高效液相色谱-荧光检测法同时测定人体尿液中的多种蝶呤类化合物

1、第27卷第1期 分析科学学报 2011年2月 V01.27No.1JOURNAI。(F ANAI。YTI(、AI,S(、IENCE Feb. 2011文章编号:10066144(2011ol002l05高效液相色谱一荧光检测法同时测定人体尿液中的 多种蝶呤类化合物崔盼盼,万益群。(南昌大学分析测试中心,江西南昌330047摘要:建立了高效液相色谱一荧光检测法同时测定人体尿液中的蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤和墨蝶呤。尿液在酸性条件下经碘一碘化钾溶液氧化30min,滴加抗坏血酸还原液后,可进行液相色谱分析。色谱柱为Diamonsil C18柱,用体积比9:10的水一甲醇为流动相,流速为1.O mL/mi

2、n,荧光检测波长为.:I。一360nm,A。=445nm。新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和墨蝶呤的线性范围分另q是O.0051.5弘g/mL、0.052.0肛g/mL、O.011.O pg/mL和0.310.0pg/mL,检出限依次为0.003pg/mL、O.002肛g/mL、O.001弘g/mL和0.15弘g/mL。加标平均回收率在84.8%120.o%之间。用该方法测定了健康人、普通病人和癌症病人尿样中的蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤和墨蝶呤,发现癌症病人尿样中的新蝶呤水平与健康人和普通病人相比有所升高,生物蝶呤水平有所降低。该方法准确,可行,适用于临床上尿样中蝶吟类化合物的检测。关键词:蝶呤类化合物;人

3、体尿液;高效液相色谱;荧光检测中图分类号:0657.7+2文献标识码:A蝶呤类化合物(Pteridines在生物体代谢过程中起重要的辅助作用,可作为体内“淋巴细胞一巨噬细胞 轴”所介导的细胞免疫防御系统激活程度的标志物,体液中其水平的高低反映了体内细胞免疫状态,已用 于多种疾病的监测。主要的几种蝶呤类化合物包括蝶呤(Pterin、新蝶呤(Neopterin、黄蝶呤(Xan thopterin、异黄蝶呤(Isoxanthopterin、蝶呤一6一羧酸(Pterin一6一carboxylic acid、生物蝶呤(Biopterin和墨 蝶呤(Sepiapterin等。其中,以新蝶呤的研究最为广泛,

4、已应用于临床上多种类型疾病的诊疗4,其它蝶 呤类化合物相对研究较少¨柚。墨蝶呤是蝶呤类化合物的一种,目前主要研究对象为动物细胞及人体脑 脊液,对人体尿液中墨蝶呤含量检测的研究鲜有报道。本文系统探讨了人体尿液中蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤和墨蝶呤的色谱分离条件,同时考察了尿液的前 处理方法,在此基础上,建立了四种蝶呤类化合物同时分析的新方法,并应用于健康人、普通病人和癌症病 人尿样检测,取得了较好的效果。1实验部分1.1仪器与试剂Agilentlloo高效液相色谱仪(美国,Agilent公司,配荧光检测器,Agilent液相色谱工作站;KQ-50DB数控超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公

5、司;TDL一5一A型低速台式离心机(上海安亭科学仪 器厂;MS2型迷你振荡器(广州仪科实验室技术有限公司;Millipore_Q Gradient超纯水装置(美国,Mi卜 lipore公司。收稿日期:2010一06一08修回日期:201009一02基金项目:国家自然科学基金(No.20765002;江西省自然科学基金(No.0620049。通讯作者:万益群,男,教授,博士研究生导师,研究方向:生命化学及色谱分析.21第1期 崔盼盼等:高效液相色谱一荧光检测法同时测定人体尿液中的多种蝶呤类化合物 第27卷蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤和墨蝶呤标准品均购自于美国Sigma公司;甲醇、乙腈为色谱纯;其他试剂

6、均 为分析纯;水为超纯水。1.2标准溶液的配制准确称取适量的蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤和墨蝶呤的标准品分别置于4个25mI。的棕色容量瓶中,加 数滴1.O mol/L Na(H溶液溶解,用超纯水稀释至刻度,摇匀,配成浓度分别是:蝶呤84.8"g/mI。、新蝶 呤90.O pg/mI。、生物蝶呤80.O pg/mL和墨蝶呤74.O pg/mL的标准储备液,置于冰箱内4保存,使用 时稀释至所需要的浓度。1.3样品前处理取晨尿1.O mL置于5mL塑料离心管中,加6.O mol/L盐酸12滴,O.05mol/L碘一碘化钾氧化液 1.O mL,于暗处放置30min,滴加0.05mol/L抗坏血酸

