chapter 03 克隆载体

1、 Vectors1. 载体载体 （Vectors）体外重组体外重组DNADNA实验中，将外源实验中，将外源DNADNA片段运送进宿主片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的细胞进行扩增或表达的DNADNA分子分子( (运载工具运载工具) )称为称为载载体体(vector)(vector) 。 （1 1）在宿主细胞内能稳定存在，）在宿主细胞内能稳定存在，自主复制自主复制, , 具有具有oriori。（2 2）有一段）有一段多克隆位点（多克隆位点（MCSMCS）。2. 2. 分子克隆对载体的要求（特征）分子克隆对载体的要求（特征）外源外源DNADNA插入其中不影响载体的复制。插入其中不影响载体的复制。（

2、4 4）分子量小，拷贝数多。易从宿主细胞中分离纯化。）分子量小，拷贝数多。易从宿主细胞中分离纯化。（5 5）符合生物安全要求）符合生物安全要求（3 3）有）有选择性遗传标记选择性遗传标记。 基因工程中常用的载体有基因工程中常用的载体有5类：类： 3. 载体载体 的种类的种类质粒（质粒（plasmid）单链单链DNA噬菌体噬菌体M13 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物柯斯质粒（柯斯质粒（cosmid）动物病毒（动物病毒（virus） 载体的功能：载体的功能：n运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞n为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力n为外源基因的扩增或

3、表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件第一节第一节 质粒载体质粒载体 一、质粒（一、质粒（plasmid）的基本特性）的基本特性是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状环状DNA分子。一般为分子。一般为1-200kb。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。1 1、质粒的复制、质粒的复制oriRopRNA IRNA II-550RNase H400600大多数载体都带大多数载体都带有一个来源于有一个来源于pMB1pMB1质粒或质粒或ColE1ColE1质粒的复质粒的复制起点。制起点。2、质粒的复制类

4、型、质粒的复制类型1） 严紧型质粒（严紧型质粒（stringent plasmid）拷贝数少拷贝数少，只有，只有15份拷贝。份拷贝。2） 松弛型质粒（松弛型质粒（relaxed plasmid）拷贝数多拷贝数多，有，有10几百份拷贝。几百份拷贝。（接合型质粒分子量大，一般属严紧型（接合型质粒分子量大，一般属严紧型DNA polymerase III ）。）。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型DNA polymerase I ）。）。3、质粒的不相容性、质粒的不相容性 质粒的不相容性( incompatibility)：两个利用相同复制系统的质粒在同一个宿主

5、中不能共存的现象。在大肠杆菌中的质粒，可以分为：在大肠杆菌中的质粒，可以分为：接合型质粒接合型质粒: :非接合型质粒非接合型质粒能自我转移能自我转移不能自我转移不能自我转移4 4 质粒的转移性质粒的转移性除了带有自我除了带有自我复制复制所必需的遗传信息外还带有一套所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌控制细菌配对配对和质粒和质粒接合转移接合转移的基因。的基因。如：如：F F质粒（性质粒、或质粒（性质粒、或F F因子）：因子）：甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。不存在该质粒的受体菌中。又叫又叫自我转移型质粒自我转移型质粒

6、。1. 1. 接合型质粒：接合型质粒：不符合基因工程的安全要求。不符合基因工程的安全要求。大肠杆菌接合（大肠杆菌接合（conjunction）2. 2. 非接合型质粒：非接合型质粒：带有自我带有自我复制复制所必需的遗传信息，但失去了控制细所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合菌配对和质粒接合转移转移的基因，因此不能从一个细的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。胞转移到另一个细胞。（1 1）R R质粒（抗性质粒）：质粒（抗性质粒）：带有一种或数种带有一种或数种抗生素抗性基因抗生素抗性基因，使寄主获得同样，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（的抗生素抗性性状（r resistancee

7、sistance）。）。符合基因工程的安全要求。符合基因工程的安全要求。带有控制带有控制大肠杆菌素（大肠杆菌素（colicin）合成的基因。合成的基因。（2）Col质粒：质粒：大肠杆菌素对不带大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。质粒的大肠杆菌有毒。Col质粒或质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。为接合型质粒。（1）分子量小：）分子量小： 质粒的一般生物学特性质粒的一般生物学特性1200 kb（2）编码基因少：）编码基因少：23个中等大小的蛋白质。个中等大小的蛋白质。（3）环形状：）环形状：双链环状双链环状DNA。（酵母的（酵母的“杀伤质粒杀伤

