猪瘟疫苗的研究进展及ST细胞苗的研究现状.docx

1、狙稀'Email:nmgxmy2008平玲甘肃省动物细胞工程技术研究中心730030魏园园西北民族大学生命科学与工程学院730030王家敏甘肃省动物细胞工程技术研究中心730030沈武玲甘肃省动物细胞工程技术研究中心730030李倬西北民族大学生命科学与工程学院730030马忠仁甘肃省动物细胞工程技术研究中心730030乔自甘肃省动物细胞工程技术研究中心730030摘要：本文综述了国内外猪瘟(ClassicalSwineFever,CSF)疫苗的研究进展，对传统疫苗和新型疫苗进行了概述，重点阐述了ST细胞苗的研究现状，为进一步研究开发猪瘟疫苗，有效控制猪瘟提供参考。关键词：猪痕；疫苗；

2、免疫猪瘟是由猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus,CSFV)引起的一种高度接触性传染病,其特点是传染性强，发病率高，死亡率高。世界动物卫生组织将该病列为A类传染病,我国将其列为一类传染病。该病呈世界性分布，各养猪国家都有不同程度的流行。俄罗斯报告疫情163头猪感染叫印度东北米佐拉姆邦爆发疫情，已有600头猪死亡。目前，对猪瘟的治疗无有效方法，疫苗防御是预防猪瘟的主要措施，故研制开发安全、有效、稳定的猪瘟疫苗是兽医领域的工作重点。1传统疫苗猪瘟高免血清-血毒1833年猪瘟首先在美国发现，以后传播到世界各国。1903年在DeSchweiniz和Dorset131首次证明CSF

3、V是一种过滤性病毒以来，人们采用了各种免疫方法预防和控制猪痕。1908年匈牙利Hutyra'*制备了CSFV高免血清，通过肌肉注射免疫猪群产生抗体。血清-血毒注射能够产生较强的保护力，但是由于高免血清价格昂贵，获取较困难，而且有散播的危险，故各国学者转向了灭活疫苗研究。1.1 猪瘟灭活疫苗20世纪中期相继研制出了许多灭活疫苗。我国何正礼同等人选用抗原性良好的石门系毒株研制成猪瘟结晶紫灭活疫苗。20世纪70年代随着免疫佐剂的开发和病毒培养技术的推动，国外研制出了较为理想的猪瘟灭活疫苗。但是灭活疫苗存在免疫剂量大、免疫期短、产生免疫力时间慢、不能引发局部免疫、仅能皮下和肌肉注射和成本较高等

4、缺点，故逐渐被猪瘟弱毒疫苗取代。1.3猪瘟兔化弱毒疫苗猪瘟弱毒疫苗株是由野毒株致弱而成,如中国的“C”株、日本的GPE株和法国Thiverva株等都是广泛应用的CSFV疫苗株，一般都可终身免疫。我国的“C”株是1950年中国兽医药品监察所培育的猪痕兔化弱毒疫苗；1954年周泰冲等人成功培育出兔化弱毒株“C”株，制成疫苗，1955年开始重点试用，1956年开始在国内外推广使用，对控制猪瘟的传播起了决定性的作用；1964年研制成功乳兔疫苗,1965年在全国推广使用。中国培育的“C”株是国际上公认的安全有效的疫苗株，该疫苗对猪安全，其毒力不返强,产生免疫力快，在猪体内连续传代后仍保持弱毒并且免疫期长

5、。长期以来,猪瘟兔化弱毒疫苗普遍使用使CSFV野毒株及兔化弱毒抗原发生了变异，出现了慢性和隐性感染等非典型流行形式吐使疫情难以控制或造成免疫失败。2新型疫苗2.1基因工程亚单位疫苗基因工程亚单位疫苗是采用DNA重组技术，利用真核细胞高效表达系统来表达猪瘟病毒免疫蛋白，并以此表达产物制造疫苗，这种抗原是病毒粒子的一部分，并不含有核酸,故比较安全。CSFV编码的E0和E2蛋白是主要的保护性抗原，均能独立诱导机体产生中和抗体，保护机体免受强毒攻击。BoumaA等人明通过实验证明，E2亚单位疫苗接种10d可预防猪瘟的发生。将猪瘟病毒E2基因的cDNA基因与多角病毒(AcNPC)重组，在sf21细胞中表