7、还原液1.O mL,摇匀,加水至5.0mL,经O.45“m 的微孔滤膜过滤后,进行色谱分析。1.4色谱条件Diamonsil C,。色谱柱(250×4.6mm,5弘m;柱温为室温;流动相:水一甲醇一90:10(V/V;流速为1.o mL/min;进样量为10“L;荧光检测波长为A。=360nm,A。=445nm。2结果与讨论2.1流动相的组成及流速的选择分别采用甲醇一水、乙腈一水、甲醇一磷酸盐缓冲溶 液(pH=6.56,7.0,7.43作流动相,考察了不同流 动相配比及流速对四种蝶呤类化合物色谱分离行为 的影响。结果表明:乙腈一水体系作流动相时,墨蝶 呤的荧光响应强度不高,且四种蝶呤

8、类化合物的保 留时间过小,尿液中的共存物质对其检测干扰较大; 甲醇一磷酸盐缓冲溶液(pH=6.56,7.O,7.43作流 动相时,生物蝶呤和蝶呤的分离效果不够理想;甲 醇一水体系作流动相且当甲醇:水一lO:90(V/V,流 速为1.O mL/min时,新蝶呤、蝶呤、生物蝶呤和墨 蝶呤的色谱分离效果较好,荧光响应强度较高,分析三.晶旦.兰。岳o2o三山 l I O 5lO 15202530Time/min图l 四种蝶呤类化合物的色谱分离图Fig.1Chromatogram of four pteridin器1.Neopterin(O.1pg/mL;2.Biopterin(O.1肛g/mL;3.P

9、terin (O.1pg/mI,;4.Sepiapterin(1.5pg/mI。.时间较短,尿液中共存物质对其测定无影响且系统压力不高。四种蝶呤类化合物的色谱图见图1。2.2标准曲线与检出限取适量的标准储备液,分别配制一系列不同浓度的标准工作液,按选定的色谱分离条件进行分析,并 以峰面积对浓度作图。结果表明:新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和墨蝶呤的含量分别在O.0051.5肛g/mL、 O.052.0肛g/mL、o.011.o pg/mL和O.310.o pg/mL范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系,其 线性回归方程分别是:y一217.5lz一1.127(r=0.9990;y一313.43z+12.6

10、22(ro.9982;v一517.61z +2.2659(ro.9995;y一5.1618zo.1447(,.=o.9998;以三倍信噪比计算,检出限依次是:o.003“g/ mL、O.002pg/mL、O.001弘g/mL和O.15pg/mL。2.3样品前处理方法的选择人体尿液成分复杂,为保证分析结果的准确性,考察了以下三种样品前处理方法:(1取晨尿1.o mL, 经0.45肛m的微孔滤膜过滤,定容至5mL容量瓶中,待测。(2取晨尿1.o mL置于5mI。塑料离心管 中,加6.o mol/I。的盐酸12滴,加o.05mol/L碘一碘化钾氧化液1.o mL,于暗处放置30min,滴加o.05

11、mol/L抗坏血酸还原液1.o mL,摇匀,加水至5mI。,经O.45弘m的微孔滤膜过滤得进样液。(3取晨尿 1.o mI。置于5mL塑料离心管中,加入O.1mL 1.O mol/L的盐酸和5mg二氧化锰,摇匀,于暗处放置30 min,取上清液振荡10min,12000r/min下离心10min,经o.45肛m的微孑L滤膜过滤,定容至5mL容量 瓶中,待测。将上述三种方法处理得到的空白尿样及添加蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤和墨蝶呤标准溶液的尿样按选定 22第1期 分析科学学报 第27巷的色谱条件进行分析,单个水平重复实验3次。结果表明:三种方法的平均回收率在80.2%120.o%之 间,均能满足实际

