基质金属蛋白酶及其抑制剂在大鼠呼吸机相关性肺损伤的表达

1、基质金属蛋白酶及其抑制剂在大鼠呼吸机相关性肺损伤的表达张定宇 姚尚龙呼吸机相关性肺损伤(VILI)是机械通气严重并发症之一， VILI 与急性肺损伤(ALI)有着类似的肺脏形态学和病理生理学改变12，而基底膜损伤在ALI发生过程中发挥重要作用3,其中，基质金属蛋白酶(MMPs)及金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)失衡逐步受到重视4。关于呼吸机相关性肺损伤与MMPs/TIMPs变化的关系，还不十分清楚。本实验采用持续给予大鼠不同潮气量通气动物模型，观察基质金属蛋白酶-2、9(MMP-2、MMP-9)和金属蛋白酶组织抑制剂-1、2(TIMP-1、TIMP-2)在大鼠VILI模型肺组织中的表达，探讨

2、机械通气致肺损伤的可能机制。材料和方法一、动物准备健康雄性SD 大鼠30只, 同济医学院实验动物中心提供,体重200250 g。20乌拉坦(1ml100g) 腹腔内注射麻醉后,仰卧位固定,行气管切开及气管内插管术,接动物用通气机机械通气或保留自主呼吸,然后行颈总动脉、股静脉插管术,采动脉血进行血气分析, 微量注射泵以4 ml/ kg·h的速度持续静脉补液。 二、实验设计参照Ricard等的方法56，建立SD大鼠VILI模型。将30只大鼠随机分为3组,每组10只。A组（对照组）：保留自主呼吸;B组: 小潮气量组,VT = 7 ml/kg ,呼吸频率60/min , FiO2=0.21;

3、C组:大潮气量组, VT = 25 ml/kg , 呼吸频率50/min, FiO2=0.21;各组大鼠通气时间均为4h。三、标本的收集：实验结束后，各组大鼠，打开胸腔完整取出心肺，PBS缓冲液冲洗后，结扎右侧主支气管，取右上肺置于-80冻存,用于RT-PCR，余肺石蜡包埋,行HE染色。左肺组织称湿重后,用4 生理盐水行支气管肺泡灌洗,每次灌洗量为3 ml,并反复抽吸,共灌洗3 次,收集灌洗液并记录回收量, 支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fiuid，BALF）3000 r/min 离心10 min ,取上清液于-20 冻存待用;离心后沉淀用1 ml 生理盐水稀

4、释,分别行白细胞和中性粒细胞计数。左肺灌洗结束后,置于烤箱中60 干燥至恒重,称取干重。四、观察指标1. 测定各组大鼠通气前和实验结束时PaO2/FiO2值;用左肺湿干(W/D)值代表肺水肿的程度；计数BALF中白细胞和中性粒细胞；BALF中总蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法。2. 明胶酶谱法测定：参照Fisher等7方法,略加修改。测定BALF中MMPs活性，所显条带照相并用图象分析系统进行定量分析。3. 支气管肺组织MMP-2、MMP-9 及TIMP-1、TIMP-2 mRNA 表达。取50100 mg 右上肺,按Trizol 试剂盒(Gibicol公司) 说明提取总mRNA ;按逆转录试剂盒

5、说明进行逆转录; 引物由上海博亚公司合成,根据下列目的基因及扩增条件进作者单位:430022 武汉市,华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科 (张定宇为研究生，现工作于武汉市普爱医院)行目的基因扩增:(1) MMP-2引物，上游：5'-ACC ATC GCC CAT CAT CAA GT-3'，下游：5'-CGA GCA AAA GCA TCA TCC AC-3'，扩增片段348bp，94 、58 、72 各45s ,35个循环；(2)MMP-9引物，上游：5'-AGT TTG GTG TCG CGG AGC AC-3'，下游：5'-T

6、AC ATG AGC GCT TCC GGC AC-3'，扩增片段754bp ,94 、62.5 、72 分别45s、45s、60s ,35个循环；(3)TIMP-1引物，上游：5'-CCA CCT TAT ACC AGC GTT ATG-3'，下游：5'-GGC AAA GTG ATC GCT CTG-3'，扩增片段401bp，反应参数同MMP-2；(4)TIMP-2引物,上游: 5-TGC AGC TGC TCC CCG GTG CAC-3'，下游: 5'-TTA TGG GTC CTC GAT GTC GAG-3'，扩增片段

7、585bp，94 、60 、72 各60 s ,35个循环；(5)内参GAPDH，上游：5'-TAT GAT GAC ATC AAG AAG GTG G-3'，下游：5'-CAC CAC CCT GTT GCT GTA-3'，反应参数同MMP-2，扩增片段为213bp。取产物5进行琼脂糖凝胶电泳、照相,利用凝胶扫描仪测定条带的吸光度()值,以目的基因与内参基因条带的吸光度()值的比值代表其表达的相对量。4. 数据处理: 采用SPSS 10.0统计软件，计量数据以s表示，组间比较采用方差分析，P<0 .05为差异有显著性意义。结果1. 各组大鼠通气前PaO2

