乙型肝炎病毒特异性核酶与丁型肝炎病毒重组体的体外转录及切割活

1、    乙型肝炎病毒特异性核酶与丁型肝炎病毒重组体 的体外转录及切割活性        摘要 目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)特异性核酶(简称rRZ)体外转录及切割HBV的活性。方法 将831 bp的HBV C基因片段克隆于T载体T7启动子下游，32P标记转录后作为靶RNA(32P-rHBV)。rRZ、rHDVRZA(插入有核酶结构的丁型肝炎病毒基因组重组体)和rHDVRZP(部分HDV基因组重组体)进行非标记的大量转录，转录产物经凝胶纯化后，与32P-rHBV按一

2、定比例和条件保温切割，电泳后放射自显影。结果 rRZ，rHDVRZP，rHDVRZA在37有活性，并随温度升高而提高，体外观察到重组体的切割活性，证明所设计的核酶结构是正确的。结论 将核酶基因插入到HDV基因组中，使其具有特异性切割HBV的活性，可实现核酶的保护性和靶向性运载，为下一步重组体的体内应用研究奠定了基础。关键词 核酶 乙型肝炎病毒 丁型肝炎病毒 转录Study of transcription and cleavage in vitro of HDV with HBV-specific hammerhead ribozymeWEN Shujuan,QI Xuezhong,ZHOU

3、Rong,et al.Genetic Centre,Nanfang Hospital,Guangzhou 510515Abstract Objective To study the effect of hepatitis B virus(HBV) specific ribozyme(RZ) and recombinant hepatitis D virus(HDV) inserting hammerhead ribozyme(rHDVRZP and rHDVRZA).Methods 831 bp HBV C gene fragment was cloned under the control

4、of T7 promoter,32P-labeld HBV transcript was incubated with gel-purified RZ,rHDVRZA,rHDVRZP at different temperature and autoradiographed after denaturing gel-electrophoresis.Result These results show that rRZ,rHDVRZA,rHDVRZP were active at 37 and more so at higher themperatures.Conclusion Recombina

5、nt Delt virus could serve as a vector for the delivery of a ribozyme specific for hepatitis B virus cleavage.Our data demonstrate the value of recombinant ribozyme as potential therapeutic agents for treatment of HBV infection.Further study about cleavage in vitro and in vivo will continue.Key words

6、 Ribozyme Hepatitis B virus Hepatitis D virus Transcription针对乙型肝炎病毒(HBV)复制过程中出现的RNA中间体而设计的核酶，是研究乙型肝炎基因治疗的热点1,2。将已构建成功的HBV特异性核酶(rRZ)插入有核酶结构的丁型肝炎病毒(HDV)基因组重组体(rHDVRZA)和部分HDV基因组重组体(rHDVRZP)，进行了体外转录、切割活性的研究，并于体外观察到重组体的切割活性，证明所设计的核酶结构是正确的。材料与方法1.质粒rRZ、rHDVRZA、rHDVRZP由本室构建。2.RiboMax transcription kit、丙烯酰胺

7、、双丙烯酰胺、过硫酸铵为Promega公司产品。a-32PATP购自北京亚辉公司；X光片为Kodak公司产品；Advan-tage-TM凝胶纯化试剂盒为Clontech公司产品；DEPC为Sigma公司产品；DNA polymerase I klenow为Biolabs公司产品；测序由ABI391自动测序仪完成。3.引物：HBV引物DT3: 5GAT AAG CTT TTA CAT AG AGG ACT CTT GG(1 6501670)3；DT4: 5CTG GAA TTC GGC GAG GGA GTT CTT CTT CTA G3(2 3942 375)；载体引物P31 5CAA AAG

8、 GGT CAG TGC TGC3由ABI310自动合成仪合成。4.靶基因片段的克隆及鉴定：以DT3，DT4引物从患有乙型肝炎的病人血清中扩增，DNA抽提方法及PCR反应条件参考文献3，PCR产物的纯化、连接及转化参考试剂盒说明和文献4；挑取白色菌落，提取质粒，用EcoRI酶切鉴定，P31/DT4 PCR扩增鉴定正向插入，以T7,SP6引物进行双向测序鉴定，阳性克隆简称为pTA-HBV。5.靶基因片段体外转录：质粒pTA-HBV用BamHI消化成线性后，以Klenow I补平5，参照试剂盒说明和文献1,2进行体外32P标记转录(同时设立rRZ、rHDVRZA、rHDVRZP对照)，转录完后加D

