甘草次酸对中药活性成分与血清蛋白结合的影响甘草次酸对中药活性

1、甘草次酸对中药活性成分与血清蛋白结合的影响甘草次酸对中药活性         【摘要】 目的研究甘草次酸(GA)对中药活性成分与牛血清白蛋白(BSA)结合的影响。方法利用多种光谱技术和毛细管电泳前沿分析方法测定，用Stern-Volmer方程和Scatchard plot等对数据进行处理。结果得到甘草次酸与BSA的结合常数、位点数等结合特征，中药活性成分与BSA结合        【摘要】  目的研究甘草次酸(GA)对中药活性

2、成分与牛血清白蛋白(BSA)结合的影响。方法利用多种光谱技术和毛细管电泳前沿分析方法测定，用Stern-Volmer方程和Scatchard plot等对数据进行处理。结果得到甘草次酸与BSA的结合常数、位点数等结合特征，中药活性成分与BSA结合的常数和甘草次酸对这些成分结合常数的影响。结论甘草次酸与牛血清蛋白有高、低两类结合位点，总的结合位点数为8，蛋白与GA浓度之比为0.38时，结合率已高达95。GA使中药活性成分与牛血清蛋白的结合常数下降最大达67%，可能对它们的药理作用产生影响。 【关键词】  中药活性成分； 牛血清白蛋白； 甘草次酸； 药物-药物相互作用Abstract：O

3、bjectiveTo evaluate the influence of glycyrrhetinic acid (GA) on the binding of active ingredients of Chinese herbs with serum albumin. MethodsSpectroscopic method and capillary electrophoresis frontal analysis were utilized to determine the binding data. Stern-Volmer equation and Scatchard plot wer

4、e used to process the data. ResultsBinding constant and sites etc of GA with BSA were got. Binding constants of active ingredients of Chinese herbs and influence of GA on the binding of them were aslo obtained. ConclusionThere are two kinds of binding sites (high and low) in BSA while binding with G

5、A and the total binding sites are eight. The binding percentages of GA are up to 95% when the ratio of BSA to GA is 0.38. In the presence of GA, binding constants of active ingredients of Chinese herbs decrease up to 67%, which may exert an influence on their  pharmacological actionKey words：Ac

6、tive ingredients of Chinese herbs;   Bovine serum albumin;   Glycyrrhetinic acid;   Drug-drug interaction    近年来，中药活性成分与血清白蛋白结合的研究已经出现热潮，如，桑色素1, 岩白菜素2, 芒果苷3, 大黄素4等。然而绝大多数研究以获得活性成分的结合特征为目的，只有极少数研究探讨中药活性成分相互之间对结合的影响。如中国药科大学李萍研究小组最近对中药汤剂的整体成分与血清白蛋白的结合进行了研究，发

7、现当归补血汤成分间对各自与BSA的结合有显著影响5，在金银花整体活性物质与牛血清白蛋白相互作用中，绿原酸等3种成分在整体成分与BSA结合时比单个成分与BSA结合程度低，而咖啡酸、芦丁则相反6。可见，中药活性成分与蛋白结合时相互之间确实存在协同效应。甘草是最常用的中药之一，也是常用食品添加剂；甘草中甘草酸含量较大（3%10%）79，是甘草中最具特色的活性成分之一；甘草酸在体内代谢后以甘草次酸的形式吸收进入血液。因此，本文研究了甘草次酸对中药活性成分与血清蛋白结合的影响，尝试从成分之间血浆蛋白结合的协同效应（药物-药物相互作用）探讨甘草的配伍规律，同时对甘草及相关药物的安全、合理用药提供参考。1&