8、/FiO2值比较无显著差异( P > 0.05) ;通气4h后,C组大鼠的PaO2/FiO2值与A、B组比较显著下降（p<0.01）。C组大鼠W/D 值与A、B组比较显著升高( P < 0.01)。大潮气量通气后,C组大鼠BALF 中总蛋白含量较A、B组显著升高,BALF 中可见以中性粒细胞为主的大量白细胞的浸润，白细胞计数显著高于另外两组(表1)。2. BALF 中MMPs酶活性：MMPs酶活性见表1。从表1可见，实验结束时，A、B组72kD MMP-2和92kD MMP-9酶活性不高和增高不明显,C组72kD MMP-2和92kD MMP-9酶活性比另外两组显著增高(表1

9、)。3. 支气管肺组织MMP-2、MMP-9及TIMP-1、TIMP-2 mRNA表达：RT-PCR结果显示，C组MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平明显高于A、B组，C组TIMP-1、TIMP-2 mRNA表达水平有升高趋势，但各组间无显著差异(表2)。4. 大鼠肺组织病理改变:A组大鼠肺泡结构结构完整, 肺泡腔清晰, 肺泡隔无水肿、炎症等特殊改变; B组大鼠肺泡结构较为清晰,肺泡壁稍增厚,伴少量炎性细胞浸润；C组大鼠肺泡壁弥漫性渗出、水肿、充血、增厚, 肺泡壁和肺间质内可见较多白细胞的浸润以及肺泡结构的破坏。表1 急性肺损伤指标和明胶酶活性的变化A组 B组 C组(n=10) (n=10

10、) (n=10)PaO2/FiO20h 396±30 387±37 380±34 4h 337±28 342±35 230±26*W/D 值 4.6±0.3 4.7±0.4 6.9±0.8*BALF：总蛋白 0.84±0.35 1.03±0.18 3.83±0.34*(g/L) 白细胞计数 5.6±0.9 6.5 ±1.1 10.7 ±1.5*(×109/L) MMP-2活性 80.4±22.6 96.6±31.5

11、196.6±38.4*MMP-9活性 24.8±10.7 38.9±13.2 172.1±45.3*与A、B组比较 P < 0. 01 表2 支气管肺组织MMP-2、MMP-9 及TIMP-1、TIMP-2mRNA 表达组别 MMP-2mRNA MMP-9mRNA TIMP-1mRNA TIMP-2mRNAA组（n=10） 0.34±0.14 0.41±0.08 0.33±0.05 0.49±0.07B组（n=10） 0.41±0.11 0.46±0.19 0.37±0.12 0

12、.54±0.13C组（n=10） 1.13±0.06* 1.05±0.16* 0.41±0.06 0.48±0.12*与A、B组比较 P < 0.01 5.讨论本实验给大鼠25ml/kg机械通气4h后,大鼠出现明显的氧合障碍, PaO2/FiO2较小潮气量组显著下降, 肺W/D值、BALF总蛋白和中性粒细胞计数明显增加, 病理见弥漫性肺实质损伤,与文献报道的VILI 表现一致89。肺上皮和内皮细胞屏障渗透性增加是机械通气相关性肺损伤特征210，导致肺泡-毛细血管屏障严重受损、肺水肿和渗透性增加的机制尚不完全清楚。本研究表明明胶酶是大鼠VI

13、LI的重要介质, MMPs/TIMPs的失衡在其中发挥重要作用。基质金属蛋白酶(MMPs)是一个蛋白水解酶大家族，可降解很多种细胞外基质(ECM)。明胶酶-A (MMP-2)是一种广泛分布基质金属蛋白酶，在许多细胞均有表达，包括上皮细胞和内皮细胞。明胶酶-B (MMP-9)由多种炎性细胞产生，包括中性粒细胞（PMN）、肺泡巨噬细胞以及结缔组织细胞。基质金属蛋白酶通过降解基底膜的主要成分，使细胞周围基底膜发生变化，MMP-2和MMP-9在其中发挥重要作用10。在本实验，可见大潮气量通气大鼠BALF中MMP-2和MMP-9活性明显增加，同时发现到肺组织MMP-2和MMP-9mRNA表达明显增加。大

14、潮气量通气可使明胶酶表达和释放增加，原因很可能是对肺细胞的机械打击。越来越多的证据表明：周期性机械打击影响MMPs的释放和活化，并在细胞外基质重塑中发挥重要作用。周期性机械打击可导致（1）培养的软骨细胞和血管内皮细胞上调、释放和活化明胶酶B和明胶酶A1116，（2）MT1-MMP的表达导致心成纤维细胞明胶酶A的活化12，（3）在体外活化肺泡巨噬细胞及其明胶酶B释放13，而且周期性机械打击抑制气道上皮细胞的修复，阻止前列腺素的合成14、15。Foda等人在大潮气量通气大鼠肺血管内皮细胞、上皮细胞肺、间质单核细胞均发现MMPs（特别是MMP-2和MMP-9）表达上调10。金属蛋白酶组织抑制剂（TI