8、质粒”是是RNA）。）。如抗菌素抗性、毒素、代谢特征等，赋予细如抗菌素抗性、毒素、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。菌一些额外的特性（非必须）。（4）质粒的空间构型：）质粒的空间构型： 共价闭合环状共价闭合环状DNA（cccDNA)呈超螺旋（呈超螺旋（SC）（）（super coil）Covalent close circular DNA 线形线形DNA （ linear ，lDNA）一条链上有一至数个缺口。一条链上有一至数个缺口。 开环开环DNA（ open circular， ocDNA）（5 5）质粒空间构型与电泳速率）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型

9、电泳迁同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：移率不同：scDNAscDNA最快、最快、l DNAl DNA次之、次之、ocDNAocDNA最慢。最慢。SCOCL二、标记基因二、标记基因 (marker gene)氨苄青霉素抗性（氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性卡那霉素抗性 （Kanr）四环素抗性四环素抗性 （Tetr）链霉素抗性链霉素抗性 （Strr）氯霉素抗性氯霉素抗性 （Cmlr）1 1、选择标记基因、选择标记基因绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记： 氨苄青霉素（氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。青霉素的衍生

10、物。通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌生长的细菌。a）抑菌原理）抑菌原理b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Ampr基因编码基因编码 -内酰胺酶内酰胺酶，特异地切割氨苄，特异地切割氨苄青霉素的青霉素的 -内酰胺环。内酰胺环。b b）细菌抗性原理）细菌抗性原理a a）抑菌原理）抑菌原理通过于通过于30S30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌生长的细菌。TetTetr r 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，阻止四环素

11、通过细胞膜进入细菌细胞内。修饰，阻止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。通过与通过与50S50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死的合成并阻止肽键的形成。杀死。b b）细菌抗性原理）细菌抗性原理CmlCmlr r 编码编码乙酰转移酶乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化，特异地使氯霉素乙酰化（形成氯霉素羟已酰氧基衍生物）而失活。（形成氯霉素羟已酰氧基衍生物）而失活。a a）抑菌原理）抑菌原理通过与通过与70S70S核糖体结合，导致核糖体结合，导致mRNAmRNA发生错读。发生错读。杀死细菌杀死细菌。KanKanr r 编码的编码的氨基糖苷磷酸转移酶氨

12、基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。b b）细菌抗性原理）细菌抗性原理a a）杀菌原理）杀菌原理a）杀菌原理）杀菌原理通过与通过与30S核糖体亚基结合，导致核糖体亚基结合，导致mRNA错错译。译。杀死细菌杀死细菌。b）细菌抗性原理）细菌抗性原理Strr 编码一种编码一种氨基糖苷磷酸转移酶氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。亚基结合作用。使受体菌发生遗传性状的改变的基因。使受体菌发生遗传性状的改变的基因。Ampicillin 抗性抗性和和 lacZ的的 肽互补

13、肽互补（蓝白（蓝白斑）相结合。斑）相结合。-互补（互补（-complementation）蓝白斑选择原理：蓝白斑选择原理：1） X-gal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside） -半乳糖苷酶半乳糖苷酶能把无色的化合物能把无色的化合物Xgal分解成半分解成半乳糖和一个乳糖和一个深蓝色深蓝色的物质的物质5-溴溴-4-氯靛蓝。氯靛蓝。X-gal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶2） -半乳糖苷酶半乳糖苷酶X-gal显色反应：显色反应：lacZlacZ的的 肽互补肽互补1 1） - -肽（肽（ lacZlacZ ）：）： -

14、 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N端的一段氨基酸片段（端的一段氨基酸片段（11-4111-41氨基氨基酸）。酸）。lacZlacZ只有在只有在4 4聚体的状态下才有功能聚体的状态下才有功能. .C C端大部分端大部分N N端的端的11-41aa11-41aa受体菌基因组的受体菌基因组的 - -半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失氨基端有缺失（缺失 肽），不能形成肽），不能形成4 4聚体的活性酶，不能分解聚体的活性酶，不能分解X-gal X-gal 受体菌株：受体菌株：JMJM系列系列、DH5DH5受体菌受体菌lacZlacZ突变（突变（lacZlacZM15M15）pUC质粒载体上的

15、质粒载体上的lacZ 编码编码 肽与这个缺失肽与这个缺失突变的突变的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶“互补互补”，使它能形成，使它能形成4聚体。又能分解聚体。又能分解X-gal。产生蓝色物质。产生蓝色物质。C端大部分端大部分N端的端的11-41aapUC lacZ受体菌受体菌lacZ3）载体）载体lacZ与与 互补互补4） 互补的插入失活互补的插入失活 pUC载体上载体上LacZ的的5端有一段多克隆位点端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入的合成，但插入外源基因就会阻止外源基因就会阻止LacZ的合成。不能互补。的合成。不能互补。 lacZ53 肽肽互补互补M