8、#160; 仪器与材料1.1  仪器F-4500型分子荧光分光光度计（Japan，Hitachi）；Tu-1800SPC型紫外-可见光分光光度计(北京普析公司)；1cm石英比色皿；微量注射器；微型旋涡混合器，精密天平（Germany,Sartorius），pHS-3酸度计。J-810圆二色分光光度计（Japan，Jasco）；彩陆毛细管电泳系统（北京，中科院化学所），配紫外检测器和HW-001色谱工作站（中国，千谱软件有限公司）；未涂层石英毛细管，52 cm ×50 m i.d.，有效长度为44  cm（中国河北永年光学纤维公司）；超滤管，截留分子量15 000（

9、PALL FILTER CO., LTD, USA）；TGL16型高速台式离心机（湘仪）。1.2  试剂牛血清白蛋白（Roche），以水配成2.0×10-5  mol/L的储备溶液，4 保存备用；18甘草次酸（GA，97%,Fluka, product of Spain）；槲皮素、金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、山萘酚、大黄酸、大黄素对照品，购自中国药品与生物制品检定所（中国北京）；甲基莲心碱（由中南大学湘雅医院药剂科刘韶惠赠，HPLC纯度大于98）；中药活性成分均以90%甲醇配成2.5×10-3 mol/L的溶液；pH 7.40的Tris-HCl缓冲溶液；Tr

10、is（淮安和元化工有限公司），氯化钠二水磷酸二氢钠（河南焦作），盐酸（湖南师范大学化学试剂厂）。除已标明者外，试剂均为分析纯；水为双重蒸馏水。2  方法2.1  光谱实验方法2.1.1  荧光猝灭方法在10 ml 容量瓶中依次加入2 ml 0.50 mol/L NaCl 溶液、2 ml pH 7.40 的Tris-HCl 缓冲溶液、2 ml BSA储备溶液，以水定容为10 ml, 摇匀, 在一定温度下静置30 min。取该溶液1 ml于石英比色皿中，依次加入一定体积的中药活性成分溶液（加入总量0.03 ml)，旋涡混匀。经指定温度下恒温放置3 min后，在280

11、nm的激发波长下，扫描290420 nm荧光光谱。在相同条件下，测其紫外光谱。甘草次酸对中药活性成分的影响是在蛋白中先加入GA，然后按照上述方法进行。在实验条件下活性成分在290450 nm范围内吸收很小，荧光内滤作用可以忽略，故直接对数据进行处理，结果为3次平行实验的平均值。2.1.2  圆二色（CD）谱方法光源系统用氮气保护(流量为5 L/min)，样品池的光径为0.1 cm。测量参数：扫描速率100 nm/min。分辨率0.1 nm，响应时间1 s，累积次数3次，扫描波段为190250 nm，BSA浓度为2×10-6 mol/L，实验时向BSA中分别加入不同量的甘草次

12、酸，混合均匀后测量，得到其CD谱。2.2  毛细管电泳前沿分析（CE-FA）方法CE运行缓冲是pH 7.40，67 mmol/L的磷酸钠，由适量的二水磷酸二氢钠溶解于水，然后在pH计上用2 mmol/L NaOH调节到指定的酸度，再经过0.45 m滤膜过滤。BSA储备液（200 mmol/L）是通过溶解适量的BSA粉末于运行缓冲中得到，并于4度冰箱保存。工作蛋白由储备液用运行缓冲稀释而得。药物储备液（2  mmol/L）由运行缓冲配制，内含30（V/V）以下甲醇。药物工作液由其储备液通过运行缓冲稀释而得，其中甲醇含量小于3（V/V）。药物的标准溶液也用于配制其校准曲线，游离

13、浓度由校准曲线求得。所有测试溶液在应用前进行脱气。    一系列BSA溶液中（20，30，35，40，45，50，55，60 mol/L） ，加入等量的GA至 160 mol/L，再加入缓冲至1 ml，涡旋混合30 s。然后在36水浴加热孵化2 h，再于室温下平衡2 h。若要进行超滤，则于室温平衡后进行，即取适量平衡液于超滤管，然后16 000 r/min下进行分离，滤液由CE进行测定。试样重复两份，结果取平均值，毛细管电泳在室温下进行。    新毛细管要做预处理，以1 mol/L HCl 冲洗30 min，水冲洗5 min，1 mo