15、MPs）是MMPs的主要生理性抑制剂，通常情况下，组织中MMPs与TIMPs之间保持着相对平衡状态，它们的平衡和相互影响，决定着细胞基质是降解还是聚集8。在本实验中，RT-PCR结果显示，TIMP-1、TIMP-2 mRNA表达水平在大潮气量通气大鼠有升高趋势，但无显著性差异。说明TIMP-1、TIMP-2并没有随MMP-2、MMP-9上调、活化而表达明显增加，造成MMPs/TIMPs失衡,致MMPs活性增强; 推测过度增强的MMPs 活性, 加强了对ECM 的降解,可能造成基底膜严重受损,促进了炎症反应,导致了急性肺损伤的发生。 综上所述，大潮气量通气可致大鼠急性肺损伤，明胶酶是大鼠VILI

16、的重要介质, MMPs异常表达引起MMPs/TIMPs的失衡在其中发挥重要作用。参考文献：1、Ricard JD, Dreyfuss D, Saumon G. Ventilator-induced lung injury Eur Respir J 2003; 22: Suppl. 42, 1s8s2、Frank JA， Matthay MA. Science review: Mechanisms of ventilator-induced injury Critical Care 2003；7:233-2413、M. Corbel, E. Boichot and V. Lagente Role

17、 of gelatinases MMP-2 and MMP-9 in tissue remodeling following acute lung injury Brazilian Journal of Medical and Biological Research (2000) 33: 749-7544、Brew K, Dinakarpandian D, Nagase H. Tissue inhibitors of metalloproteinases: evolution, structure and function. Biochim Biophys Acta. 2000 Mar 7;1

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25、. 273:L1013L1019.16、Haseneen NA,. Vaday GG, Zucker S, et al. Mechanical stretch induces MMP-2 release and activation in lung endothelium: role of EMMPRIN Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2003; 284: 541 547.【摘要】目的探讨基质金属蛋白酶(MMPs) 及其组织抑制剂(TIMPs) 在大鼠机械通气致肺损伤发生中的作用。方法将30 只健康雄性SD 大鼠随机分为3 组,麻醉和气管切开及气管内插

26、管后,接受三种方式通气,A组（对照组）：保留自主呼吸;B组: 小潮气量组,VT=7ml/kg ,呼吸频率60/min;C组:大潮气量组, VT=25 ml/kg，呼吸频率50/min;大鼠通气时间均为4h。测定实验前后PaO2/FiO2值、支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞和中性粒细胞计数、总蛋白含量及左肺W/D 值,并行肺组织病理学检查,RT-PCR检测肺组织MMP-2 、MMP-9 、TIMP-1 和TIMP-2 mRNA的表达;酶谱法分析BALF中明胶酶的活性。结果通气4 h 后, C组大鼠的PaO2/FiO2值较其它组显著下降， C组大鼠BALF 中总蛋白含量、白细胞计数、W/D 值

27、显著高于另外两组，组织病理学显示C组大鼠肺脏内有更多的白细胞浸润和肺泡壁结构的破坏。C组大鼠BAL F中明胶酶的活性较A、B组明显增强，C组MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平明显高于A、B组，C组TIMP-1、TIMP-2 mRNA表达水平升高不明显。结论大潮气量通气可致大鼠急性肺损伤，明胶酶是大鼠VILI的重要介质, MMPs异常表达引起MMPs/TIMPs的失衡在其中发挥重要作用。【关键词】基质金属蛋白酶; 基质金属蛋白酶组织抑制剂; 机械通气; 肺损伤Expression of Matrix Metalloproteinases and Tissue Inhibitors of M

28、etalloproteinases in Ventilator-induced Lung Injury in Rat ModelsZHANG dingyu, YAO Shanglong. Department of Anesthesiology, Union Hospital, Tongji Medical College , Huazhong University of Science and Technology , Wuhan 430022, China【Abstract】Objective: To explore the role of matrix metalloproteinase

29、s (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases ( TIMPs) in ventilator-induced lung injury in rat models. Methods: 30 healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups. After anesthesia was administered and tracheotomy was performed, rats received three ventilation protoc

30、ols for 4 h: group A took the spontaneous breath as control groups; group B received small tidal volume ventilation (VT=7 ml/kg, R=60bpm); group C received large tidal volume ventilation (VT=25ml/kg, R=50bpm). Lung injury was quantified by measurements of PaO2/ FiO2, total white blood cells (WBCs) i

31、n bronchoalveolar lavage fluid (BALF), wet to dry left lung weight ratio (W/D), the concentrations of total protein in BALF and lung histopathology among three groups. The mRNA of MMP-2,MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2 in lungs was assessed by RT-PCR. Samples obtained from BALF were compared for the presence of gelatinases by gelatin zymography. Results: After 4 hrs ventilation