16、CS 肽移码突变肽移码突变 lacZ53不互补不互补外源外源DNAIPTGIPTG是乳糖的类似物。能诱导是乳糖的类似物。能诱导laclac操纵子的操纵子的启动转录，使载体的启动转录，使载体的lacZlacZ 肽肽和受体菌基和受体菌基因组中的因组中的lacZ lacZ 的的C C端部分端部分都表达，从而互补。都表达，从而互补。但载体但载体MCSMCS上插入外源上插入外源DNADNA后，则不能产生后，则不能产生 肽！肽！IPTG通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有是否有DNADNA插入。插入。MCSMCS无插入时，互补，蓝菌斑。无插入时，互补，蓝菌斑。

17、MCSMCS有插入时，不互补，白菌斑。有插入时，不互补，白菌斑。IPTGIPTG诱导的结果：诱导的结果：无质粒的无质粒的受体菌受体菌 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶部分缺失，不部分缺失，不能分解能分解XgalXgal；无抗菌素抗性无抗菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养无菌斑无菌斑生长生长质粒转化质粒转化的受体菌的受体菌 - -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的缺失被载体产物缺失被载体产物 互补，能分解互补，能分解XgalXgal。且有抗菌。且有抗菌素抗性素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养有蓝色有蓝色菌斑生菌斑生长长带外源带外源

18、DNADNA插插入的质粒转化入的质粒转化的受体菌的受体菌载体产物失活，载体产物失活，不能互补不能互补 - -半半乳糖苷酶的缺乳糖苷酶的缺失。不能分解失。不能分解XgalXgal，但有抗，但有抗菌素抗性菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养有白色有白色菌斑生菌斑生长长 插入失活（插入失活（insertational inactivation）插入失活，插入失活， pBR322具有双抗菌素抗具有双抗菌素抗性选择标记，分两次先后选择：性选择标记，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞没有获得载体的寄主细胞在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。获得载体的寄主细胞

19、获得载体的寄主细胞在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡。中死亡。外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活但在但在Amp中死亡中死亡（1 1）分子量大，拷贝数低）分子量大，拷贝数低1 1、 天然质粒的局限性天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101pSC101，分，分子长子长 9.1 kb9.1 kb。只有一个。只有一个EcoR IEcoR I切点当克隆位切点当克隆位点。点。ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1能杀死不含能

20、杀死不含ColE1 质粒的菌，形成质粒的菌，形成“噬菌噬菌斑斑” ）。唯一的克隆位点）。唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个正好位于这个基因的内部。可以通过插入失活筛选。但细菌群基因的内部。可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗体容易自发突变出抗colicin E1的细胞的细胞.（2）筛选标志不理想）筛选标志不理想（1 1） 具有复制起点（具有复制起点（ORIORI）2 2、质粒载体必须具备的基本条件、质粒载体必须具备的基本条件（2 2）具有抗菌素抗性基因）具有抗菌素抗性基因（3 3）若干限制性内切酶的单一位点（多克隆位点）若干限制性内切酶的单一位点（多克隆位点MCSMCS）是

21、筛选的标志。理想的载体应该有两种抗是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。菌素抗性基因。用来插入外源用来插入外源DNADNA片段。且插入后不影响复制片段。且插入后不影响复制功能。功能。（4 4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。）具有较小的分子量和较高的拷贝数。第一阶段（第一阶段（1977年前）：年前）：天然质粒和重组质粒的利用，天然质粒和重组质粒的利用，如如pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322。第二阶段：第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如隆位点区和新的遗传标记基因。如pU

22、C系列载体。系列载体。第三阶段：第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如的不同要求，如M13mp系列载体，含系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 质粒载体的发展：质粒载体的发展：质粒载体的命名质粒载体的命名pBR322plasmid作者或实验室名称作者或实验室名称F.Bolivar, R.L.Rodriguez质粒的编号质粒的编号（1 1）高拷贝数的质粒载体）高拷贝数的质粒载体ColE1ColE1、pMB1pMB1派生质粒。派生质粒。在没有菌体蛋白质合成的条件下

23、（蛋白质合成在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个抑制剂氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数细胞的拷贝数1000300010003000个！个！适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。因产物。（2 2）低拷贝数的质粒载体）低拷贝数的质粒载体 但有特殊用途但有特殊用途: :由由pSC101pSC101派生来的载体特点：分子量小，拷贝数低。派生来的载体特点：分子量小，拷贝数低。当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡

24、时，影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。就需要低拷贝的载体。pLG338pLG338、pLG339pLG339、pHSG415pHSG415等等不适合大量扩增不适合大量扩增DNADNA用。用。（3 3）正选择的质粒载体）正选择的质粒载体如如pUC19pUC19、pET28apET28a等。等。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。培养基上生长。直接选择转化后的细胞。直接选择转化后的细胞。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。Direct selection ve