6、达，用20ug-100ug的表达蛋白免疫猪群，可抵抗100XLD50的猪瘟强毒攻击，其诱导产生的中和抗体水平远高于由弱毒疫苗免疫产生的水平四。由于E2蛋白的最佳表达系统为真核细胞，在杆状病毒-昆虫细胞系统中高效表达外源蛋白，蛋白在加工过程中，细胞能够进行糖基化修饰，所得到的病毒蛋白以一种天然的形式表达叫。因此，利用真核细胞表达的E2蛋白作为亚单位疫苗具有稳定、安全和可规模化生产等特点，具有较好的保护力。2.2病毒活栽体疫苗重组活载体疫苗是用基因工程技术将保护性抗原基因转移到载体中，使之表达而制成的疫苗。以无致病力或者低毒力的痘苗病毒(VCA)、伪狂犬病病毒(PPV)或腺病毒为载体，将猪瘟病毒E

7、2基因与之重组研制出的基因重组疫苗，免疫动物后可对两种病毒产生良好的保护力。Rumenapf.T等人把猪瘟病毒的结构蛋白插入到痘病毒的TK基因中，表达结果显示：构建了3个重组病毒，即VACcore、VAC3.8和VAC3.8*(咨)。试验证明,VAC3.8免疫猪能诱导猪瘟病毒中和抗体的产生，接种VACcore和病毒活载体的猪出现典型的猪瘟症状"气将无致病力或低毒力的活病毒载体与猪瘟病毒的E2基因重组研制出的重组疫苗，免疫动物后可对3种病毒产生良好的保护力。目前，人类还不完全了解病毒的自然发生和变异机制，也无法控制这种重组病毒的发展趋势，故还需做进一步研究。2.3病毒核酸疫苗由编码能引

8、起保护性免疫反应抗原的基因片段和载体构建而成。DNA疫苗注入机体后的表达产物作为内源性抗原通过MHC-I分子递呈，激活细胞免疫；又可以分泌到细胞外，被抗原呈递细胞摄取、处理之后通过MHC-II类分子递呈，激活体液免疫。J.TarradasJ.M.Argilaguet等间用DNA-E2疫苗免疫猪,免疫猪群产生强烈的T细胞免疫并有7干扰素的产生，免疫7天后出现中和抗体。Ganges等g将构建的含22个氨基酸的E1基因和E2基因的DNA疫苗pcDNA3.1/E2免疫猪，在最后一次免疫后17天可检测到T细胞免疫，攻毒后可以很快激活体液免疫，达到全面的保护。余兴龙、Hammond等凹分别构建了CSFV-

9、E2基因不同的重组表达质粒，肌肉注射小鼠均能诱导产生CSFV的中和抗体。2.4病毒标记疫苗借助基因工程技术,将具有选择性的基因标记，替换或克隆到致弱病毒全长的cDNA中，获得重组病毒，其免疫原性不改变。将重组病毒接种到动物体内，可以区分抗体是由自然感染还是标记疫苗免疫生长。FranziskaW等晦用E2基因的相应序列代替弱毒的CSFV非编码区和野毒株构建了pRiems-ABC-Gif,pRiems-A-Gif,pRiems-BC-Gif和vRiems-ABC-Gif的cDNA重组体。pRiems-ABC-Gif和pRiems-BC-Gif获得可感染的病毒粒子,pRiems-A-Gif起着复制子

10、的作用，可产生一些可感染的RNAovRiems-ABC-Gif感染猪后可检测到大量的抗E2的抗体。ClaudiaG等网选用CP7-E2alf作为标记基因构建的疫苗对猪进行口服或肌肉注射,6个月后所有的猪体内都检测到特殊的E2慵蛋白抗体，免疫期间对CSFV的剧毒株能够产生稳定的中和抗体。3ST细胞苗的研究现状1965年McClurkinAW等人分析猪传染性胃肠炎致细胞病变的特点时分离得到的ST细胞，该细胞对多种病毒比较敏感，如猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)和伪狂犬病毒(PRV)等。猪瘟传代细胞苗是采用猪睾丸传代细胞系(ST细胞系)生产的猪瘟疫苗。猪睾丸传代细胞系(ST细胞系)与猪同源