14、l/L NaOH冲洗30 min，然后水冲洗5 min，磷酸盐缓冲冲洗15 min。为了获得较好的峰形和迁移时间的重现性，毛细管在每天实验开始按照下列程序进行冲洗和平衡：水冲洗2 min，1 mol/L氢氧化钠冲洗2 min，水冲洗2 min，缓冲冲洗5 min。    在每次测量之间，毛细管以水冲洗2 min，1 mol/L氢氧化钠冲洗2 min，水冲洗2    min，再以缓冲冲洗2 min。在这样的条件下，可以保证消除蛋白的吸附。平衡后的BSA-GA液或超滤液重力进样60 s（毛细管进出口高度差为30 cm）。运行电压为19 k

15、V，常规极性运行，典型电流为85 mA，紫外检测波长为254 nm。3  结果 3.1  甘草次酸与BSA作用的研究3.1.1  甘草次酸对BSA 的荧光猝灭光谱甘草次酸在与BSA 作用的过程中能显著地猝灭BSA 的荧光，这种猝灭在GA加入便可迅速观察到，这提示10BSA的一个高亲和结合位点位于色氨酸残基的附近。测得297 K甘草次酸对BSA的荧光猝灭光谱见图1。在此过程中，GA/BSA=3时，最大发射峰由341 nm变为最终的337 nm，略有蓝移，显示色氨酸残基所处环境的疏水性增加。并最终移至334 nm，在研究范围内荧光强度下降87.6，说明GA和BSA发生

16、了结合作用，并使BSA的构象发生了变化。此外，可以观察到色氨酸荧光下降幅度比酪氨酸大。见图1。3.1.2  荧光猝灭作用的Stern-Volmer分析见图2。图2是根据Stern-Volmer 猝灭方程（方程1）作图，式中，F为有猝灭剂时BSA 的荧光强度, F0为无猝灭剂时BSA 的荧光强度, Q为猝灭剂浓度，KSV 为动态猝灭常数，Kq 为动态荧光猝灭速率常数, 各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大动态荧光猝灭速率常数约为2.0×1010  L·mol-1·s-11；0 为无猝灭剂时荧光分子的平均寿命。从图2可见，在pH 7.40时，猝灭呈现两

17、种不同的模式，这表明，GA与BSA的有两类不同的结合位点。由斜率求的前半段（GA/ BSA3），得在297K，Kq=2.47×1013 L·mol-1·s-1, R=0.999 1；在292 K, Kq=2.26×1013  L·mol-1·s-1, R=0.997 5；在287 K, Kq=2.11×1013 L·mol-1·s-1, R=0.998 8。而GA与BSA浓度比大于3之后也有较好的线性，297 K时Kq为2.74×1012 L·mol-1·s-1。很

18、显然，由于由于各类猝灭剂对生物大分子最大扩散控制的碰撞猝灭常数为2.0×1010  L·mol-1·s-1，而由GA引起的BSA的猝灭速率常数远远大于此值，由此可见，GA对BSA的两类猝灭不是动态而是静态猝灭。    F0/F1KSVQ1Kq0Q 3.1.3  结合常数假定小分子在生物大分子上有n个相同且独立的结合位点，则小分子与生物大分子的结合平衡可以由方程11 表示。    lg(F0-F)/F) =lgK+nlgQ    这里，K表示某类结合位点的结

19、合常数；n表示一个BSA中某类结合位点能够结合的小分子数目，即结合位点数；Q表示游离小分子浓度，在研究中通常以其总浓度代替。根据方程，以低浓度的GA（GA/BSA3）进行试验，求得GA的结合常数和结合位点数分别为：在297 K， K =8.28× 105 L·mol-1， n =1.12 (R=0.998 5) ；292 K ，K =1.60× 105 L·mol-1 n =1.04 (R=0.996 0)；在287 K， K =1.60× 105 L·mol-1, n=0.986 (R=0.998 1) 。       &