25、ctorsDirect selection vectors（4 4） 克隆型质粒载体克隆型质粒载体主要用来扩增和保存主要用来扩增和保存DNADNA片段片段复制起始点复制起始点Ori、选择标记、选择标记、多克隆位点多克隆位点MCS1）普通载体元件）普通载体元件 克隆载体的结构克隆载体的结构pBR322pBR322质粒质粒（5 5） 表达型质粒载体表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录的基因置于大肠杆菌的转录翻译信号控制之下。翻译信号控制之

26、下。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。止密码的阅读正确。强启动子及有利于分泌、分离纯化的元件强启动子及有利于分泌、分离纯化的元件复制起始点复制起始点Ori、选择标记、选择标记、多克隆位点多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因阻遏基因 I操纵基因操纵基因O启动基因启动基因P核糖体结合位点序列（核糖体结合位点序列（SD）转录终止信号区。转录终止信号区。1）普通载体元件）普通载体元件 表达载体的结构表达载体的结构（6 6） 穿梭质粒载体穿梭质粒载体穿梭质粒载体的结构穿梭质粒载体的结构人工构建的、具有人工构建的、具

27、有两种不同复制起点两种不同复制起点和和选择标记、可以在选择标记、可以在两种不同的寄主细胞两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。中存活和复制的质粒载体。Yeast复制起点复制起点E.coli复制起点复制起点E.coli选择标记选择标记Yeast选择标记选择标记MCS大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌大肠杆菌动物细胞穿梭载体动物细胞穿梭载体常用的穿梭质粒载体常用的穿梭质粒载体穿梭载体的优点穿梭载体的优点 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。菌、哺乳动物细胞等）

28、进行基因表达。 可以自如地在两种不同寄主细胞之可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。间来回转移基因。克隆、构建克隆、构建表达表达E.coliAnimal cell 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达利用大肠杆菌进行基因克隆、表达四、经典的大肠杆菌质粒载体四、经典的大肠杆菌质粒载体1. pSC101第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。粒载体。（1）类型）类型天然质粒，属低拷贝型。天然质粒，属低拷贝型。（2）长度）长度9.09 kb。（3）选择标记）选择标记四环素抗性四环素抗性Tetr6个克隆位点：个克隆位点：EcoR I、Xho I、Pvu I、H

29、ind III、BamH I、Sal I主要使用主要使用EcoR I。（其中（其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位于个位于选择标记选择标记Tetr的内部）的内部）（4）克隆位点）克隆位点2. ColE1（1）类型）类型天然质粒，属高拷贝型。天然质粒，属高拷贝型。（2）长度）长度6.3 kb。（3）选择标记）选择标记大肠杆菌素（大肠杆菌素（colicin）E1和对和对E1免疫的基因免疫的基因（immE1）特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞1000-3000拷贝之多！

30、拷贝之多！ colicin E1基因的结构基因的结构ceaimmkil结构基因结构基因免疫基因免疫基因溶菌基因溶菌基因 杀死不含有杀死不含有ColE1细菌的原因细菌的原因cea + kil基因产物基因产物 不被其他细菌的不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因所杀死的原因imm基因基因EcoR I位于位于E1内部，插入外源内部，插入外源DNA会导会导致致E1失活，使受体菌不能合成失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对），但仍然表现出对E1免疫型免疫型（ImmE1+）。）。EcoR I（4）克隆位点）克隆位点Colicin E1外源外源DNA无无Colicin用对外源用

31、对外源colicin E1的免疫性和自身不能合成的免疫性和自身不能合成colicin E1作选择，操作非常繁杂。作选择，操作非常繁杂。对对colicin E1敏感的细菌群体中自发突变产生敏感的细菌群体中自发突变产生抗抗colicin E1的频率很高！的频率很高！（5）ColE1的选择缺陷的选择缺陷ColE1抗抗 colicinE1杀杀ColE1- -仍抗仍抗 colicinE1不杀不杀ColE1- -插入片段插入片段ColE1pSP2124质粒的质粒的Ampr基因基因3. pBR322：（1）元件来源）元件来源F. Bolivar和和R.L. Rodriguez人工构建载体。人工构建载体。 复

32、制起点复制起点 oripMB1系列（来源于系列（来源于ColE1）的的高拷贝高拷贝型复制起点型复制起点 Ampr基因基因 Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因。基因。（2）长度）长度4361bp（3）选择标记）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。氨苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点）克隆位点其中其中9个会导致个会导致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、Sal I 等）；等）；3个会导致个会导致Ampr基因失活（基因失活（Pst I、 PvuI 、 Sca I ）。）。24个。个。（5）pBR322的优点的优点 双抗菌素抗性选择标记双抗菌素抗性选择标记插入失活，先后分两次选择：

