引物的通用性，本文根据抗体可变区基因序列的保守性，合成了一对针对柬链可变区的通用引物，试验结果显示，扩增到328bp的重链可变区基因，经序列测定后，发现该基因为小鼠免疫球蛋白基因。与鼠源单克隆抗体比较基因工程抗体的具有操作简便、表达量:大、成本低廉的特点，用克隆的V区基因可产生与抗原特异性结合的抗体片段，利用基因突变技术改变抗体的某些结构可提高抗体的亲和力，比如单链抗体，嵌合抗体等.可延长其半衰期-8】。随着分子生物学和免疫学技术的不断发展，基用工程抗体势必将会对人类的生产、生活起到更大的促进作用。本试验通过RT-PCR技术成功扩增了抗JEVE蛋白单抗5D4重链可变区

4、基因，并对该基因进行了序列分析，结果显示，该基因与小鼠免疫球蛋白基因相符。我们正在开展51)4基因工程抗体的研究，该基因克隆与序列分析为此研究奠定了戊好的基础。本试验旨在制备猪轮状病程油乳剂灭活疫苗，并研究其免疫原性，为该疫苗的应用奠定基础。1材料与方法1毒种、细胞和试验动物猪轮状病毒系国内分离株JL94株细胞适应毒叫MA-104细胞自武汉大学中国典型培养物保藏中心；家兔体重约2.5kg,购自哈药集团实验动物中心。1.2检测抗原、抗体和主要试剂重组猪轮状病毒VP6抗原，抗猪轮状病毒VP6蛋白单抗山本实验室制备保存7;灭活剂BEI购自Alfa-Aesar公司；10号白矿汕购自杭州炼油厂；司盘-8

5、0购自上海大众制药厂。1.3毒种的研究1.3.1原始毒种的鉴定将猪轮状病毒JL94株细胞培养物接种MA-104细胞，进行扩大培养。将收获的病扉纯化后富通过电镜观察、RTPCR：3：及测序进行鉴定。参考文献：1 vanDenHurkAF.MontgomeryBL.NorthillJA,ctal.Shortreport:thefirstisolationofJapaneseencephalitisvirusfrommosquitoescollectedfrommainlandAustraliaJ.AmJTropMedHyg,2006,75(1),21-25._2_LarrickJW.Potenti

6、alofmonoclonalantibodiesaspharmacologicalagentsCJl.PharmRev,1989,41s539-557.3 赵付荣.乍条虹，王斌.等.流行性乙型脑炎病毒E蛋臼单克隆抗体的制备与鉴定J.中国善医杂志,2010,46(1):3-5.4 MartsevSP,ChumanevichAA.VlasovAP,etal.Antiferritinsingle-chainFvfragmentisafunctionalproteinwithpropertiesof&partiallystructurestate:comparisonwiththecomple

7、telyfoldedV(L)domainJJ.Biochemistry,2000«39(27).8047-8057.5 AsanoR,TakcmuraS,TsumotoK,etal.Functionalconstructionoftheanti-mucincoreprotein(MUC1)antibodyMUSE11variableregionsinabacteria!expressionsystem；J.JBiochem,2000.127(4),673679.6 WinterG,MilisteinC.Man-madeantibodiesTJ".Nature.1991,34

8、9(6307)：293-299.7 BenharI,PastanI.IdentificationofresiduesthatstabilizethesinglechainFvofmonoclonalantibodiesB3J：.JBiolChem,1995,270i23373-23380.8 MatsO,Henrik().MichaelM.etal.LightchainshufflingofahighaffinityantibodyresultsinadriftinepitoperecognitionIJ.MolecularImmunology,1996,33(1)；4756.1.3.2种子批

9、的建立基础种毒的建立：取本实验室保存的原始种毒进行传代，每隔4代进行TCID50测定，当细胞毒价稳定在10小lOTCIDso/O.2ml.,混匀后分装.保存于一86C,制成基础种毒。生产种毒建立：取基础种毒，进行扩大培养，混合后分装，保存于一86P,制备成生产种毒，用于制备疫苗。1.3.3毒种的细菌和支原体检测按照中华人民共和国兽用生物制品质量标准进行检测。1.4制备疫苗灭活：生产种卷按终浓度1.5%加ABEL371灭活24h,加入2%硫代硫酸钠终止灭活。灭活后抗原原液、十倍和百倍稀释液接种MA-104细胞培养120h,观察细胞病变。油相制备：取10号白油，加入硬脂酸铝使其浓度达到2%,边加边

10、搅拌，加热直至硬脂酸铝全部溶解为止。然后加入司盘-80,使其终浓度达到6%,搅匀后停止加热。水相制备：将灭菌吐温80加入到灭活病毒悬液中，使其终浓度达到4%5%,充分搅匀，宜到吐温80彻底溶解。乳化：取油相放入胶体磨中慢速搅拌.同时徐徐加入水相，使油相与水相体积比为1.5:1,800010000r/min乳化10min。终止搅拌前加入1%硫柳汞.使其终浓度为0.01%。L5疫苗物理性状测定冷水表面试验:将疫苗数滴滴于冷水表面，观察是否扩散；黏度检测：室温用】mL吸管吸取疫苗1mL.使其自由落下，记录滴下（）.4mL疫苗所需时间；稳定性试验：将疫苗3000r/min离心15min,分别骨37*C

