病原细菌的分离培养

1、病原细菌的分离培养【实训目标】学会划线分离培养的基本要领和方法，了解厌氧菌培养的原理及其方法，熟悉细菌的分离培养技术。【主要仪器设备与场地】设备材料：普通琼脂平板、斜面、麦康凯平板、接种环、酒精灯、记号笔、培养箱。场地：传染病实验室【训练内容与步骤】（1）需氧菌的分离培养方法 分离培养  其目的是将被检查的材料作适当的稀释，以便能得到单个菌落。有利于菌落性状的观察和对可疑菌作出初步鉴定。其操作方法如下：右手持接种棒，使用前须酒精灯火焰灭菌，灭菌时先将接种环直立火焰中待烧红后，再横向持棒烧金属柄部分，通过火焰 34 次；用接种环无菌取样或取斜面培养物或取液体材料和肉汤培养物一接种环；接

2、种培养平板时以左手掌托平皿，拇指、食指及中指将平皿盖揭开成 30º左右的角度（角度越小越好，以免空气中的细菌进入平皿中将培养基污染）；将所取材料涂布于平板培养基边缘，然后将多余的细菌在火焰上烧灼，待接种环冷却后再与所涂细菌轻轻接触开始划线，其方法如图10-1所示；划线时应防止划破培养基，以 45º为宜，在划线时不要重叠，以免形成菌苔。 图1-1细菌的划线分离方法纯培养菌的获得与移植法  将划线分离培养3724hr的平板从培养箱取出，挑取单个菌落，经染色镜检，证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于斜面中培养，所得到的培养物，即为纯培养物，再作其他各项系列化试

3、验和致病性试验等。具体操作方法如下： 两试管斜面移植时，左手斜持菌种管和被接种琼脂斜面管，使管口互相并齐，管底部放在拇指和食指之间，松动两管棉塞，以便接种时容易拔出。右手持接种棒，在火焰上灭菌后，用右手小指和无名指并齐同时拔出两管棉塞，将管口进行火焰灭菌，使其靠近火焰，将接种环伸入菌种管内，先在无菌生长的琼脂上接触使冷却，再挑取少许细菌后拉出接种环立即伸人另一管斜面培养基上，勿碰及斜面和管壁，直达斜面底部，从斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶端为止，管口通过火焰灭菌，将棉塞塞好(图10-2)。接种完毕，接种环通过火焰灭菌后放下接种棒，最后在斜面管壁上注明菌名、日期，置 37温箱中培养。图 1-2

4、细菌斜面移植从平板培养基上选取可疑菌落移植到琼脂斜面上作纯培养时，则用右手执接种棒，将接种环火焰灭菌。左手打开平皿盖，挑取可疑菌落，然后左手盖上平皿盖后立即取斜面管，按上述方法进行接种，培养。 肉汤增菌培养  为了提高由病料中分离培养细菌的机会，在用平板培养基做分离培养的同时，多用普通肉汤做增菌培养，病料中即使细菌很少，这样做也多能检查出。另外用肉汤培养细菌，以观察其在液体培养基上的生长表现，也是鉴别细菌的依据之一。其操作方法与斜面纯培养相同；无菌取病料少许接种增菌培养基或普通肉汤管内于37下培养24hr。 穿刺接种 半固体培养基用穿刺法接种，方法基本上与纯培养接种相同，不同的是用接

5、种针挑取菌落，垂直刺入培养基内。要从培养基表面的中部一直刺入管底然后按原方向垂直退出，若进行H2S产生试验时，将接种针沿管壁穿刺向下即使产生少量H2S，从培养基中也易识别。 （2）厌氧菌的分离培养方法焦性没食子酸法  利用焦性没食子酸在碱性溶液内能大量吸氧的原理进行厌氧培养。每100cm3 空间用焦性没食子酸 1g， 10氢氧化钠或氢氧化钾溶液 10ML。其具体方法主要有以下几种： 单个平皿法:按常规在血琼脂平板上划线接种。将固体石蜡置于一容器中加热融化。取方形玻板一块, 中央置纱布或重叠滤纸一小块, 上面放焦性没食子酸 0.5g ，加10 氢氧化钠溶液 0.5ML 后迅速将平皿底倒

