用携有存活蛋白基因的重组腺病毒载体转染树突状细胞诱导细胞毒T

1、用携有存活蛋白基因的重组腺病毒载体转染树突状细胞诱导细胞毒T细胞抗淋巴瘤免疫效应         08-03-04 11:04:00     编辑：studa20            作者：朱雄鹏，陈志哲，胡建达，李纯团，杨婷，许贞书【摘要】  本研究探讨转染survivin(SVV)基因的树突状细胞(DC)体外诱导特异性抗淋巴瘤的免疫效应。对人外周血DC

2、进行诱导培养，以AdSVV转染DC，用Western blot 鉴定Survivin的表达，用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应，用混合淋巴细胞反应（MLR）测定DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力，以ELISA法检测上清中的细胞因子IL12含量。结果表明：在MLR中，刺激应答比（S/R）为15、110、150和1100时，转染AdSVV的DC有较强刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力；转染AdSVV的DC组所诱发的CTL活性明显高于对照DC组；转染病毒后第2天，转染AdSVV的DC组的IL12分泌水平高于对照DC组。结论：含存活蛋白基因的DC能够在体外诱导特异性CTL效应

3、，对CA46细胞有明显的杀伤作用。 【关键词】  survivin基因 树突状细胞 CA46细胞系 淋巴瘤 细胞毒性T细胞 免疫治疗Induction of Antilymphoma Cytotoxic T Cell Effect by Dendritic Cells Transfected with Recombinant Adenovirus Vectors Carrying Survivin Gene      Abstract    This study was purposed to inves

4、tigate the immunological effects of modified dendritic cells (DCs) in inducing cytotoxic T cells (CTLs) effect against lymphoma cells. The DCs were derived from human peripheral blood and transfected with recombined adenovirus vector carrying  survivin gene, Western blot was used to detect the

5、expression of survivin, the  lactate dehydrogenase (LDH) release test was used to determine the cytotoxicity of CTLs, the mixed lymphocyte reaction (MLR) was used to measure the ability to proleferate allolymphocyte by DCs, ELISA was used to assay IL12 level in supernatant.    Th

6、e results showed that  the expression of  survivin in transfected dentritic cells was confirmed by Western blot analysis. In MLR assay, DCs transfected with Adsurvivin could induce higher allogeneic lymphocytes reaction at the ratios of 15,110,150 and 1100. DCs transfected with Adsurvivin

7、had much higher activity of CTL to CA46 cells than  control DCs. The levels of IL12 of supernatants containing DCs transfected with Adsurvivin were significantly higher than that in the control group. It is concluded that  DCs transfected with Adsurvivin can induce CTL response in vitro

8、60; against lymphoma cells.    Key words    survivin gene； dendritic cell； CA46 cell line; lymphoma;  cytotoxic T cell; immunotherapy    树突状细胞(dendritic cell, DC)作为机体内功能最强的专职抗原呈递细胞(APC)，在激活T细胞介导的免疫反应中起关键性作用，而survivin（存活蛋白，SVV）基因是肿瘤组织较为特异的基因，其编码的蛋白sur

9、vivin成为肿瘤较理想的靶抗原之一。因此，我们以重组腺病毒介导SVV基因修饰DC，观察诱导产生的特异性抗淋巴瘤免疫效应，为以DC为基础肿瘤免疫治疗提供实验依据。    材料和方法    材料    表达survivin蛋白的重组腺病毒（AdSVV）由本所构建、包装1，滴度为： AdSVV 2.65×109pfu/ml；恶性淋巴瘤细胞株CA46为本室保存株。总蛋白裂解酶、蛋白酶抑制剂为美国Pierce公司产品；兔抗人survivin多克隆抗体为北京中杉生物技术公司产品；辣根标记山羊抗兔IgG、W

10、esternblotting lunimol试剂（ECL）为Santa Cruz 公司产品。Cytotox96 NonRadioactive Cytotoxicity Assay试剂盒购自Promega公司。细胞因子IL12检测试剂盒购自深圳晶美生物公司。    中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(3)转染存活蛋白基因的树突状细胞抗淋巴瘤免疫的研究 DC的分离、培养和病毒感染    人外周血DC的分离和培养参照文献1，收集培养第7天的DC，按MOI为100加入重组腺病毒，分为3组： 转染AdS

11、VV的DC组(AdSVV DC)、空载体转染DC组（AdCMVDC）和未转染DC组（NDC），并补充生长因子GMCSF、IL4（终浓度均为1 000 U/ml）。于37 5% CO2，培养箱继续培养48小时 (第9天)收集细胞。    Survivin蛋白表达的Western blot鉴定    收集第9天转染AdSVV的DC组和空载体转染DC组的DC，进行蛋白质抽提，SDSPAGE电泳，Western blot鉴定外源基因SVV蛋白的表达1。    同种混合淋巴细胞反应(MLR)测定 

12、0;  取培养第9天的AdSVVDC和NDC，分别加入丝裂霉素C，使其终浓度为50 g/ml，在37，5% CO2的培养箱中培养45分钟，作为刺激细胞。分别以2×104/孔、1×104/孔、2×103/孔、1×103/孔将DC加入96孔板中，以T淋巴细胞供者自身的PBMC为对照组，每组设3个复孔。每孔均加入1×105的T淋巴细胞，刺激反应细胞之比（S/R）分别为15，110，150，和1100，终体积200 l，于37，5% CO2的培养箱中培养96小时。终止培养前4小时加入MTT  20 l（5 mg/ml），培养终止后加

13、DMSO 200 l，充分混匀后静置。选择波长为570 nm处测OD570值。计算刺激指数（SI），结果以3孔的均值表示。    刺激指数（SI）=实验孔OD均值/对照孔OD均值    CTL细胞体外杀伤活性的检测    效应细胞的制备  取培养第9天的AdSVVDC组细胞和NDC组细胞各5×105，作为刺激细胞，加入到24孔培养板中，按5×106/孔加入经T细胞尼龙毛柱分离的T淋巴细胞（反应细胞）；同时以不与DC共孵育的自体淋巴细胞为对照，每组设3个复孔。加入IL2（500 U/ml），于37、5% CO2的培养箱培养。以后隔天半量换液，并补充IL2，继续培养至第14天，作为效应细胞。    CTL的活性测定  以1×104孔加靶细胞（CA46）到96孔板中，再分别按51、101、201（效应细胞靶细胞）加效应细胞到各孔中，每组设3个复孔。同时设4个对照:靶细胞最大释放组、体积校正对照组、背景对照组和自然释放组。按Cytotox96 NonRadioactive Cytotoxicity Assay试剂盒说明书检测CTL反应，以对靶细胞的杀伤率表示CTL活性。    细胞杀伤率(%