9、Nase I(1 U/ml)，37消化30分钟，抽提干燥后用RNase-Free H2O重悬。同时将质粒pTA-rRZ、rHDVRZP、rHDVRZA大量转录并纯化。6.切割反应：10 ml反应体系含0.05 mol/L Tris-HCl（pH8.0），0.02 mol/L MgCl2。取等体积核酶(重组核酶)和32P标记HBV转录物，分别于37，42，55保温1小时，加10 ml去离子甲酰胺和1 ml上样缓冲液，65 10分钟，7 mol/L尿素-5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影。结果1.靶基因的克隆及鉴定：将HBV C区基因片段扩增产物克隆到pTAdV载体中，用PCR筛选、酶切鉴定得到阳

10、性正向克隆pTA-HBV。再经EcoRI单酶切，得到831 bp片段，与PCR产物大小相符，序列和方向经双向测序证实。2.靶基因的体外转录：正向插入有HBV C基因片段的重组质粒pTA-HBV大小为931 nt。对照32P-rHDVRZA、rHDVRZP相应大小分别约为1782 nt、1044 nt，均与设计相符合。3.切割反应：核酶与靶RNA在不同温度下保温切割的结果，1、I为HBV对照(55)，只有一条主转录带，rRZ、rHDVRZP在37、42、55切割HBV为两条带(721 nt，210 nt)，rHDVRZA在37和55都观察到切割活性。讨论核酶是一类具有催化活性的RNA分子，能特异

11、地识别和切割靶RNA。针对HBV复制过程中出现的RNA中间体的核酶，有望不仅抑制HBV的表达，而且破坏HBV的复制。利用DNA重组技术将特异性核酶结构插入到HDV基因组中，使之成为一种肝细胞导向性载体6，通过HDV的复制，特异地切割HBV靶RNA，阻断HBV的表达和复制，最终清除体内的HBV，而HDV由于不能依赖于HBV包装和释放，导致自身消亡，具有巨大的应用潜力。构建HBV特异性锤头型核酶(rRZ)及插入核酶的HDV基因组重组体rHDVRZA的同时，鉴于C区基因比较保守，克隆了831 bp的HBV C基因片段。其靶序列为：UCC AGG GAA UUA GUA GUC AGC UAU GUC

12、 AAU GUU (21412175)，切割点位于21562158的GUC。考虑到全长的rHDVRZA可能影响核酶与靶物相互作用，还克隆了部分长度的重组体rHDVRZP。所有克隆均正向插入到T7启动子下游，以便于体外转录。转录后电泳显示主带明显，转录物的大小基本上与设计相吻合。切割实验表明：153 nt的RZ和1 044 nt的rHDVRZP在37均有切割活性，并且在37至55范围，温度越高，切割产物带越明显(721nt,210 nt)。两者切割效率相近，表明rHDVRZP中核酶能形成正确的二级结构。全长重组体rHDVRZA在37，55也观察到切割活性，只是切割活性较低，可能是由于核酶二级结构

13、形成受影响。核酶的切割涉及很多因素，比如离子强度、温度、靶与底物分子比、变性剂的存在等。有关HDV基因组重组体rHDVRZA的体外切割的动力学研究及体内复制和切割活性的研究正在进行之中。本课题受广东省自然科学基金会资助作者简介:温淑娟,女,36岁,主管技师.从事基因诊断及基因诊断试剂的开发与研究作者单位:510515,广州南方医院医学基金技术中心.参考文献1Weizsacker FV,Blum HE,Wands JR.Cleavage of heppatitis B virus RNA by three ribozymes transcripted from a single DNA temp

14、late.Biochem Biophy Res Commun,1992,189: 743.2Beck J,Nassal M.Efficient Hammerhead ribozyme-mediated cleavage of the structured hepatitis B virus encapsidation signal in vitro and in cell extracts,but not in intact cells.Nucl Aci Res,1995,23: 4954-4962.3林万明,主编.PCR操作及应用指南.北京：人民军医出版社,1993.322-327.4Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular clone labora-tory mannul.2nd.New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.42-46.5Hutchins CJ,Rathjen PD,Forster AC,et al.Self-cleavage of plus and minus RNA transcripts of avoado sunblotch viroid.Nucl Aci Res,1986,14: 3627-3640.6 Hsi