酶学分析技术

1、n本章内容概要：本章内容概要：第一节第一节 酶活性测定的基本知识酶活性测定的基本知识 第二节第二节 酶活性测定方法及酶学分析的类型酶活性测定方法及酶学分析的类型第三节第三节 同工酶测定同工酶测定第四节第四节 酶学分析在临床诊断上的应用酶学分析在临床诊断上的应用第五节第五节 酶活性测定最适条件的选择酶活性测定最适条件的选择1 1、掌握掌握酶活性的国际单位定义，酶活性浓度的表示方法及酶活性单位酶活性的国际单位定义，酶活性浓度的表示方法及酶活性单位的计算公式；酶活性测定的连续监测法和定时法的概念、区别和结果的计算公式；酶活性测定的连续监测法和定时法的概念、区别和结果的计算方法；酶偶联反应的在酶活性测

2、定和酶法分析代谢物中的应用；的计算方法；酶偶联反应的在酶活性测定和酶法分析代谢物中的应用；以以NADNAD（P P）H H为指示系统和色素原底物在酶活性测定中的应用为指示系统和色素原底物在酶活性测定中的应用. .n本章教学要求：本章教学要求：2 2、熟悉熟悉酶促反应进程；酶促反应底物动力学；酶学分析在临床诊断上酶促反应进程；酶促反应底物动力学；酶学分析在临床诊断上的应用。的应用。3 3、了解了解KmKm值、值、VmaxVmax值的应用及值的应用及KmKm和和VmaxVmax的测定；同工酶测定和酶活性的测定；同工酶测定和酶活性测定最适条件的选择。测定最适条件的选择。第一节第一节 酶活性测定的基本

3、知识酶活性测定的基本知识 n酶活性的概念酶活性的概念 n酶活性单位酶活性单位 n酶活性单位的计算酶活性单位的计算 n酶促反应进程酶促反应进程 n酶促反应底物动力学酶促反应底物动力学 一、酶活性的概念一、酶活性的概念 酶活性酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单位时即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。间内底物的减少量或产物的生成量。 底物浓度为底物浓度为S S, ,产物浓度为产物浓度为P P, ,时间为时间为t t，反应速度为，反应速度为v vv =-dS/dt 或或 v =dP/dt。注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的注：在实际测定酶促反应速度

4、时，以测定单位时间内产物的生成量为好。生成量为好。 二、酶活性单位二、酶活性单位n定义：定义：指在一定条件下使酶促反应达到某一速度指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标准。准。惯用单位惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。酶活性测定方法的建立者所规定的单位。国际单位国际单位 ：1IU指在规定条件（最适指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下，最适底物浓度）下，每分钟转化每分钟转化1 mol底物的酶量。单位为底物的酶量。单位为IU/L 。Katal单位单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化指在规定

5、条件下，每秒钟转化1mol底物的底物的酶量，酶量，1Katal=60106IU。三、酶活性单位的计算三、酶活性单位的计算n步骤：步骤：运用公式进行计算。运用公式进行计算。明确测定方法的明确测定方法的酶单位定义酶单位定义，按照酶单位，按照酶单位定义确定物质量、体积和时间的单位，定义确定物质量、体积和时间的单位，n计算公式计算公式: 产物的增加量产物的增加量 每单位规定的保温时间每单位规定的保温时间 10001000（mlml）酶单位酶单位/ /升升 = = 每单位规定的产物增加量每单位规定的产物增加量 实际保温时间实际保温时间 实际标本用量（实际标本用量（mlml）分光光度法测定的公式：分光光度

6、法测定的公式： （A A测定测定 A A对照）对照）VV总总10106 6 每单位规定的保温时每单位规定的保温时间间酶单位酶单位/ /升升 = = LVLV标标 实际保温时间实际保温时间四、酶促反应进程四、酶促反应进程n 酶促反应进程曲线酶促反应进程曲线 n酶量的测定：酶量的测定： 通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准确测定酶量，应使酶浓度（确测定酶量，应使酶浓度（E E）与酶促反应速度）与酶促反应速度成正比，即成正比，即E E-d-dS S/dt/dt或或E EddP P/dt/dt。能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速能够真正代表酶活

