-NMMA对大鼠单侧睾丸扭转后对侧睾丸生精功能的保护作用

1、-NMMA对大鼠单侧睾丸扭转后对侧睾丸生精功能的保护作用         【摘要】  目的:探讨N-甲基-L-精氨酸（L-NMMA）对大鼠单侧睾丸扭转后对侧睾丸生精功能的保护作用。方法:42只健康雄性SD大鼠随机均分为假手术组、安慰剂组和L-NMMA组。建立左侧睾丸扭转模型。安慰剂组和L-NMMA组大鼠分别于扭转复位前30 min通过尾静脉缓慢推注生理盐水和L-NMMA。三组大鼠分别于术后1周、2个月时处死7只，即刻采集各组大鼠未扭转侧睾丸标本，测定睾丸组织丙二醛(MDA)水平，同时进行组织病理学观察。结

2、果:与安慰剂组相比，L-NMMA组1周时MDA值明显下降，平均曲细精管直径明显升高，而睾丸结构评分则明显偏低（P0.05）;2个月时主要表现在生精上皮层数和平均曲细精管直径较高，睾丸结构评分较低，两组间比较均有统计学差异（P0.05）。结论:L-NMMA可以减轻大鼠单侧睾丸扭转后对侧睾丸的早期损害，对晚期对侧睾丸的生精功能具有一定的保护作用。 【关键词】  L-NMMA 睾丸扭转 生精功能   Abstract:  Objective:To explore the biochemical and histological changes in the c

3、ontralateral testis of rats with unilateral testicular torsion and elucidate the protective effects of L-NMMA on the contralateral testicular spermatogenetic function. Methods: Fouty-two prepubertal Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups, with 14 rats in each. The rats in sham-opera

4、ted group underwent a sham operation of the left testis under general anaesthesia. The rats in saline group and L-NMMA group underwent a similar operation but the left testis was rotated 720°clockwise for 4h, maintained by fixing the testis to the scrotum, and saline/L-NMMA infused during half

5、an hour before detorsion was performed. All the right(untwisted) testis were removed from rats at 1 week and 2 months intervals after surgery, 7 rats were taken from each group each time. Then the malondialdehyde (MDA) levels were evaluated; histology and seminiferous tubule diameters were assessed.

6、 Results:Compared with saline group, the MDA levels in L-NMMA group decreased significantly while the mean seminiferous tubular diameter of contralateral testis and histological grades maintained in a better condition at 1 week interval; and it was also known that the rats in L-NMMA group got a high

7、er score at the grades of germ cell layers and mean seminiferous tubular diameter of contralateral testis at 2 months interval. Conclusion: L-NMMA can reduce the damage of contralateral testis of prepubertal rats with unilateral testicular torsion during the early period, and L-NMMA may also have a

8、protective effect on the testicular spermatogenetic function in the later stage.   Key words:  L-NMMA; testicular torsion; testicular spermatogenetic function   睾丸扭转是常见的泌尿外科急症，多见于25岁以下青少年,发病率约为1/4 000，即使及时手术复位固定，仍可能引起对侧睾丸生精功能的损伤1。单侧睾丸扭转后如何保护对侧睾丸的生精功能受到越来越多的临床和实验关注。本研究通过建立大鼠单

9、侧睾丸扭转模型，探讨L-NMMA对大鼠单侧睾丸扭转后对侧睾丸生精功能的保护作用，为更好地进行临床治疗提供实验基础。   1  材料和方法   1.1  动物分组  选取出生约28 d的健康雄性SD大鼠42只，随机分为假手术组、安慰剂组和L-NMMA组，每组14只。   1.2  动物模型建立  睾丸扭转模型采用Turner法制作。予2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，左下腹小切口，游离左侧睾丸，切断睾丸引带，分离周围组织至附睾头。假手术组仅将左侧睾丸游离后还纳睾丸，缝合切

10、口后术毕。其他两组待左侧睾丸完全游离后,睾丸顺时针扭转720 °，固定扭转侧睾丸防止自然复位，维持4 h后原切口打开复位扭转睾丸,关闭切口。其中安慰剂组在扭转复位前30 min予尾静脉缓慢注射生理盐水30 mg/kg；L-NMMA组在扭转复位前30 min予尾静脉缓慢注射L-NMMA 30 mg/kg。   1.3  标本制备  各组大鼠分别于术后1周、2个月时快速脱颈法处死7只，采集未扭转侧睾丸标本，将所有睾丸标本沿中轴切开分为两部分，一部分睾丸用于制备组织匀浆，另一部分睾丸迅速置于10%的中性福尔马林中待制作石蜡切片常规HE染色。 

11、;  1.4  检测方法   1.4.1  丙二醛(MDA)含量测定：按试剂盒要求制备组织匀浆，化学比色法测定睾丸组织中MDA。操作步骤严格按说明书要求进行。   1.4.2  睾丸组织病理学检查：石蜡切片常规HE染色，置于光镜下镜检，观察睾丸曲细精管结构，计数生精上皮层数，测量平均曲细精管直径（MSTD），对睾丸组织结构评分。等级一：正常睾丸，结构层次分明，生殖细胞排列整齐有序。等级二：受损睾丸，生殖细胞排列较等级一不规则，结构松散（彼此细胞间无黏附），但紧贴精细小管排列。等级三：较重受损睾丸，生殖细胞排列更加不