33、插入失活，先后分两次选择：没有获得载体的寄主细胞没有获得载体的寄主细胞在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。获得载体的寄主细胞获得载体的寄主细胞在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡。中死亡。外源基因外源基因BamH IBamH IAmpAmp中存活中存活但在但在TetTet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst IPst ITetTet中存活中存活但在但在AmpAmp中死亡中死亡氯霉素扩增之后，每个细胞可达氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy10003000copy 安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mobmob（mobilizationmobilization）

34、。不能）。不能通过接合转移。通过接合转移。 高拷贝数高拷贝数 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大载体越小越好。载体越小越好。10kb10kb的的DNADNA在纯化过程中容易断裂。在纯化过程中容易断裂。保留了转移蛋白（保留了转移蛋白（mob）的）的作用位点作用位点。（6）pBR322的缺点的缺点能够被能够被ColK质粒编码的质粒编码的mob蛋白识别，如蛋白识别，如果再有果再有F质粒的参与，就有可能转移！质粒的参与，就有可能转移！ 删除删除mob识别位点识别位点（如质粒（如质粒pBR327、pAT153等）。等）。pAT153：从从pBR322上切去上切去HaeII片断，既除去了片断，既除去了m

35、ob识别位点，又增加质粒的拷贝数。识别位点，又增加质粒的拷贝数。（7）PBR322的改进的改进pBR325：在在pBR322位点上接入一段来自噬菌体位点上接入一段来自噬菌体PICm的的HaeII酶切片段（带有氯霉素抗性基因酶切片段（带有氯霉素抗性基因cmlr）。）。cmlr上也带一个上也带一个EcoRI位点位点。使使EcoRI 也成为插入失活型位点。也成为插入失活型位点。 改造改造EcoR I 位点位点University of California的的J. Messing和和J. Vieria于于1978年，在年，在pBR322的基础上改造的基础上改造而成。属正选择载体。而成。属正选择载体。

36、pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19 复制起点复制起点pBR322的的 ori但其上失去了克隆位点。但其上失去了克隆位点。 Ampr 基因基因（1）元件来源）元件来源 lacZ的启动子的启动子大肠杆菌大肠杆菌 lacZ基因基因大肠杆菌大肠杆菌lacZ的的 -肽链序列，肽链序列， 是是LacZ 的氨的氨基端片段。基端片段。pBR322的的Ampr基因基因（2）长度）长度2686 bp（3）克隆位点）克隆位点10个连续的单一限制酶切位个连续的单一限制酶切位点，位于点，位于lacZ基因的基因的5端。端。多克隆位点排列方向相反多克隆位点排列方向相反 更小的分子量

37、：更小的分子量：如如pUC18pUC18为为2682bp2682bp，pUC8pUC8为为2750bp2750bp。 选择方便选择方便X-galX-gal显色、抗菌素双重直接选择。显色、抗菌素双重直接选择。 克隆便利克隆便利具有多克隆位点（具有多克隆位点（MCSMCS），使有两个不），使有两个不同粘性末端的外源同粘性末端的外源DNADNA方便地插入。方便地插入。 测序方便测序方便pUC的的MCS与与M13噬菌体载体的噬菌体载体的MCS完全相同，完全相同，便于把外源便于把外源DNA转移到转移到M13载体上测序。载体上测序。pUC118、pUC119n由由pUC18pUC18、pUC19pUC19

38、改造而来；改造而来；n增加了增加了M13phage DNAM13phage DNA合成起始和终止及包合成起始和终止及包装进入噬菌体颗粒中必需的顺式序列（装进入噬菌体颗粒中必需的顺式序列（IGIG）n噬菌粒（噬菌粒（phagemidphagemid）5. pGEM-3Z/4Z由由pUC派生而来。派生而来。与与pUC的主要区别是在的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个的两侧分别加了一个噬菌体噬菌体启动子启动子T7和和SP6。2.74kbT7启动子启动子SP6启动子启动子MCSlacZAmprori可被可被T7和和SP6的的RNA聚合酶识别转录。聚合酶识别转录。 如果加入纯化的如果加入纯化的T7T7

39、或或SP6 RNASP6 RNA聚合酶，在聚合酶，在体外就可以转录体外就可以转录mRNAmRNA 外源基因正接反接都可以转录。外源基因正接反接都可以转录。 MCS MCS与与pUC18pUC18的完全一样。的完全一样。与与pGEM-3ZpGEM-3Z相同，只是相同，只是T7T7启动子和启动子和SP6SP6启启动子的动子的位置互换位置互换。（1 1）pGEM-3ZpGEM-3Z的特点：的特点：（2 2）pGEM-4ZpGEM-4Z的特点：的特点：6. 多功能质粒载体多功能质粒载体 pBluescript II KS（）五、质粒载体的不稳定性五、质粒载体的不稳定性1. 1. 质粒稳定遗传必须的两个