11、和41冰箱观察分层情况。1.6家兔免疫将家兔随机分为2组，命名为首免组和二免组。各组均肌肉注射猪RV灭活油佐剂疫苗免疫1.5mL/只；2周后二免组进行同剂量同批次疫苗加强免疫，免疫前各组采血1次及免疫后每周采血分离血清，分装后一86P保存备用。1.7血清中猪RV特异性抗体水平检测采用间接ELISA和细胞中和试验进行检测。2结果2.1原始种毒鉴定结果2.1.1电镜检查结果纯化后病毒经电镜观察，病毒颗粒略呈圆形，直径为65nm75nm,形似车轮.为典型的轮状病毒颗粒。见图1。图1电镜下JL94病毒粒子形态（200000X）1. 1.2RT-PCR鉴定结果VP6全基因长1356bp,扩增产物约为13

12、00bp,与预期结果相一致.见图20并将扩增产物通过序列测定与GenBank中JL94株VP6序列（AY538664）比对，相似度100%。2.2种子批毒种的建立基础种毒的建立：将原始毒种JL94株进行培养.增殖到第58代，收获的毒价稳定在108-2sTCID50/mL,见表1。将病毒按每包装5mL,-86*C冻存，建立基础毒种批。bpbp2000I000750500250100123图2PRVJL94株VP6基因的RT-PCR结果1.DL-2000DNAMarker,2>RT-PCR产物；3：阴性对熙病毒稀择度10310«10s10遍10，108毒价（TCIDso）CPE比率

13、4/44/44/44/44/43/410«-2S/mL表】病毒TCID的测定2.3毒种的细菌、支原体检测结果毒种猪RV2.4疫苗的制备结果JL94株经检验，均无需氧薄、厌氧菌、真菌和支原体2.4.1抗原液灭活检测将BEI灭活抗原液的污染。原液、10倍稀释液与100倍稀释液接种于MA-生产种毒的建立：将基础种子批病毒第58代进行扩大培养，按每包装400mL,86*C冻存.建立工作毒种库。104细胞后120h均无CPE出现，该抗原液灭活彻底。2.4.2疫苗物理性状测定冷水表面试验:疫苗滴于冷水表面，油滴边缘整齐，不向四周扩散，说明疫苗是稳定的油包水型；黏度检测：】mL吸管吸取1mL疫苗室

14、温垂直滴下所需时间为78s,在规定的黏度范围内；稳定性试验：3000r/min离心15min,37P放置21d,4*C放置1年，疫苗均未出现分层现象,说明疫苗具有良好的的稳定性。2.5疫苗效力检验2.5.1间接ELISA检测家兔体内抗体水平首免组和二免组家兔血清中IgG抗体效价均有明显的上升，峰值均为1:9600,至免疫后的21周首免组的抗体效价仍能维持在1:1000,二免组为1:40000见图3O图3猪RVBEI灭活疫苗ELISA检测抗体效价图3猪RVBEI灭活疫苗ELISA检测抗体效价w«最蝎工-G-2.5.2中和抗体试验检测家兔体内抗体水平首免组和二免组家兔，抗体效价变化规律性

15、基本一致,均在第3周抗体效价明显升高.峰值均为1:1800,于免疫后14周抗体效价开始缓慢下降，免疫后2】周，首免组的抗体效价仍维持在1:119,二免组为1:230。见图4。图4猪RV疫苗(BEI灭活)中和抗体效价3讨论本试验利用我国猪轮状病毒分离毒株JL94株制备油乳剂灭活疫苗.免疫家兔，通过细胞中和试验和间接ELISA试毁，证明以该病毒为种毒，可以剌激机体产生免疫应答和保护性抗体，并呈现出一定的抗体消K规律。为了保证疫苗的免疫原性，制备病毒抗原时使病毒液的感染力滴度达到ICTTCIDso/mL以上。鉴于此，本试验首先将猪轮状病毒分离株JL94株在MA-104细胞系上传代适应细胞，制备基础种

16、毒。该病毒传至第58代，滴度达到lOTCIDso/mL.对其扩大培养，制备出生产种毒，作为制备疫苗的抗原液。通过细胞中和试验和间接ELISA试臆表明，首免组和二免组家兔血清抗体均升高明显，于免疫后21周首免组中和抗体效价和ELISA效价分别为1-119和1:1000；二免组为1：230和1：4000。因轮状病毒主要感染仔猪，符合疫苗免疫仔猪后免疫持续期的要求。比较两种抗体检测方法可以看出，ELISA检测抗体变化规律和中和试验检测抗体变化规律大致相同，均在免疫后3周左右抗体效价明显升高，持续到16周开始呈现下降的趋势。同时也可看出，一次免疫和两次免疫的效果相当，进行一次免疫即可。ELISA抗体检

17、测方法简单易行、操作方便，而中和试验检测方法比较繁琐，因此.在实际检测中采用ELISA方法也能反应疫苗免疫的有效免疫应答水平。上述试验结果为该疫苗的应用奠定了基础，疫苗对仔猪的保护尚待进一步研究。参考文献：1 李国平，伊顺仁，李发假.等.仔精轮状痛淮的感染情况调查J.福建帝牧料医.1999,21(2),44-45.2 陈淑红，王新生.师东方.等.猪轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究J.中国预防件灰笔报.2004,26(1),42-44.3 陈淑红，师东方，李一经.猪轮状病毒地方株JL94株VP6基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达J.畜牧兽医学报.2004,35(4),443-448.4 边亚蜡，林长水，王玉玲.等.抗猪轮状病推VP6做克隆抗体的制备与密定J.东北农业大学学报，2006,37(4)；489-491.5 文喻玲,赵庆欢.于洋，等.知化健密度梯度离心纯化轮状病毒J】.中华现代内科学杂志，2007,4(3),195-199.6 舌竹婷，析少华，杨宏军.等.检测牛轮状病奇抗体间接ELISA方法的建立J.中国预防善医学报.2009,31(3),213-214.7 中华人民共和国农业部.中