7、性大小的是线性期的酶促反应速度，即酶促反应初速度。度，即酶促反应初速度。 酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反应速度才能准确代表酶活性。应速度才能准确代表酶活性。酶的含量酶的含量 酶活性酶活性酶促反应初速度酶促反应初速度五、酶促反应底物动力学五、酶促反应底物动力学n中间产物学说：中间产物学说： 酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催化底物反应生成产物。化底物反应生成产物。E + S ES E + P n米米- -曼氏方程：曼氏方程： VmaxSv = S+ Km 上式中上式中v v

8、代表反应速度，代表反应速度，VmaxVmax代表最大反应速度，代表最大反应速度，S S代表底物浓度，代表底物浓度，KmKm称为米氏常数。称为米氏常数。（一）米氏常数的定义（一）米氏常数的定义由米由米- -曼氏方程可以导出：曼氏方程可以导出： （Vmax-v）SKm = v 当当v = 1/2Vmaxv = 1/2Vmax时，时，Km =Km =S S。因此。因此KmKm值为反应速度相当于值为反应速度相当于最大反应速度一半时的底物浓度。最大反应速度一半时的底物浓度。KmKm值是酶的特征常数值是酶的特征常数，具有重，具有重要的应用价值。要的应用价值。（二）（二）Km值的应用值的应用1.鉴定酶的种类

9、鉴定酶的种类 Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种不同种类的酶其类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可在规定的值不同，对于一种未知的酶，可在规定的条件下测定其条件下测定其Km值加以鉴定。值加以鉴定。 表表7-1 7-1 某些酶的某些酶的KmKm值值 酶酶 底物底物 Km(mmol/L)乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 丙酮酸丙酮酸 0.017己糖激酶己糖激酶 D-葡萄糖葡萄糖 0.05 D-果糖果糖 1.5 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 D-乳糖乳糖 4.0碳酸酐酶碳酸酐酶

10、 H2CO3 9.0过氧化氢酶过氧化氢酶 H2O2 25蔗糖酶蔗糖酶 蔗糖蔗糖 28糜蛋白酶糜蛋白酶 甘氨酰酪氨酰甘氨酸甘氨酰酪氨酰甘氨酸 1082.2.反映酶与底物的亲合力反映酶与底物的亲合力 KmKm值越大，酶与底物亲合力越小，值越大，酶与底物亲合力越小，KmKm值越小，酶与底物亲合力越大。值越小，酶与底物亲合力越大。 3.3.选择酶的最适底物选择酶的最适底物 KmKm值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底物有不同的物有不同的KmKm值。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物，值。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物，使酶促反应容易进

11、行，并节省底物用量。使酶促反应容易进行，并节省底物用量。 4.4.计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速度的比率大反应速度的比率 根据米根据米- -曼氏方程可以计算曼氏方程可以计算 5.5.设计适宜的底物浓度设计适宜的底物浓度 酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶活性，一般要求初速度达到最大速度的活性，一般要求初速度达到最大速度的90%90%95%95%、底物、底物消耗率为消耗率为1%1%5%5%。这样既可以近似地表示酶活性，又不。这样既可以近似地表示酶活性，又不致于使底物浓度过高而造成浪费。

12、致于使底物浓度过高而造成浪费。 (三三)Vmax的应用的应用n定义定义 ： Vmax指指酶完全被底物分子饱和时的反应速度。酶完全被底物分子饱和时的反应速度。 n应用：应用： Vmax可用来计算酶的转化率（可用来计算酶的转化率（TN），即单位时间内每分子），即单位时间内每分子酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数/秒。当反秒。当反应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的转化率：转化率： TN =底物转化量（底物转化量（mol/s）/酶量（酶量（mol） (四四)Km和和Vmax的