40、条件：质粒稳定遗传必须的两个条件：（1 1）每个世代、每个质粒至少要复制一次）每个世代、每个质粒至少要复制一次（2 2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分 配到两个子细胞中。配到两个子细胞中。有主动分配和随机分配两种假说。有主动分配和随机分配两种假说。（1 1）主动分配）主动分配天然质粒。天然质粒。具有一个控制质粒拷贝分配的功能区具有一个控制质粒拷贝分配的功能区（ParPar），能以主动分配的方式确保质粒能），能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中。正确分配到两个子细胞中。人工构建的质粒载体人工构建的质粒载体缺失了缺失了parpar区区，只，只能以随

41、机分配方式分到子细胞中。能以随机分配方式分到子细胞中。人工质粒。人工质粒。（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）（2 2）随机分配）随机分配但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。势群体。3. 分离的不稳定性分离的不稳定性 （segregation instability）4. 结构的不稳定性结构的不稳定性（structural instability）寄主基因组的寄主基

42、因组的IS序列插入质粒、质粒间的序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。ISdimer重组重组（1 1）新陈代谢负荷：）新陈代谢负荷：5. 5. 影响质粒载体稳定性的主要因素影响质粒载体稳定性的主要因素使寄主细胞生长减缓：使寄主细胞生长减缓：质粒载体使寄主的世代时间延长约质粒载体使寄主的世代时间延长约15%15%。 复制负荷复制负荷减缓的程度与质粒的分子量成正比。减缓的程度与质粒的分子量成正比。 转录和翻译负荷转录和翻译负荷丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完每个菌体中所拥有的

43、质粒拷贝数不完全相同，称差度。全相同，称差度。（2 2）质粒载体的拷贝数）质粒载体的拷贝数低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。差度（差度（variancevariance）：）：是产生无质粒细胞的重要原因。是产生无质粒细胞的重要原因。高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷贝数的菌体多，发生丢失的可能性大。贝数的菌体多，发生丢失的可能性大。野生型野生型E.coli中，质粒在寄主的中，质粒在寄主的重组酶重组酶作作用下会发生重组形成用下会发生重组形成二聚体质粒二聚体质粒。（3）寄主菌的重组体系）寄主菌的重组体系二聚体灾难（二聚体灾难（

44、dimer catastrophe）：）：含有大分子量插入片段的质粒载体普遍含有大分子量插入片段的质粒载体普遍能形成质粒寡聚体。能形成质粒寡聚体。二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！导二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！导致质粒失控。致质粒失控。（1）长度为）长度为48502 bp；（2）双链线性）双链线性DNA；（3）但在两端有）但在两端有cos位点，可以环化。位点，可以环化。 DNA两端各有两端各有12bp的互补粘性末端（的互补粘性末端（5单链），单链），粘性末端形成的双链区域称为粘性末端形成的双链区域称为cos位点。位点。5GGGCGGCGACCT31. DNA分子的特点分子的特点 cos位

45、点（位点（cohensive-end site）：）：一、一、 噬菌体的一般特性噬菌体的一般特性第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体 DNADNA进入细菌体内后，可形成双链环状进入细菌体内后，可形成双链环状DNADNA复制型（复制型（RF DNARF DNA）。）。 DNADNA上有至少上有至少6161个基因，有一半是必须的，与自身的个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。活动有关，成簇排列。其他约其他约1/31/3是是非必须基因（非必须基因（位于尾部合成至阻遏之间的位于尾部合成至阻遏之间的区段）。区段）。2. 2. 噬菌体的基因组特点噬菌体的基因组特点 NulAJred gamat

46、t intN cl cro O P Q SR噬菌体噬菌体DNA包包装和颗粒形成装和颗粒形成编码基因调节、溶编码基因调节、溶原状态的发生、维原状态的发生、维持和遗传重组等持和遗传重组等包含噬菌体复包含噬菌体复制和溶菌的必制和溶菌的必需基因需基因 噬菌体感染细菌的早期：双链进行噬菌体感染细菌的早期：双链进行 型复制。型复制。3. 3. DNADNA的复制模型的复制模型（1 1） 型复制型复制（2 2）滚环复制）滚环复制 感染的晚期：启动滚环复制机制。感染的晚期：启动滚环复制机制。形成多联体形成多联体 DNADNA分子。分子。这种多联体分子必须在这种多联体分子必须在coscos位点被切断成单位点被切