11、，适合猪瘟病毒增殖，有效提高病毒滴度。据报道，它比牛睾丸原代细胞生产的疫苗提高了20多倍。猪睾丸传代细胞系（ST细胞系）可以建立细胞库控制细胞质量，生产工艺稳定，有效解决了疫苗中BVDV外源病原污染的问题。猪瘟细胞源活疫苗免疫猪后平均抗体阻断率在45.51%65.66%之间，猪瘟传代细胞苗免疫后阻断率在65%左右，抗体的阻断率高，离散度较低。利用ST传代细胞系生产的猪瘟病毒活疫苗，已经在国内生产和销售，并已形成猪瘟活疫苗传代细胞源质量标准。目前，该生产工艺是采用传统的转瓶培养ST细胞工艺，即种子脾毒或细胞毒接种已形成单层的转瓶ST细胞，每45天收获一次毒液。由于每个转瓶的细胞质量、病毒产量和滴

12、度都不同，导致疫苗的批间差很大。随着生物反应器的发展,大规模转瓶培养动物细胞疫苗工艺技术向生物反应器培养动物细胞疫苗工艺技术的转变成为必然网马良冏等利用潮汐式生物反应器培养ST细胞，培养体积500mL,6d的细胞密度达600xl04/mL,相当于12个10L转瓶细胞量。华平等剧对方瓶、转瓶和生物反应器培养ST细胞进行了比较，结果显示生物反应器中进行ST细胞的批培养，细胞最高密度分别比转瓶和方瓶高80%和83%,乳酸对葡萄糖的得率系数分别比转瓶、方瓶降低了10.5%和39.3%,说明生物反应器优于转瓶和方瓶培养ST细胞。清大天一研发的适用于反应器微载体培养ST细胞的个性化细胞培养基J20L反应器

13、微载体培养ST细胞技术J20L反应器微载体培养ST细胞生产猪瘟病毒等技术，为反应器微载体生产猪瘟活疫苗技术的产业化奠定了扎实的基础国。采用悬浮培养技术开发成功的高效价猪瘟疫苗，使我国的生物制品产业有了重大的工艺技术突破。4结语疫苗对猪瘟的预防、控制起到了不可代替的作用。就发展而言，新型疫苗的研究和开发需向低成本、高产率、更安全的产业化方向努力。在传统猪瘟细胞苗生产研制中，应用大规模生物反应器,将替代传统的转瓶模式,为细胞苗的生产带来了新的飞越。参考文献：1触罗斯又报道两起非洲猪我疫精EB/OLJh叩/wwwxinnongcom/zhu/news/973290shtml2013-04-18印度东

14、北部爆发猪AEB/OL3JVANEs,L.,andMCGRATH,C.B.Swineerysipelas.ResearchBulletin128,CollegeofAgriculture.UniversityofNebraska,1942.4HUTYRA,F.,andMAREK,J.Specialpathologyandthenpeudcsofthediseasesofdomesticanimals.3rdauthorizedAmericaned.,AlexanderEger,Chicago,1926.I:81-99.闵王在时.猪瘟防制研究的回顾与展免.中国善药监察所研究报告汇国家掣登计划19

15、95-1999专集)，1999,14:1-286周泰冲，用兔化猎瘦弱毒夜苗消灭4t<J.1958,(11)569-571.7JLeiferI,EverettH,HoffinannB,ecal.EscapeofclassicalswinefeverC-strainvaccinevirusfromdetectionbyC-strainspecificreal-hmeRT-PCRcausedbyapointmutationintheprimer-bindingsite(J).JVirolMethods,2010,21.8 BoumaA,DeSmitAJ,DeJongMCM,etalDeterm

16、inationoftheonsetoftheherd一immune-ityinducedbytheE2sub-unitvaccineagainstclassicalswinefevervirvsJ.Vaccine2000,18.9 BoumaA,deSmitAJ,deKluijverEP,etalEfficacyandstabilityofasubunitvaccinebasedonglycoproteinE2ofclassicalswinefevervirusJ.VctMicrobio,1999,66：101-114.10 HulistJK,westraDF,WenvoortG,etal.G

