高效液相色谱法测定兔血浆中黄芩苷的含量

1、高效液相色谱法测定兔血浆中黄芩苷的含量         10-02-07 09:52:00     编辑：studa20                       作者：蒋晪，王鹏娇, 张敏，高秀丽【摘要】  目的： 建立测定兔血浆中黄芩

2、苷的含量测定方法。方法： 用PEG400-2偏磷酸沉淀血浆蛋白,离心后取上清液进行色谱分析。色谱柱为Diamosil-C18,流动相为乙腈-0.1%磷酸（2575,V/V）,流速为1 ml/min,检测波长275 nm。结果: 黄芩苷的质量浓度在0.087 222.907 5 mg/L （r=0.989 9）；低、中、高3个浓度的质量控制（QC）样品的相对回收率分别为96.3%、97.3%和96.6%。结论: 方法简便快速,适用于黄芩苷的血药浓度测定及药代动力学研究。 【关键词】  黄芩甙； 色谱法，高压液相； 血浆； 免Abstract Objective: To establis

3、h a biopharmaceutical analytical method for the determination of baicalin in plasma by RP-HPLC. Methods: Rabbit plasma proteins were precipitated with PEG400-2%metaphosphoric acid and the supernatant liquid obtained from the serum by centrifuge was subjected to chromatographic analysis. The analytic

4、al column was Eclipse XDB-C18, and the mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid （2575, V/V） with a flow rate of 1ml/min. The detection wavelength was 275 nm. Results：The linear range of baicalin in rabbit plasma was 0.087 222.907 5 mg/L （r=0.989 9）.Three relative recoveries of bai

5、calin represented low, middle and high concentrations were 96.3，97.3and 96.6 respectively. Conclusion: This method is accurate, reliable and simple and is suitable for the pharmacokinetic study of blood concentration of baicalin.Key words baicalin; chromatography,high pressure liquid; plasma; rabbit

6、s    黄芩为唇形科多年生草本植物黄芩的根，主要含有黄芩苷、黄芩素等多种黄酮类化合物1。黄芩苷作为黄芩的主要有效成分之一，属葡萄糖醛酸苷类,具有广泛的药理作用，除传统意义上的抗炎、抗变态、抗病毒以及解热和保肝作用外,近年来,黄芩苷新用途的开发与研究日渐深入2。黄芩苷具有清除氧自由基、减轻组织缺血再灌注损伤、促进细胞凋亡以及抗肿瘤等多方面的作用3。黄芩苷具有多种药理活性，在中药中的应用非常广泛，用量也特别的大，但相关报道其生物利用度较低4。因此，在传统种植、提取及含量测定研究的同时，建立黄芩苷的血药浓度测定方法，研究其体内代谢过程，具有十分重要的基础和临床意义。2

7、007年4月对兔血浆中黄芩苷的含量测定方法进行了研究，并测定了灌胃后家兔体内黄芩苷浓度，同时对其进行了相应的药代动力学分析。1  仪器与试药Agilent1100系列高效液相色谱仪（四元泵、可变波长检测器、自动进样器、柱温箱、化学工作站B.01.01C版），TGL-16C离心机（上海安亭科学仪器厂）；黄芩提取物（含黄芩苷90%，四川省玉鑫药业有限公司），黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所,批号110715-200514）；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。实验用兔由贵阳医学院动物中心提供。2  方法与结果2.1  色谱条件色谱柱: Diamosil-C18

8、 （250 mm×4.6 mm,5 m），Phenomenex-C18保护柱（3 mm×4.6 mm,5 m）；流动相：乙腈-0.1磷酸（2575，V/V）；流速:1 ml/min；检测波长：275 nm；柱温:40 ;进样量:50 l。2.2  血浆样本处理取待测血浆0.2 ml,加入PEG400 0.2 ml,2%的偏磷酸0.2 ml，涡旋混合30 s沉淀蛋白,高速离心（16 000 r/min）10 min,取上清液50 l进样测定。2.3  检测限在2.1的色谱条件下,样品按上述方法操作，得黄芩苷的最低检测浓度为0.029 08 mg/L（S/N