47、断成单体分子才能被包装起来。体分子才能被包装起来。分为两种：分为两种：1. 溶菌周期：溶菌周期：二、噬菌体的生活周期二、噬菌体的生活周期感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。解体，释放出大量子代噬菌体。烈性噬菌体（烈性噬菌体（virulent phage)2. 溶源周期：溶源周期：感染细菌后，将自己的感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化（中。形成这一过程称为溶源化（lysogenizati

48、on)。整合到细菌染色体的噬菌体整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为称为原噬菌体原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。随细菌的染色体复制而复制。温和噬菌体（温和噬菌体（temperate phage)原噬菌体（原噬菌体（prophage)：（1 1）构建原理：）构建原理：3. 3. 噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建（2 2）构建过程）构建过程在这个非必须区内制造限制酶切点在这个非必须区内制造限制酶切点引进某些突变表型，作为选择标记引进某些突变表型，作为选择标记突变某些基因，使它成为安全载体突变某些基因，使它成为安全载体删除删除 DNADNA必须区段上常用的限制酶切点必须区段上常用的限制酶切点 噬菌

49、体噬菌体DNADNA上本身有上本身有5 5个个 EcoR I 和和7 个个Hind III切点！切点！在在 噬菌体的非必需区删除非必需区或插入基因，留噬菌体的非必需区删除非必需区或插入基因，留出插入空间。出插入空间。EcoR IBamH ISal ISal IBamH IEcoR IInterested gene 923 kbcentral region 14kbleft arm 20kb interested gene 9kb right arm 9kbleft arm 20kb interested gene 23kb right arm 9kb5GGGCGGCGACC3T3GGGCGGC

50、GACC5T 噬菌体载体的构建过程噬菌体载体的构建过程（3 3）人工构建的）人工构建的 噬菌体载体有两种类型：噬菌体载体有两种类型： 插入型载体（插入型载体（insertion vectors)：如如 gt10、 gt11、 BV2、 NM540、 NM1590、 NM6071）免疫功能失活型：）免疫功能失活型：插入位点位于载体合成活性插入位点位于载体合成活性阻遏物区域阻遏物区域（cI基因）内。基因）内。EcoR IcI gt10插入导致载体不能合成阻遏物，插入导致载体不能合成阻遏物，载体载体DNADNA不能进不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。清晰

51、的噬菌斑。没有外源没有外源DNADNA插入的插入的 载体感染受体菌形成载体感染受体菌形成混浊噬菌混浊噬菌斑斑。如如 NM1149NM1149载体的两个克隆位点（载体的两个克隆位点（EcoRIEcoRI和和Hind Hind IIIIII）都是位于）都是位于cIcI基因内部。基因内部。2 2） - -半乳糖苷酶失活型载体：半乳糖苷酶失活型载体：在在 基因组中引入了基因组中引入了LacZLacZ序列。（其上含有一个序列。（其上含有一个EcoR I EcoR I 克隆位点）。克隆位点）。感染感染LacZLacZ突变的大肠杆菌，经突变的大肠杆菌，经IPTGIPTG的诱导，利用的诱导，利用XgalXga

52、l的显色反应的显色反应作选择标记。作选择标记。LacZEcoR ICharon16A 替换型载体（替换型载体（substitution vectors)substitution vectors)两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于 DNADNA的非必须区两端。的非必须区两端。用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源酶切成的外源DNADNA片段置换。片段置换。可置换区可置换区MCSMCSMCSMCS如：如： EMBL4EMBL4、Charon40Charon40等。等。1） EMBL4 EMBL4的可

53、置换片段内部还有的可置换片段内部还有Sal I酶切位点。酶切位点。以便于进一步消化中间片段，防止自我连接。以便于进一步消化中间片段，防止自我连接。左臂左臂可置换区可置换区右臂右臂EcoR IBamH ISal ISal IBamH IEcoR ISal ISal I EMBL42）Charon40Charon40的可置换片段是由的可置换片段是由DNA短片段重复构成，短片段重复构成，片段之间有片段之间有Hae I 切点切点。在克隆的时候，可以用在克隆的时候，可以用Hae I 酶进一步将可置换片酶进一步将可置换片断切成小片段，以防止重新与载体连接。断切成小片段，以防止重新与载体连接。左臂左臂可置换

54、区可置换区右臂右臂MCSMCSCharon40Hae I可取代片断中如果包含可取代片断中如果包含LacZ，可用，可用Xgal显色显色作筛选标记。作筛选标记。（4） 载体的筛选标记载体的筛选标记 插入型载体插入型载体根据插入所引起的表型突变。根据插入所引起的表型突变。 置换型载体置换型载体 DNA DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。比质粒低。4. 4. 载体的体外包装载体的体外包装 在试管中与在试管中与 噬菌体的噬菌体的头部头部和和尾部尾部蛋白人蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组菌，把重组DN