13、测定的测定1Linweaver-Burk作图法作图法,又称为双倒数作图法又称为双倒数作图法 1 Km +S Km 1 1 = = + v VmaxS Vmax S Vmax2Cornish-Bowden作图法作图法 又称为直线线性作图法。又称为直线线性作图法。 第二节第二节 酶活性测定方法及酶学分析的类型酶活性测定方法及酶学分析的类型n酶活性的测定方法酶活性的测定方法n工具酶工具酶n酶偶联测定法酶偶联测定法n底物浓度测定底物浓度测定一、酶活性的测定方法一、酶活性的测定方法按照按照对酶对酶促反应时促反应时间的选择间的选择不同不同 连续监测法连续监测法 固定时间法固定时间法（一）固定时间法（一）固

14、定时间法n分类：分类： 终点法：在反应进行到预定时间后要终止反应。终点法：在反应进行到预定时间后要终止反应。 两点法：该方法反应时间的预定是从两点法：该方法反应时间的预定是从t t1 1t t2 2 。n定义：定义：测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量。或产物的增加量。 n特点：特点： 优点优点是简单是简单。 缺点缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。 n注意：注意：固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以30306060分分钟为宜。钟为宜。 （二

15、）连续监测法（二）连续监测法n原理：原理：n定义：定义：测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。 该方法每隔一定时间（该方法每隔一定时间（10s10s60s60s）测定一次底物或产）测定一次底物或产物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图，绘制反应速度曲线。，绘制反应速度曲线。 n特点：特点： 在方法设计上，选择紫外吸收法或色原显色法在方法设计上，选择紫外吸收法或色原显色法 缺点：缺点： 要求高，要求能够精确地控制温度、要求高，要求能够精确地控制温度、pHpH值和底物浓度等反值和底物浓度

16、等反应条件，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及自应条件，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及自动生化分析仪都能达到这些要求。动生化分析仪都能达到这些要求。优点优点: : 能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反应的线性期，能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反应的线性期，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。 二、工具酶二、工具酶n定义：定义：偶联：偶联：工具酶与待测酶、工具酶与工具酶之间的联合。工具酶与待测酶、工具酶与工具酶之间的联合。 工具酶：工具酶：将作为试剂用于测定待测酶活性或底物浓度的酶。将

17、作为试剂用于测定待测酶活性或底物浓度的酶。工具酶有工具酶有氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类n分类：分类：表表7-2 7-2 常用工具酶的名称及其缩写符号常用工具酶的名称及其缩写符号 名名 称称 缩写符号缩写符号 名名 称称 缩写符号缩写符号乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 LDH苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶 MDH6-磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶 G6PD谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶 GLDH葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 GOD胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶 COD磷酸甘油氧化酶磷酸甘油氧化酶 GPO过氧化物酶过氧化物酶 POD己糖激酶己糖激酶 HK肌酸激酶肌酸激酶 CK丙酮酸激酶丙酮酸

18、激酶 PK甘油激酶甘油激酶 GK脂蛋白脂肪酶脂蛋白脂肪酶 LPL胆固醇酯酶胆固醇酯酶 CE脲酶脲酶肌酐酶肌酐酶三、酶偶联测定法三、酶偶联测定法n应用应用：对于底物或产物不能直接测定或难于准确测：对于底物或产物不能直接测定或难于准确测定的酶促反应定的酶促反应 。 Ex Ea EiA B C P 式中式中A A为底物，为底物，B B、C C为中间产物，为中间产物，P P为产物（必须能够直接测为产物（必须能够直接测定），定），ExEx为待测酶，为待测酶，EaEa、EiEi都为工具酶。按照工具酶作用的不同，都为工具酶。按照工具酶作用的不同，EaEa又称为辅助酶，又称为辅助酶，EiEi又称为指示酶，又称

19、为指示酶，C PC P称为指示反应。称为指示反应。（一）酶偶联反应的原理（一）酶偶联反应的原理 在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期可以通过测定指示酶的可以通过测定指示酶的KmKm和和VmaxVmax等动力学因数加以计算确定。等动力学因数加以计算确定。（二）常用指示酶及其指示反应（二）常用指示酶及其指示反应1 1脱氢酶脱氢酶 用作工具酶的脱氢酶都是以用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱为辅酶的脱氢酶，例如氢酶，例