12、规则，且有脱落、缺失，可见核固缩现象，精细小管边界模糊不清。等级四：严重受损睾丸，紧贴精细小管的生殖细胞出现明显的凝固性坏死。   1.5  统计学处理方法  用SPSS12.0统计软件进行分析，多组比较用单因素方差分析，组间两两比较方差齐性用LSD检验，方差不齐性用Dunnetts T3检验。            2  结果   2.1  MDA含量  术后1周时，与假手术组比，安慰剂组MDA含量明显升

13、高，两者差异有显着性(P0.05)；L-NMMA组MDA值与其余两组相比差异均有显着性(均P0.05)。术后2个月时，三组间MDA含量无明显差异，详见表1。   2.2  睾丸组织病理学比较  安慰剂组和L-NMMA组在术后1周与2个月时生精上皮层数、平均曲细精管直径（MSTD）、睾丸组织结构评分与假手术组比差异都有显着性(均P0.05)。与安慰剂组比，L-NMMA组术后1周时平均曲细精管直径（MSTD）和组织结构评分均有显着性差异(均P0.05)，而术后2个月时生精上皮层数、平均曲细精管直径（MSTD）、睾丸组织结构评分上差异均有显着性(均P0.05)

14、。详见表2、表3。假手术组术后1周和2个月时，生精上皮分别为3层和5层，均紧贴精细小管生长，排列紧密，有序。小管间隙间可见少许红细胞，为取材时出血所致，不影响评分，两者评分均为1分。安慰剂组术后1周和2个月时的精细小管结构，示精细小管结构不连续，损伤明显，管腔内有大量渗出。生精上皮层排列紊乱，仅基底层较明显，其余生精上皮层或缺失，或脱落，且见毛玻璃样改变。病理评分均为4分。L-NMMA组术后1周和2个月时的精细小管结构示精细小管结构完整。生精上皮层尚紧贴精细小管排列，虽然排列略显紊乱，但层数仍可辨认，病理评分为2分。见图1。   3  讨论  

15、 单侧睾丸扭转后对侧睾丸生精功能损伤机制较为复杂，争议较多。近年来不少学者认为对侧睾丸损伤是由于扭转侧睾丸复位后缺血再灌注引起的，再灌注时NO、氧自由基等的增多均可直接或间接引起对侧睾丸组织损伤。当单侧睾丸扭转复位后，一方面扭转侧可以生成过量的NO与氧自由基结合形成更具毒性的ONOO-，导致对侧睾丸组织的损伤;另一方面通过脂质过氧化反应、促炎症递质聚集、过度扩张血管、诱导细胞凋亡等作用对两侧睾丸组织造成更大的损伤。   在本实验中,安慰剂组过氧化脂质的降解物丙二醛(MDA)在早期含量明显增多，表明早期睾丸组织存在脂质过氧化损伤；同时早期的病理发现局部睾丸组织出血水肿、炎性细

16、胞浸润、上皮细胞排列紊乱等。而术后2个月时，三组间MDA含量无明显差异，但病理学上改变明显, 表现为生精上皮层数减少、平均曲细精管直径减小、细胞空泡样变性、睾丸组织间质增生等。说明单侧睾丸扭转后，对侧睾丸组织如果早期未能及时治疗，将使得晚期睾丸组织的损害不能恢复，生精上皮细胞发育延迟，导致睾丸生精功能低下。   L-NMMA即N-甲基-L-精氨酸，为非选择性一氧化氮合酶（NOS）的拮抗剂，对诱生和固有型NOS活性都有抑制作用，能抑制一氧化氮（NO）产生，是目前国际上实验用于治疗缺血再灌注损伤的常见药物之一。在本实验中术后1周，在假手术组、安慰组、用L-NMMA组的MDA含量

17、分别是（132.6±14.3）nmol/g、（276.5±31.2）nmol/g、（181.8±21.9）nmol/g，提示应用L-NMMA在早期可以降低脂质过氧化反应产物MDA的含量，同时也发现能降低睾丸组织结构评分。而在术后2个月时，虽然三组间MDA含量无明显差异，但是发现应用L-NMMA后对侧睾丸组织生精上皮层数和平均曲细精管直径都相对较高。说明L-NMMA在早期可以减轻对侧睾丸组织的损害，有效地保护对侧睾丸组织，使得晚期睾丸的生精功能得到一定的保护。      L-NMMA可能通过以下几种途径起作用：通过抑制患侧睾丸

18、组织NOS的产生从而减少NO的生成，改善患侧睾丸的缺血再灌注损伤，从而减少患侧睾丸交感神经活性，抑制了神经反射对对侧睾丸的影响。直接作用于对侧睾丸组织，抑制睾丸间质细胞NOS的活性与产生，抑制NO的过量产生，改善对侧睾丸血供，从而减轻对侧睾丸生精细胞的损害。   单侧睾丸扭转对对侧睾丸生精功能的影响是长期和显着的，最终可以影响患者的生育能力，因此早期的干预措施显得至关重要。药物治疗将成为今后睾丸扭转复位后睾丸保护研究的重要方向之一 。本实验证实了L-NMMA能有效地保护对侧睾丸的生精功能，同时对其作用机制进行了初步地探讨，为临床治疗提供了一定的实验依据。【参考文献】  1 Savas C,Ozguner IF, Ozguner M,et al.The effects of unilat-eral testicular ischemia and hemicastration on contralateral test