55、ADNA注入受体菌中。注入受体菌中。必须利用噬菌体外壳的作用！必须利用噬菌体外壳的作用！（1 1）体外包装：）体外包装： 的的D基因的产物也是头部蛋白，但主要与基因的产物也是头部蛋白，但主要与 DNA 进入头部和头部的成熟有关（只占进入头部和头部的成熟有关（只占20%）。）。（2）体外包装过程）体外包装过程 噬菌体外壳蛋白的合成噬菌体外壳蛋白的合成E 基因基因的的E 基因编码头部蛋白的主要成分基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的（占头部总蛋白的70%）。）。D基因基因重组的重组的 载体载体DNADNA外源的重组外源的重组 DNADNA载体被诱发与内源性载体被诱发与内源性原原 DNADNA

56、发生重组。发生重组。（3 3）体外包装存在的问题：）体外包装存在的问题： 包装错误：包装错误：既能包装用于生产头部蛋白的既能包装用于生产头部蛋白的内源性原内源性原 DNADNA，也能包装，也能包装重组的重组的 DNADNA载体载体。 重组：重组： 体外包装的容量限制：体外包装的容量限制：必须在正常野生型容量的必须在正常野生型容量的75%105%75%105%（3651kb3651kb）之间。之间。既不能超过正常野生型容量的既不能超过正常野生型容量的5%5%；又不能低于正常野生型容量的又不能低于正常野生型容量的75%75%野生型野生型 DNADNA的必须区是的必须区是28kb28kb，所以，所以

57、 载体的最载体的最大克隆容量是大克隆容量是23kb23kb。（。（实际上为实际上为15kb15kb）。）。比一般的质粒载体的容量大的多。比一般的质粒载体的容量大的多。用在真核生物基因组或用在真核生物基因组或cDNAcDNA文库的建立。文库的建立。Sau3ABamHI5. 5. DNADNA载体的优点载体的优点 噬菌体感染细菌形成的噬菌斑噬菌体感染细菌形成的噬菌斑第三节第三节 单链噬菌体载体单链噬菌体载体单链环状单链环状DNADNA的丝状大肠杆菌噬菌体：的丝状大肠杆菌噬菌体：（2）复制型（）复制型（RF）是双链环状）是双链环状DNA。1. 1. 单链单链DNADNA噬菌体的特点噬菌体的特点（3）

58、RF DNA和和ssDNA都能转染感受态都能转染感受态 大肠杆菌。并产生噬菌斑。大肠杆菌。并产生噬菌斑。（5）可产生大量的含有外源）可产生大量的含有外源DNA插入片插入片 断的断的单链分子单链分子，便于作探针或测序。，便于作探针或测序。（1）+DNA。（。（ssDNA）（4）不存在包装限制。）不存在包装限制。1复制蛋白（基因复制蛋白（基因II, V, X）2形态发生蛋白（基因形态发生蛋白（基因I, IV, XI）3结构蛋白（基因结构蛋白（基因III,VI,VII,VIII,IX）基因组基因组DNA+链链M13噬菌体是丝状的，只感染噬菌体是丝状的，只感染雄性雄性大肠杆菌。大肠杆菌。但但M13 D

59、NA可以转染雌性大肠杆菌。可以转染雌性大肠杆菌。6407 bp。（2）DNA长度长度（3）DNA编码蛋白编码蛋白（1）寄主）寄主（4）DNA提纯提纯RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式在寄主细胞内以高拷贝形式存在。存在。成熟的噬菌体里只包装有成熟的噬菌体里只包装有 + DNA，也容易，也容易提取。提取。（4）M13的生活周期的生活周期虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的约为正常的1/23/4）M13通过雄性细菌的通过雄性细菌的F性须性须注入其注入其+DNA+DNA合成合成DNA，形成，形成RF dsDNADNA转录转录mRNA、

60、合成、合成+DNA、翻译形成噬菌、翻译形成噬菌体蛋白体蛋白组装成新的噬菌体组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞挤出寄主细胞M13生活周期与生活周期与DNA复制复制基因基因5蛋白蛋白基因基因8蛋白蛋白+RFE. coli-+DNA-DNAmRNAM13外壳蛋白外壳蛋白组装成子代组装成子代M13+DNA注入大肠杆菌注入大肠杆菌复制复制转录转录翻译翻译+DNA指导合成指导合成+DNA200个个 RF DNA每个细胞可以放出约每个细胞可以放出约1000个个M13颗粒！颗粒！M13的包装过程：的包装过程：RF dsDNA指导合指导合成的成的+DNAM13基因基因V编码单编码单链链DNA结合蛋白结合蛋白D