20、如LDH、MDH、G6PD、GLDH等，它们催等，它们催化下列反应：化下列反应： P + NAD(P)H + H+ PH2 + NAD(P)+可对可对NAD(P)HNAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定 n应用：应用：ALT、AST、CK等酶活性测定。等酶活性测定。2 2过氧化物酶过氧化物酶 PODPOD可可催化过氧化氢与某些色原反应，例如与催化过氧化氢与某些色原反应，例如与4-氨氨基安替比林（基安替比林（4-AAP）和酚反应，将其氧化为有色物）和酚反应，将其氧化为有色物质，反应如下：质，反应如下： POD 2H2O2 + 4-AAP + 酚酚 醌亚胺（

21、红色）醌亚胺（红色） + 4H2OTrinder反应反应： n应用应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与类）等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶偶联，通过联，通过Trinder反应加以测定。反应加以测定。四、底物浓度测定四、底物浓度测定 利用酶催化反应的高效率和专一性，可以测利用酶催化反应的高效率和专一性，可以测定底物浓度。与酶活性测定类似。定底物浓度。与酶活性测定类似。 第三节第三节 同工酶测定同工酶测定n同工酶的定义同工酶的定义n同工酶产生的机理同工酶产生的机理n同

22、工酶的测定方法同工酶的测定方法n同工酶的定义同工酶的定义 是催化功能相同，但是分子组成及理化性质不同是催化功能相同，但是分子组成及理化性质不同的一组酶，是在同一种属中由不同基因位点或等位的一组酶，是在同一种属中由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂多体。基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂多体。 一、同工酶产生的机理一、同工酶产生的机理（一）由不同基因位点编码（一）由不同基因位点编码（二）由等位基因编码（二）由等位基因编码（三）由多肽链化学修饰产生（三）由多肽链化学修饰产生二、同工酶的测定方法二、同工酶的测定方法（一）按照理化性质不同进行分离鉴定（一）按照理化性质不同进行分离鉴定1

23、1电泳法电泳法 同工酶氨基酸组成不同，等电点不同，电泳迁移率同工酶氨基酸组成不同，等电点不同，电泳迁移率也就不同，据此可用电泳法分离鉴定。也就不同，据此可用电泳法分离鉴定。 2 2层析法层析法 根据同工酶分子荷电量不同，可用离子交换层析法根据同工酶分子荷电量不同，可用离子交换层析法加以分离。加以分离。（二）按照底物专一性不同进行鉴定（二）按照底物专一性不同进行鉴定 同工酶同工酶底物专一性不同，底物专一性不同，Km值也不同。如果同工值也不同。如果同工酶之间的酶之间的Km值差别足够大，可以通过测定其值差别足够大，可以通过测定其Km值加值加以鉴定。以鉴定。 （三）按照（三）按照最适最适pH不同进行鉴

24、定不同进行鉴定 同工酶同工酶分子氨基酸组成不同，最适分子氨基酸组成不同，最适pH也不同。如也不同。如果同工酶最适果同工酶最适pH之间的差别足够大，可以通过调节缓之间的差别足够大，可以通过调节缓冲溶液的冲溶液的pH值加以鉴定。值加以鉴定。 （四）按照免疫学特性不同进行分离鉴定（四）按照免疫学特性不同进行分离鉴定（五）按照耐热程度不同进行鉴定（五）按照耐热程度不同进行鉴定（六）选择性抑制法（六）选择性抑制法第四节第四节 酶学分析在临床诊断上的应用酶学分析在临床诊断上的应用n血浆酶的来源血浆酶的来源n酶的区域化分布酶的区域化分布n酶活性测定在临床诊断中的应用酶活性测定在临床诊断中的应用n同工酶的诊断价值同工酶的诊断价值一、血浆酶的来源一、血浆酶的来源血浆酶血浆酶 血浆特异酶血浆特异酶 非血浆特异酶非血浆特异酶 外分泌酶外分泌酶 细胞内酶细胞内酶 二、酶的区域化分布二、酶的区域化分布表表7-3 7-3 诊断常用血清酶的来源诊断常用血清酶的来源血清酶血清酶 符号符号 来源来源