12、样品分析要求。但方法2、3与方法1相比,蝶呤、新蝶呤和生物蝶呤的荧光响应强度明 显增高。方法3与方法2相比,尿样色谱图中新蝶呤附近的杂质峰较多,干扰其测定,所以本实验采用方 法2对尿液进行前处理。2.4尿样分析取健康人、普通病人和癌症病人的晨尿,按选定的样品前处理方法及色谱条件进行分析,每个尿样平 行测定6次,尿样分析结果见表13,各癌症病人及普通病人信息见表4(18号健康人尿样由南昌大学 志愿者提供;914号普通病人尿样由江西省中医院提供;1520号癌症病人尿样由南昌大学一附院提 供。实验结果表明,癌症病人尿样中的新蝶呤水平与健康人和普通病人相比有所升高,生物蝶呤水平有所降低。表l健康人尿样

13、的分析结果(疗=6Table 1The anaIyticaI IesuIts of urine sampIesfr咖healthy people(n=69O.428±O.023O.018±O.010O.261±O.006ND 102.559士O.0721.519±O.026O.679土O.059ND 112.050±O.0571.656ND ND 122.570士O.0142.375±O.021ND ND 13O.399士O.050O.114±O.005O.082ND 143.49l士O.0161.059士O.027O.61

14、4±O.008ND表3癌症病人尿样的分析结果(捍=6TabJe 31'he anaIytical r鹤ults of urjnes棚pl器from啪cerpatients(一=6SampleNeopterin (弘g/mLBiopterin(“g/mLPterin(“g/mLSepiapterin(pg/mL203.297土O.036O.323O.110NDa:j±s;b:not detected.23D D D D D N N N N N 1558271O 25O O O O O O O O O O ±士士±士 2ooO317354O 44O

15、36O O OO O 196051O 552O O O O 0O OO O O一 士±土士71O7444625422963O 0O O 66696O 3132O 4O O O OO OO O 土士±士±5O 71619878O 235433O 3356789il l第1期 崔盼盼等:高效液相色谱一荧光检测法同时测定人体尿液中的多种蝶呤类化合物 第27卷表4普通病人及癌症病人信息rable 4InfOmati伽0f Ordinary patien协and cancer patientsSample Status Sex Age SampIe Status Sex A

16、ge9fracture female 7915coloncancer male 4810fracture male 6916gastriccancer male 6511fracture male 817skincancer male7612common cold male 2418gastric cancer male 5313con吼on cold female 3419cell cancer male 6314common cold female 2220lungcancer female 592.5回收率与精密度试验取8号健康人及18号癌症病人尿样进行加标回收实验,分别添加三个不同水平

17、的蝶呤、新蝶呤、生物 蝶呤和墨蝶呤的标准溶液,每个水平均测定5次,结果见表5和表6。四种蝶呤类化合物的平均回收率在 84.8%120.o%之间,相对标准偏差(RSD小于7.34%。表明本法测定结果准确可靠。表5健康人尿样加标回收(n=5TabIe 5Recovery of the urine sample fr哪heaIthy pe叩le(n=53结论本文系统地探讨了人体尿液中的蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤和墨蝶呤的液相色谱分离分析条件,研究了 24第1期 分析科学学报 第27卷尿样的前处理方法,在此基础上,建立了人体尿液中四种蝶呤类化合物同时检测的新方法,并应用于癌症 病人、普通病人和健康人尿样分

18、析,取得了满意的效果。结果表明,方法快速、简单、准确,能满足实际样品 分析要求,为进一步探索蝶呤类化合物与某些癌症的关联性奠定了方法学基础。参考文献:1GU0Lan(郭岚,LIA0Kun(廖 坤,wAN Y卜qun(万益群.J0urnal of Amlytical science(分析科学学报J,2 345 67 8 9 2005,2l(6:661.Flaval】E A,Crone E M,Moore G A,Gieseg S P.Journal of Chromatography BJ,2008,863(1:167.Melichar B,S01ichova D,Melicharova K,M

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22、ve been detemlined by high performance 1iquid chromatography (HPU二fluorescence detection The urine was oxidized by 12一KI under aci dic condition for 30min and mixed with ascorbic acid,then the sample was diluted 5times,filtered by O.45“m membrane and analyzed by HPLCI-fluorescence detection. The chromatographic column was Diamonsil c18'the mobile phase was H2OCH30H(90:10,y/V,the flow rate was 1.0mL/min,the excitation and emission waVelengths were 360nm and 445nm,respectively. The linear ranges of neopterin,biopterin,pterin and sepiapterin were O.0051.5弘g/mL,O.052.0pg/mL,