17、lycoproteinE2ofhogcholeravimsexpressedininsectcellsprotectsswinefromhogcholeraQ).JVirol,1993,67:5435-5442.11 张文杰，李向东，赵饮柱，等.猪集病春E2蛋白在昆虫的胞/杆状疡毒中的表达(J.中国实睑动物学报，2007,32(1):48-53.12 RumenahfT,StarkR,MeyersG,etal.Structuralproteinsofhogcholeravirusexpressedbyvaccinevirus:furthercharacterizationandinduedon

18、ofprotectiveimmunityJ.JVirol,1991,65(2):589-597.13y.Tarradas,J.M.Argjlaguetetal.InterferongammainductioncorrelateswithprotectionbyDNA1vaccineexpressing£2glycoproteinagainstclassicalswinefevervirusinfectionindomesticpigs(J.VETERINARYMICROBIOLOGY,2009,9(43):1-28.14 GangesL,BarreraMetal.DNAvaccine

19、expressingtheE2proteinofclassicalswinefeverviruselicitsTcellresponsethatcanprimeforrapidantibodyproductionandconfertotalprotectionuponviralchallenge.Vaccine,狙稿Email:nmgxmy2008浅谈家畜能量与家畜营养栾大章吉垛省梨树县沈洋镇畜牧兽医站136500家畜的能量与家畜的营养关系到家畜成长的整个过程，更关系到养殖户的切身利益，做好家畜的能量与营养工作至关重要。1家畜的能来源动物机体所需的能量来源于饲料中的三种有机物质，即碳水化合物、

20、脂肪和蛋白质,而且主要来源于植物体内多糖体的分解产物菊萄糖。纤维素和淀粉都是由葡萄糖的长链组成，它们的区别仅仅在于菊萄糖单位之间化学健的儿何图形不同。这种结构上的区别造成纤维素和淀粉在物理性能上的差异。家畜机体本身不能制造使纤维素各个葡萄糖单位之间化学健断裂的胸，因而不能直接利用纤维素，必须通过消化道中细菌的发酵才能从中获取能量。在各种家畜中，反刍家畜因其消化器官结构的特殊性，能有效地利用瘤胃微生物对纤维素发酵，取得大部分机体所需要的能量。而非反刍的单胃畜和家禽，虽然盲肠和结肠内的细菌也可以酵解纤维素，但是饲料通过这部分的速度很快，细菌所起到的作用很小，因此作为能最来源的碳水化合物主要是淀粉。

21、家畜所需的能量除直接取自消化道吸收的葡萄糖外，还取自体内哲时储备的糖元和体脂助。在一定条件下，蛋白质也可用于产生能量。饲料中的有机物质经完全氧化后生成水和二氧化碳产物，并同时释放出能量。2饲料能量在机体内的转化家畜采食的饲料经过消化后，部分饲料能量:以粪能形式损失。粪能损失主要和采食饲料的性质有关。例如，哺乳动物排除的粪能仅占摄入能量的10%,而采食劣质粗饲料的成年反刍家畜摄入的能量达60%以上。饲料总能量减除粪能星称为可消化能。可消化能被吸收后，其中蛋白质部分的能量在体内不能充分氧化利用，这种未氧化的能最经尿排除，称为尿能。尿能损失比较稳定，但也受到饲粮结构，特别是饲粮中的蛋白质含量的影响。代谢能中部分能量以营养物质代谢引起的体增热以及消化道微生物发酵产生的热经体表散失,余下的称为净能。净能利用于基础代谢和维持家畜体温的恒定，并以化学能的形式储存于畜产品中，或以机械能的形式作功。3体增热与体热调节家畜采食饲料后伴有产热增加的现象。饥饿家畜采食饲料后，数小时内的产热量高于饥饿时和基础代谢时的产热量。体增热可用占饲料总能或代谢能的百分比或绝对值表示。但是高温条件下.体增热将成为家畜的额外负担。产生体增热的主要原因2005,23(28):3741-3752.(15 HammondJM,McCoyRJ