6、置于其上，周围立即用融化石蜡封闭。置 37 温箱培养 23d ，取出观察。 试管培养法:取约 100cm3 容积的大试管一支，在管底放焦性没食子酸 10g 及玻璃珠数个。将已接种的培养管放入大试管中，加入 20氢氧化钠溶液 1m1 ，立即将管口用橡皮塞塞紧，必要时周围封以石蜡，37培养23d观察之。 干燥器（玻罐）法:计算好容器的体积，根据其体积称取焦性没食子酸（置于平皿内）和配制氢氧化钠溶液。将氢氧化钠溶液倒入干燥器底部，把盛有焦性没食子酸的平皿轻轻漂浮于液面上。放好隔板，将接种好的平板或试管置于隔板上，把干燥器盖盖上密封（可预先在罐口抹一薄层凡士林）。轻轻摇动干燥器，使焦性没食子酸和氢氧化

7、钠溶液混合，置 37温箱培养23d，取出观察。 肝块（疱肉）肉汤  肝块（或肉渣）内含有谷胱甘肽，可发生氧化还原反应，降低环境中的氧化势能；同时还含有不饱和脂肪酸，能吸收环境中的氧，又因液面上加有液体石蜡隔绝外界空气从而造成一个适合于一般厌氧菌生长的局部环境。试验前先将培养基煮沸 10min ，速放冷水中冷却，以排除其中空气，接种时将试管倾斜，使液面露出间隙即可取样接种，完毕将试管直立置温箱中培养，移植时可用 1ML 吸管取 0.5ML 培养物至另一管，或用接种环取多量培养物于另一管。 共栖培养法 将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平板内，利用需氧菌生长将氧气消耗后，厌氧菌才能生长。其方

8、法是将培养平板的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌（如枯草芽胞杆菌），另一半接种厌氧菌，接种好后将平板倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置 37温箱中培养 23d 后，即可观察到需氧菌和厌氧菌生长。 高层琼脂法（摇振培养法） 加热融化试管高层琼脂，冷至 45左右接种厌氧菌，轻轻摇振混匀后立刻置冷水中使其直立凝固。置温箱中培养，厌氧菌在近管底处生长。（3）细菌在培养基上的生长特性观察固体培养基上的生长特性 细菌在固体培养基上生长繁殖，可形成菌落。观察菌落时，主要看以下内容：大小:不同细菌，其菌落大小变化很大。常用其直径来表示，单位是mm或 um。小菌落如针尖大小，必要时需用放大镜或低倍镜观察，大菌落

9、直径可达56mm，甚至更大。形状:主要有圆形、露滴状、乳头状或油煎蛋状、云雾状、放射状或蛛网状、同心圆状、扣状、扁平和针尖状等。边缘特征:有整齐、波浪状、锯齿状、卷发状等。表面性状:有光滑、粗糙、皱褶、颗粒状、同心圆状、放射状等，如图1-3所示。湿润度:有干燥和湿润两种。隆起度:有隆起、轻度隆起、中央隆起、云雾状等。色泽及透明度:色泽有白、乳白、黄、橙、红及无色等；透明度有透明、半透明、不透明等。质地:有坚硬、柔软和黏稠等。溶血性:分为-溶血、-溶血及-溶血(即不出现溶血环)三种；而按溶血环直径的大小又可分为强溶血性和弱溶血性两类。液体培养基上的生长特性浑浊度:有强度浑浊、轻微浑浊、透明三种情

10、况。底层情况:包括有沉淀和无沉淀两种，有沉淀又可分为颗粒状和絮状两种。表面性状:分为形成菌膜、菌环和无变化三种情况。产生气体和气味:很多细菌在生长繁殖的过程中能分解一些有机物产生气体，可通过观察是否产生气泡或收集产生的气体来判断；另一些细菌在发酵有机物时能产生特殊气味，如鱼腥味、醇香味等。色泽:细菌在生长繁殖的过程中能使培养基变色，如绿色、红色、黑色等。半固体培养基上的生长特性 有运动性的细菌会沿穿刺线向周围扩散生长，形成倒松树状(炭疽杆菌)、试管刷状(猪丹毒杆菌)；无运动性的细菌则只沿穿刺线呈线状生长。图1-3菌落的形状、边缘和表面构造1.圆形，边缘整齐，表面光滑 2.圆形，边缘整齐，表面有同心圆 3.圆形，叶状边缘，表面有放射状皱褶4.圆形，锯齿状边缘，表面不光滑 5.不规则形，波浪状边缘，表面有不规则皱纹6.圆形，边缘残缺不全，表面呈颗粒状7.毛状8.根状【注意事项】（1）细菌的分离培养必须严格无菌操作。（2）灭菌接种环或接种针在挑取菌落之前应先在培养基上