由一株放线菌产生的对谷胱苷肽转移酶具有抑制作用的活性化合物的

1、由一株放线菌产生的对谷胱苷肽转移酶具有抑制作用的活性化合物的 【摘要】 谷胱苷肽-S-转移酶-(GST-)的活性在某些类型的癌症患者中有显著的升高并且在癌症细胞对抗癌药物耐药性的形成过程中起着重要的作用。抑制过量表达的GST-的酶活性将有助于克服肿瘤细胞的耐药性，因此，GST-被认为是一个潜在的药物作用靶点。利用我所建立【摘要】 谷胱苷肽-S-转移酶-(GST-)的活性在某些类型的癌症患者中有显著的升高并且在癌症细胞对抗癌药物耐药性的形成过程中起着重要的作用。抑制过量表达的GST-的酶活性将有助于克服肿瘤细胞的耐药性，因此，GST-被认为是一个潜在的药物作用靶点。利用我所建立的GST-抑制剂高

2、通量筛选模型，在筛选针对GST-的新的抗癌药物增敏剂的过程中，发现由一株放线菌550产生的发酵代谢产物对来源于人的GST-产生明显的抑制活性。经有机溶媒萃取、葡聚糖凝胶LH-20柱层析、HPLC制备等方法，从该菌的发酵液中分离到了一个对GST-有中等程度抑制活性的化合物550-a，其IC50为21.4g/ml，经各种理化性质及NMR分析确定该化合物与木黄酮(genistein)同质，该化合物对GST-的酶抑制活性以前尚未见报道。 【关键词】 谷胱苷肽转移酶； 酶抑制剂； 木黄酮 ABSTRACT Glutathione S-transferase- (GST-) level usually i

3、ncreased apparently in sufferring from certain kinds of cancers, and it played an important role in the process of drug resistant tumor cells against anti-tumor agents. Inhibition of the overexpressed enzyme activity will contribute to overcome the resistance. Therefore, GST- has been considered as

4、a potential drug target for the cancer treatment. By using the GST- high throughput screening system model which was developed in our laboratory, an actinomycete strain No.550 has shown inhibitory activity to GST-. A compound named No.550-A was isolated from the mycelium, and by solvent extraction b

5、y Sephadex LH-20 column chromatography, and HPLC purification, the compound showed moderate activity against GST- with the IC50 of 21.4g/ml, by physico-chemical spectral analysis, the structure of the compound was identical with genistein, of which having inhibitory activity against GST- was firstly

6、 reported. KEY WORDS GST; Enzyme inhibitor; Genistein 谷胱苷肽-S-转移酶(glutathione S-transferase，简称GST)为细胞内存在的具有解毒作用的酶蛋白1，广泛分布于动、植物内。GST作为一种具有多种生理功能的药物代谢酶参与机体的解毒作用，可解除化学诱变剂、促癌剂等的毒性。GST催化还原型谷胱苷肽(glutathione，简称GSH)与亲电子药物(X)共价结合成GS-X复合物，再转运出体外而发挥解毒作用。 谷胱苷肽转移酶具有多个亚型2，其中GST-是最重要的一种。研究表明，GST-的酶活性在多种类型肿瘤的患者体内有异常

7、的升高，其水平与肿瘤的耐药性密切相关35，高活性的GST-可使肿瘤细胞对某些化疗药物的耐药性升高，导致化疗失败2。探讨GST在肿瘤耐药机制中的作用并以GST-为靶点寻找特异性的抑制剂，对提高临床化疗的敏感性、克服肿瘤的耐药性将产生重要的意义6。 GST-的酶活性在多种肿瘤患者体内有明显增高，其水平与肿瘤的耐药性密切相关，两者具有明显的功能关系。我们以GST-为靶点，建立了一个GST抑制剂的高通量筛选模型，应用此模型对从微生物来源的4800个代谢产物进行了筛选，在筛选过程中发现由一株放线菌550产生的发酵产物对来源于人的GST-产生明显的抑制活性，本文报道对放线菌550所产生的活性物质的研究结果

8、。 1 材料与方法 1.1 材料 (1)主要试剂 人源(human placenta)谷胱苷肽-S-转移酶-、底物1-氯-2，4-二硝基苯(1-chloro-2，4-dinitrobenzene，简称CDNB)和还原型谷胱苷肽(GSH)均购自Sigma公司；其余化学试剂均为分析纯或色谱纯试剂。 (2)主要仪器设备 Victor21420多功能测定仪(美国PE公司)，低温离心浓缩仪(德国Christ公司)。 (3)菌株550的来源 放线菌550来源我国云南省。 1.2 方法 样品对GST酶抑制率的计算公式为： 抑制率(%)=(A2-A1)对照孔-(A2-A1)样品孔/(A2-A1)对照孔-(A2

9、-A1)空白孔100% 取抑制率大于50%的样品为阳性样品。 (2)菌株550的培养 于500ml的三角瓶中装入100ml种子培养基(含2.4%淀粉；0.1%葡萄糖；0.3%蛋白胨；0.3%牛肉膏；0.5%酵母粉；0.4% CaCO3，pH7.0)。接种后于28培养3d，按10%的接种量将一级种子接种于装有100ml发酵培养基(含4.0%可溶性淀粉；2.0%脱脂大豆粉；0.05% FeSO47H2O；0.05% K2HPO4；0.03% KCl，pH6.5)的三角瓶中，于28振摇培养14d。 从培养d5开始从发酵培养瓶中取出5ml样品进行经时变化考察，共培养384h(16d)，每天取样后加入两

10、倍体积乙酸乙酯浸泡4h，3000r/min离心15min，取上清液浓缩至干，稀释成一定体积，测定对GST抑制活性。 2 结果 2.1 菌株550发酵过程中产物活性的变化 菌株550发酵过程中产物活性的变化情况见Fig.1。菌株550的跟踪培养，从d5开始每天取样，测定发酵过程中培养液对GST的抑制率，并用HPLC检测活性化合物的产生量，发现在d14活性化合物产生量大，且活性达到高值，之后，活性未见明显增加，故选择发酵液活性最强的培养时间14d为发酵周期。 2.2 菌株550发酵液的提取 550发酵液3400ml，经3000r/min离心15min，分别收集菌体与上清液，菌体用3000ml丙酮提取后，蒸去丙酮，用3000ml乙酸乙酯抽提二次，乙酸乙酯层加无水Na2SO