RT-PCR(包括引物设计)

1、实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的原理及应用技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)中山大学中山医学院中山大学中山医学院内内 容容 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量技术的应用实时荧光定量技术的应用PCR： 国王和象棋的故事N = 264 -1 = 18446744070309551615PCR：伟大的天才发明CYCLE NUMBERA

2、MOUNT OF DNA01122438416532664712882569512101,024112,048124,096138,1921416,3841532,7681665,53617131,07218262,14419524,288201,048,576212,097,152224,194,304238,388,6082416,777,2162533,554,4322667,108,86427134,217,72828268,435,45629536,870,912301,073,741,824311,400,000,000321,500,000,000331,550,000,0003

3、41,580,000,000PCR原理简介PCR：理想与现实l 反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能l 终点检测，与看家基因对照，所谓 半定量：不可接受。实时荧光定量实时荧光定量PCR定义定义 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧光，利用荧光信号累积信号累积实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，最后通过标进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理定量原理原理定量原理介绍三个概念：介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值如何对起始模板定量？如何对起

4、始模板定量？通过通过Ct值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分析进行定量分析通过通过看家基因看家基因和和目的基因目的基因的的Ct值进行相对定量值进行相对定量实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 扩增曲线扩增曲线扩增曲线图：扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -荧光阈值荧光阈值荧光信号阈值荧光信号阈值 （threshold threshold ）：q 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的

5、荧光背景值和阴性对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍q 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99q 真正的信号:荧光信号超过域值实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值CtCt值的定义值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t) value 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值的重现性横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量CtCt值的特点值的特点：相同

6、模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理定量原理理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 标准曲线标准曲线q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量Sample实时荧光定量PCR原理 绝对定量2

7、5以各自样本中内参（housekeeping）基因为标杆，比较两样本中目的基因的相对丰度- Ct法法 成立条件：内参基因成立条件：内参基因 (houskeeping gene) 在相互比较的样本在相互比较的样本之间表达丰度相同之间表达丰度相同 满足条件：内参基因和目标基因的扩增效率接近满足条件：内参基因和目标基因的扩增效率接近 - 正负正负10%实时荧光定量PCR原理 相对定量讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用q 实时荧光定

8、量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用非特异性荧光标记：非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记：特异性荧光标记： 2、TaqMan 实时荧光定量实时荧光定量PCR - DNA PCR - DNA 产物的荧光标记产物的荧光标记如如 何何 选选 择？择？实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法 1 -1 -SYBR Green 法SYBR Green SYBR Green 法 工作机理q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部

9、位q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时，DNA双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBR Green 5353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitationExcitation温度温度荧光强度荧光强度Tm-dIdTTmSYBR Green SYBR Green 法法 融解曲线分析融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确

10、非特异性产物非特异性产物SYBR Green SYBR Green 法法 优缺点优缺点 q 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNAq 使用方便 -不必设计复杂探针q 非常灵敏q 便宜优 点q 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件q 对引物特异性要求较高缺 点与目标序列互补实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法2 -TaqMan2 -TaqMan法法TaqMan-水解型杂交探针v 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 v 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)v 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基

11、团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光v Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针TaqManTaqMan法法 工作原理工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqManTaqMan法法 优缺点优缺点q 对目标序列的高特异性 -阴性结果确定q 设计相对简单 -与目标序列某一区域互补q重复性比较好优 点q 只适合一个特定的目标q 委托公司标记，价格较高q 不易找到本底低的探针缺 点讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPC

12、R实验设计及应用实验设计及应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 染料法举例染料法举例实验步骤实验步骤流程示意图流程示意图TaqManTaqMan法举例法举例 材料准备材料准备q从正常肺组织中提取的从正常肺组织中提取的总总 RNA RNA q从肺癌组织中提取的从肺癌组织中提取的 总总RNARNA-Trizol -Trizol - -裂解液裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱，（氰酸胍，异硫氰酸呱， SDSSDS）-

13、 -液氮液氮-RNA-RNA保存液保存液 小心小心DNADNA污染！污染！- -使用使用DEPCDEPC处理相关器材处理相关器材 最常用最常用反应体系反应体系 dNTP Mixture (dATP、dCTP、dGTP和dTTP) DEPC H2O 下游应用：是否检测其它基因？检测何种剪接体？是否会有二级结构干扰？ 检测灵敏度是否足够？ 逆转录逆转录引物选择逆转录引物选择常用常用一步法一步法 or 两步法？两步法？两步法：步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检 测多个基因。便于反应优化。推荐：工作的初期阶段推荐：工作的初期阶段 RealSYBR RealSYBR 二步法荧光定量二步法荧光定量PC

14、RPCR试剂盒试剂盒/With ROX/With ROX RealSYBR RealSYBR 一步法荧光定量一步法荧光定量PCRPCR试剂盒试剂盒/With ROX/With ROX RealSuper RealSuper 二步法荧光定量二步法荧光定量PCRPCR试剂盒试剂盒/With ROX/With ROX一步法：一步法：简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。 推荐：工作的成熟阶段推荐：工作的成熟阶段 （实际上：不推荐）（实际上：不推荐） RealSuper RealSuper 一步法荧光定量一步法荧光定量PCRPCR试剂盒试剂盒/With ROX/With ROXPCR体系M

15、aster mix的选择 DNA聚合酶 Primers Dye Buffer and dNTPs TemplateReal-time PCR cDNA关键关键Real-time PCR 总原则与普通PCR相同 避免引物二聚体，避免二级结构 尽量小些 （70 - 300bp) 目标区段位置：考虑目标剪接体 推荐做跨intron设计EXON 1EXON 2INTRON 2DNADNAEXON 1EXON 2RNARNA引物设计引物设计PRIMER PREMIER 5.0上机操作上机操作点击运行程序运行程序点击点击保存保存结果分析结果分析对照对照样品样品Trouble shootingHouseke

16、eping geneHousekeeping gene 无信号无信号RNARNA降解降解用新鲜组织提取用新鲜组织提取RNARNAHousekeeping gene Housekeeping gene 有信号有信号而目标基因无信号而目标基因无信号1. 1. 目的基因表达低。目的基因表达低。 逆转录效率不高逆转录效率不高2. PCR2. PCR引物不良引物不良1. 1. 富集富集mRNA mRNA 2. 2. 在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。3. 3. 尝试不同尝试不同PCRPCR引物。减小产物大小，改换目标引物。减小产物大小，改换目标 区段，考虑不同剪接体

17、。区段，考虑不同剪接体。4. 4. 尝试不同热循程序，降低复性温度。尝试不同热循程序，降低复性温度。Housekeeping geneHousekeeping gene反应效率正常反应效率正常, ,但但目标因放大效率不高目标因放大效率不高PCRPCR引物不良引物不良重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段，重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段，考虑不同剪接体考虑不同剪接体目标基因表达丰度在目标基因表达丰度在样本之间异常一致样本之间异常一致RNARNA被基因组被基因组DNADNA污染污染使用跨使用跨intronintron 引物引物用用DNaseDNase处理处理RNARNA确保确保RNARNA阴性对照表现阴性阴性对照表现阴性溶解曲线出现杂峰溶解曲线出现杂峰出现非特异出现非特异PCRPCR产物产物出现引物二聚体出现引物二聚体尝试不同尝试不同PCRPCR引物引物尝试不同热循程序，升