9、3）。2.4  方法专一性在2.1的色谱条件下,样品按上述方法操作,比较空白血浆，空白血浆加黄芩苷对照品、血浆样品,考察方法的专一性。结果见图1。2.5  标准曲线的绘制   精密吸取空白血浆0.2 ml，分别加入标准系列的黄芩苷对照品溶液，按血浆样品的处理方法操作，制成相当于黄芩苷浓度为0.087 22 mg/L、0.145 4 mg/L、0.290 8 mg/L、0.581 5 mg/L、1.163 mg/L、2.907 5 mg/L的血浆溶液，进样50 l测定。将黄芩苷峰面积（A）对浓度（C）进行回归，得直线回归方程为：A=60.952 37

10、15;C3.982 52，r=0.998 9。由此可表明该方法在0.0872.900 mg/L浓度线性关系良好。     10-02-07 09:52:00     编辑：studa202.6  回收率试验    取空白血浆200 l,按“标准曲线”条件项下方法配成低、中、高3个质量浓度（分别为0.087 22 mg/L、0.290 8 mg/L、2.908 mg/L）的QC样品各3份, 按样品处理方法处理后进行测定,同时配制相同浓度的黄芩苷标准溶液进行测定。与血浆

11、样品结果对比，得到低、中、高3个浓度的QC样品的相对回收率，分别为96.3、97.3和96.6。2.7  精密度试验日内精密度：配制含黄芩苷浓度为0.087 22、0.290 8和2.908 mg/L的QC样品各3份，在同一天内进行样品的处理和测定，得3个浓度QC样品的RSD，分别为2.37%、1.04%和0.92%。日间精密度：按上法配制QC样品各3份，在3 d中进行相同的处理和测定，得3个浓度QC样品的RSD，分别为5.86、3.92和2.58。2.8  稳定性试验上述样品于回收率试验后，放置于4 冰箱，10 d后复测，色谱峰面积变化不大，可见血浆样品10 d内在4 条

12、件下稳定。2.9  血药浓度测定健康家兔3只,经灌胃予黄芩提取物90 mg/kg，给药后0.083、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0 h定时静脉取血0.5 ml。分离血浆,取0.2 ml血浆按“血浆样品处理”条下操作,测定黄芩苷含量（见图2）。实验数据采用3P87药代动力学方程进行曲线拟合,权重因子为1/C2（C为血药浓度）,所得药代动力学参数见表1。表1  黄芩苷的主要药代动力学参数（略）注：C为血药浓度，AUC为血药浓度曲线下面积3  讨论3.1  流动相溶剂的选择在0.4%磷酸-甲醇系统中，空白血浆

13、的背景影响大于0.1%磷酸-乙腈的系统影响。同时以0.4%磷酸和0.1%磷酸对黄芩苷峰型的影响无明显区别，而0.1%磷酸-乙腈系统的pH值在5左右， 0.4%磷酸-乙腈pH值在3左右，用0.1%磷酸-乙腈系统更有益于色谱柱的保护，因此，选用0.1%磷酸-乙腈系统做为生物样品中黄芩苷分析的洗脱系统5。3.2  兔血浆中蛋白质的处理考虑到样品处理的简便、快速，首先选用蛋白质沉淀法，选取过甲醇、乙腈、丙酮、中性盐和加热沉淀法，均不能满足实验要求6，7。偏磷酸是一种酸性沉淀剂，其作用机制是使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而沉淀。实验选取1%、2%、5%的偏磷酸做为蛋白质沉淀剂，比较后发现用偏磷酸沉淀蛋白，黄芩苷的峰型很好，理论塔板数较高，但样品的绝对回收率很低，且随着偏磷酸的浓度增高，绝对回收率逐渐降低。通过先加入PEG400再加入偏磷酸沉淀蛋白质的方法可改善黄芩苷的回收率，使其符合要求。4 【参考文献】  1马爱团，钟秀会，蒙立根.黄芩黄酮药理研究概况J.中国兽医杂志，2006（42）：39-40.2陈秀清,齐香君,何恩铭.中药黄芩研究新进展J.食品与药品,2006（8）:23-27.3高中红，黄开勋，许辉碧.黄芩黄酮对自由基的清除作用的ESR研究J.华中理工大